Summary
癌症干细胞的存在与放射治疗后复发或不良结果有关。本手稿描述了研究肺癌细胞系中癌症干细胞的放射敏感性的方法。
Abstract
癌症干细胞（CSCs）的存在与放射治疗后复发或不良结果有关。研究耐辐射CSC可以为克服无线电电阻提供线索。电压封闭钙通道[2]1亚单位等分形式5被报告为非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中耐辐射CSC的标记物。以钙通道+2+1亚单位为例，提出了NSCLC细胞系中CSC对辐射敏感性的研究方法。CSC按流动细胞测定用假定标记排序，通过球形形成测定评估被分类细胞的自更新能力。殖民地形成测定，确定有多少细胞失去产生后代形成菌落的能力后，一定剂量的辐射，然后进行评估已分的细胞的辐射敏感性。本手稿提供了研究CSC的辐射敏感性的初步步骤，为进一步了解基本机制奠定了基础。
Introduction
放射治疗在癌症治疗中起着重要的作用。然而，放射性抗癌干细胞（CSCs）的存在可能导致放射治疗1、2后复发或不良结果。CSC的特点是其自我更新能力和产生异源性癌细胞的能力3。具有更有效的DNA损伤修复能力或更高水平的自由基清除系统或其他机制的装甲，CSC相对耐放射治疗4，5，6，7,8.识别CSC标记并探索其机制将有助于开发能够克服放射性阻力而不增加正常组织损伤的药物。
电压封闭钙通道[2]1亚单位等分形式5已报告为NSCLC细胞系9中耐辐射CSC的标记。#2_1 最初被确定为肝细胞癌 （HCC）10的 CSC 标记。使用从同一患者的原发性肿瘤和复发性肿瘤中提取的一对HCC细胞系进行减法免疫，鉴定出一种名为1B50-1的抗体，专门针对复发性HCC细胞。1B50-1阳性细胞在体外表现出较高的球形形成效率和体内的高肿瘤原性。其抗原通过质谱鉴定，为钙通道[2]1亚单位等分形式5。_2_1 在CSC中具体表达，在大多数正常组织中无法检测到，使其成为针对CSC10的潜在候选者。#2_1 也可以作为 NSCLC 细胞系的 CSC 标记，并且通过提高 DNA 损伤修复效率来部分向 NSCLC 细胞提供放射性电阻，以响应辐射9。
研究耐辐射CSC可以为克服无线电电阻提供线索。以NSCLC中的β2+1为例，提出了研究CSC辐射敏感性的主要方法。通常，CSC用假定表面标记分离，并比较阳性和阴性细胞群的干细胞特征和放射敏感性。无血清培养基的球形形成，辅以支持自我更新的生长因子，是评估体外细胞干细胞的有益测定。高球形形成能力的细胞在注射到免疫缺陷小鼠10、11、12中时，很可能表现出高肿瘤原性。然后，利用殖民地形成测定来评估细胞的辐射敏感性，从而确定有多少细胞在辐射13后失去了产生形成菌落的后代的能力。
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Protocol
注：步骤在指示温度下执行。对于未提及温度的步骤，在室温 （18-25 °C） 下执行。细胞培养基应储存在4°C，其他试剂应根据制造商的指南储存。在加入细胞之前，培养基应预加热至37°C。
1. 细胞排序
- 抗体结合
注：考虑到潜伏时间较短，直接标记抗体是细胞分拣的首选。如果没有商业直接标记的抗体，请使用荧光成因结合试剂，根据制造商指南将抗体与荧光染料结合（参见材料表）。由于细胞在分拣后将培养，所有步骤都应在生物安全柜或层状清洁工作台上执行。为了避免污染，建议在分类后将抗生素（青霉素和链霉素）添加到培养基中。- 为要标记的每10μL抗体添加1μL的改性剂试剂。轻轻混合。
- 将抗体和修饰剂的混合物直接添加到冻干氟辛上。轻轻移管。让小瓶在黑暗中保持3小时或过夜室温（RT）。
- 每10μL抗体添加1μL的quencher试剂。偶联体可在 30 分钟后使用。荧光素偶联可在4°C下储存长达18个月。
- 在分拣之前，建议对偶联抗体进行滴定。准备表达的细胞（例如，H1299 或 A549 表示 +2+1），并且不表示（例如 H1975）标记。将细胞与不同浓度的抗体（例如，15 μg/mL、7.5 μg/mL、1.5 μg/mL 和0.75 μg/mL）进行杀育。
- 执行流式细胞分析（使用直方图或点图），并选择H1299或A549的正细胞可以从等型对照分离的浓度，而H1975细胞几乎没有非特异性信号。
- 单元格标记
- RPMI 1640培养基中的培养A549细胞在37°C的10厘米培养皿中辅以10%胎儿牛血清（FBS），在细胞培养箱中补充5%CO2。消化细胞，当它们达到80%~90%汇合时（每盘约5~10 x 106个细胞），进行分拣。
- 删除培养基。用3 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）短暂清洗细胞。在每个菜中加入3 mL 0.05%的胰蛋白酶。取出胰蛋白酶，让余量胰蛋白酶在37°C下消化细胞1-3分钟。
注： 某些细胞系可能相对难以消化，例如 NSCLC 细胞系 H520 和 PC9。在这种情况下，3 mL的胰蛋白酶可以留在菜中，而不是用剩余胰蛋白酶消化。此外，消化时间可以延长。 - 当细胞松动并开始从培养皿中分离时，加入3 mL的RPMI 1640介质，辅以10%FBS，并将细胞悬浮液移入50 mL管中。
- 在4°C下300 x g下离心5分钟，丢弃上清液。加入10 mL的PBS来重新悬浮细胞。将 0.5 mL（或至少 5 x 105细胞）的细胞悬浮液作为等型控制转移到新管中。其余单元格用于排序。
- 在4°C下以300 x g将控制管和实验管离心5分钟。丢弃上清液。
- 通过将荧光染料偶联等型控制或PBS中的抗体稀释至上述最佳浓度，制备用于染色的工作溶液。
注：在本实验中，FITC结合的1B50-1（β2+1的抗体）被稀释到7.5微克/mL中。工作溶液的体积取决于细胞量。 - 以约2⁄5 x 107细胞/mL将每个工作溶液的对照和实验单元重新悬浮，并轻轻混合。在黑暗中在RT孵育样品30~40分钟。
- 在样品中加入10 mL的PBS，在4°C下轻轻混合和离心300 x g，5分钟，将上清液丢弃。用 10 mL 的 PBS 重新悬浮细胞。
- 将40μm细胞过滤器分别放入新的50 mL管上，用于控制和实验细胞。将细胞悬浮液涂抹在滤网上并收集流过。
注： 此步骤将移除可能阻塞细胞分拣机毛细管的细胞团块。 - 在4°C下以300 x g将流过，5分钟。丢弃上清液。用0.2~1.0 mL PBS重新悬浮细胞，然后转移到5 mL管中进行流式细胞测定。
- 按流式细胞测定的细胞分类
- 准备两个5 mL管，以收集正细胞和阴性细胞群。在每个管中加入 1 mL 的 RPMI 1640 介质。将管放在单元分拣机的收集平台。
- 使用点图分别分析控制单元和实验单元。使用参数向前散射 （FSC） 和侧散射 （SSC） 对活细胞进行门控。根据FL-1强度对活细胞的正负群进行门分。
- 收集β2+1阳性细胞和β2+1阴性细胞。记录获取的单元格数。
- 为了确认收获的细胞群具有不同水平的β2+1表达，可以进行定量聚合酶链反应（QPCR）。
- 提取正阴性细胞的RNA，使用二恶极酸酯试剂，并根据制造商指南将RNA逆转录入cDNA。使用 SYBR 绿色试剂执行 QPCR。引体序列如下：#2_1-F，CAGTTGAGATGGATGG; #2_1-R，TTGTATGAGCAGTGTGTGTC;GAPDH-F，GTCGGGAACGGGGGG;和GAPDH-R，AAAAGCAGCCCTGGACC。
2. 球形测定
注：球形形成测定用于确定细胞的自我更新能力。具有自我更新能力的细胞可以在这种无血清半固体介质中形成球体，并辅以生长因子。所有步骤应在生物安全柜或层清洁工作台上执行。为了避免污染，建议在分类后将抗生素（青霉素和链霉素）添加到培养基中。
- 中等准备
- 通过将 1 L 包装的 DMEM/F-12 粉末重组成 475 mL 的蒸馏水，制备 2x DMEM/F-12 介质。添加 2.438 克 NaHCO3。通过缓慢添加 1 N NaOH 或 1 N HCl 搅拌，将 pHH 调节到 7.0~7.2。将蒸馏水加入 500 mL 的最终体积。通过 0.2 μm 滤波器过滤，对介质进行消毒。
- 在100 mL蒸馏水中加入2克甲基纤维素溶液，制备2%的甲基纤维素溶液。高压灭菌解决方案。高压灭菌后，甲基纤维素可能表现出棉花状状态。将瓶子上下轻轻倒转几次，然后让它自然冷却，将其混合。一夜之间，它将成为一个透明的半固体。
- 要获得 20 mL 的自更新介质，将 10 mL 的 2x DMEM/F-12 介质添加到 50 mL 管中。向介质中加入 400 μL 的 B27。将重组的人类表皮生长因子（EGF）添加到25纳克/mL的最终浓度中。将重组人类基本成纤维细胞生长因子（bFGF）添加到25纳克/mL的最终浓度中。加入2%的甲基纤维素，最终体积达到20 mL。
- 通过涡旋混合介质，从而获得自我更新介质。
- 细胞播种
- 将收获的细胞转移到自更新培养基中，达到2000个细胞/mL，并将其与短暂的涡旋混合。在超低附件 96 孔板的每个孔中添加 100 μL 的电池悬浮液。请勿使用板边缘的井，因为介质更有可能在这些井中蒸发。在这些井中加入消毒水。
- 在细胞培养箱中培养37°C，CO2为5%，培养10~14天。在第5天至7天添加50μL的自我更新介质。
- 球数和计算
- 播种后10-14天，在显微镜下计算超过50个细胞（大约）或直径超过100μm（4倍物镜，10倍目镜）的球体数量。
注：从井的左上角开始，用显微镜的操纵杆水平地将目标表向右移动，对球体进行计数。然后，将目标表移动到可视字段的中间行，并从右向左计算球体。然后，移动到下一行，从左到右计数。96孔板的井可以在三行内计数。 - 计算球体形成效率，以球体数除以种子的细胞数计算。比较正细胞群和负细胞群之间的球形形成效率。
- 播种后10-14天，在显微镜下计算超过50个细胞（大约）或直径超过100μm（4倍物镜，10倍目镜）的球体数量。
3. 殖民地形成测定
注：利用菌群形成测定来确定细胞的辐射敏感性。辐射可以通过用于放射治疗的直线加速器提供。如果设备可用，也可以使用实验室使用的细胞辐照系统。步骤 3.1、3.2.3 和 3.2.6 应在生物安全柜或层清洁工作台上执行。为了避免污染，建议在分类后将抗生素（青霉素和链霉素）添加到培养基中。
- 细胞播种
- 为每个辐射剂量（包括 0 Gy 组）准备一个 6 孔板。将1.5 mL的介质添加到6个井板的每口井中。菌落形成测定的培养介质是传统的RPMI 1640介质，辅以10%FBS（命名为"完成1640"）。
- 具有已完成的 1640 个中等到 1000 个细胞/mL 的稀释收获细胞。
- 向井中添加细胞悬浮液。水平摇动板，使细胞均匀分布在井中。记录每个剂量组中添加的体积。
注：一般来说，每口200个细胞为0 Gy，200个细胞为2Gy，400个细胞为4Gy，800个细胞为6Gy，1600个细胞为8Gy。最好在实验前调整未排序细胞中的细胞数。 - 在细胞培养箱中培养37°C，CO2为5%。
- 辐射
- 细胞附着在井底后（通常在播种后一天，不建议延长时间考虑细胞增殖），继续执行细胞辐射。
- 在 20 厘米 x 20 厘米辐射场中，计算深度为 1 厘米的每个剂量的监测单位 （MU） 数量。
注：深度的辐射场/百分比深度剂量（PDD）的MU =剂量（cGy）/输出因子数。例如，20 厘米 x 20 厘米字段的输出因子为 1.066，1.0 厘米的 PDD 为 0.987，8 Gy （800 cGy） 的 MU 数为 760 （800/1.066/0.987 = 760.35）。如果每个剂量需要辐射多个板，也可以使用更大的字段，并且需要根据字段的大小重新计算 MU 的数量。输出因子和 PDD 在不同的加速器中有所不同。有关这些参数，请参阅辐射物理学家。 - 在每个井中添加已完成的 1640，达到介质高度的 1 厘米。
注：可在制造商指南中找到6孔板的细胞生长面积。例如，如果6个井板每口井的生长面积为9.5 cm 2，前一天又增加了1.5 mL的中压和0.4 mL的细胞悬浮液，那么在井中加入7.6 mL的介质。剂量累积需要高度。不建议中等高度小于 0.8 厘米。
注：在辐射期间保持板盖。当板在细胞培养室和放射治疗室之间转移时，用铝箔包裹板或将它们放在一个干净的盒子里，以避免污染。将板保持平整，以避免介质溢出。 - 设置 20 厘米 x 20 厘米辐射场。在治疗沙发上放置厚度为1.0厘米的组织等价的博鲁斯，并将6孔板放在博鲁斯上，以保持其接触。确保整个板在辐射场内。将源皮肤距离设置为 100 cm。通过调整治疗沙发的高度，将中等表面水平与激光水平对齐。
注：具有相同辐射剂量的板可以同时辐射。在这种情况下，需要更大的辐射场，并且应根据相应的输出因子重新计算 MU 的数量。确保所有板都在辐射场内。 - 按顺序将每个分配的剂量输送到每个板。
注意：直线加速器只能由合格的技术人员操作。远离辐射。 - 把盘子带回细胞培养室。更换介质，每口井的完成介质为 2 mL。在细胞培养箱中培养37°C，CO2为5%。每 3⁄5 天更换一次介质。
- 染色
- 辐射后7-10天，当许多菌落形成之前，它们变得太大并合并在一起，然后执行染色和计数，如下所示。取出介质，用 PBS 短暂清洗。在每个井中加入1mL4%的甲醛，以修复细胞。
注意：甲醛是挥发性的。在烟罩中使用甲醛。 - 固定10分钟后，去除甲醛，每井用2mL蒸馏水洗涤两次。
- 在每个井中加入 1 mL 的 1% 水晶紫罗兰染色溶液。染色10分钟，去除水晶紫罗兰染色溶液，用蒸馏水洗涤3次。取下水并擦干板。
- 辐射后7-10天，当许多菌落形成之前，它们变得太大并合并在一起，然后执行染色和计数，如下所示。取出介质，用 PBS 短暂清洗。在每个井中加入1mL4%的甲醛，以修复细胞。
- 殖民地计数和计算
- 计算超过 50 个细胞的菌落数。不包括细胞少于50个的小菌落。在显微镜下检查菌落，了解由50个细胞组成的殖民地，并在板的底部用记号笔标记它。
注：拍摄油井并使用软件 ImageJ 将促进计数过程。 - 计算菌落形成效率，以除以种子细胞数的菌落数计算。计算生存分数作为菌群形成效率在一定的照射剂量除以0Gy的菌群形成效率。
- 使用剂量作为x轴和生存分数作为y轴，可以得到生存曲线。比较正细胞群和负细胞群之间的生存曲线。
- 计算超过 50 个细胞的菌落数。不包括细胞少于50个的小菌落。在显微镜下检查菌落，了解由50个细胞组成的殖民地，并在板的底部用记号笔标记它。
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Representative Results
对2+1高和±2+1低A549细胞进行了排序（图1A）。某些标记可能显示不同的群体，并且易于接近。然而，一些标记只显示高和低表达模式，而不是明显的正负群体。在此情况下，等型控件对于门控非常重要。qPCR验证了已排序细胞中β2+1的表达。CACNA2D1，编码β2+1的基因，在排序的β2+1高细胞中比β2+1低细胞的表达更高（图1B）。
球体的典型形态如图2A所示。球的形成效率以±2+1-高和+2+1-低单元计算（图2B）。±2+1高细胞具有较高的球体形成效率，表明其自我更新能力较高。细胞菌落的典型图像如图3A所示。具有大约50个细胞的菌群可以在显微镜下被检查，并标记为参考。可以计算每个剂量的存活率，生存曲线如图3B所示。*2+1高细胞对辐射具有相对的抵抗力，而β2+1-低细胞则具有较强的抗辐射能力。
进行未配对的双面学生t测试以评估组之间的显著性。p < 0.05 的值被认为具有统计显著性。数据用均值和标准差 （SD） 表示。介绍了至少三个具有类似结果的生物独立实验的代表性数据。
图1：对A549中的β2+1高和±2+1低细胞进行排序。（A）对β2_1表达的代表性流式细胞学分析。单元格基于等型控件进行封闭。（B） QPCR确认高和低种群中的β2+1表达。误差条表示SD。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：[2]1-高和+2+1低A549细胞的球形测定。（A）由排序的 ±2+1-高和±2+1低细胞（棒 = 200 μm）形成的球体的代表性形态。 （B）[2]1-高和+2+1低细胞的球形形成效率。误差条表示 SD （_p < 0.001）。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：β2+1-高和+2+1低A549细胞的菌群形成测定。（A）由排序的β2+1-高和β2+1低细胞形成的菌落的代表性图像。 （B）β2+1-高和β2+1低细胞的生存曲线。种子细胞的数量为0 Gy每井200个细胞，4 Gy每井400个细胞，8Gy800个细胞。误差条表示 SD （\p < 0.05， #p < 0.001）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议描述了研究体外癌细胞系中CSCs的放射性敏感性的方法。在本研究中，在NSCLC细胞系中，β2+1的表达是连续的。因此，门控基于等型控件。在分拣之前，应通过流式细胞测定在多个细胞系中检查β2+1表达，并通过QPCR或西方斑点验证。建议通过流式细胞测定、在荧光显微镜下观察荧光或QPCR（排序后），重新分析已排序的β2+1和β2+1低细胞的表达。
球形形成测定是评价自我更新能力的一种简单方法，可用于初步描述假定的CSC。该方法已用于培养神经球或乳腺球体，以表征胶质瘤或乳腺癌细胞中的干细胞，并修改该公式以培养其他类型的癌症4，6，10。EGF和bFGF可以支持无血清培养基干细胞的自我更新;然而，基本的介质和生长因子可能不同培养不同的细胞类型。半固体介质用于固定细胞，以便球体通过细胞增殖而不是聚类形成。实验采用超低附着板维持球体形态。此外，由于球体培养后CSC的丰富，当球体被收集、消化和播种为次生球形成时，球的形成效率在随后的序列传播9、10中可能会增加。对CSC进行特征化的一个更严格的标准是在体内限制稀释测定，其中一系列分类的阳性和阴性细胞被分皮注射到免疫缺陷小鼠中，然后肿瘤细胞在阳性和负细胞群计算10，14。如果通过球形形成测定鉴定了假定的癌症干细胞标记，则建议通过体内限制稀释测定进一步表征。
本研究对CSC的辐射敏感性进行了评价。殖民地形成测定是评估辐射敏感性的经典方法。在重要的平行井中播种相同数量的细胞。将每 mL 的电池数调整到适当的范围内，以确保添加到每个孔中的电池悬浮量超过 100 μL。如果卷太小，则错误可能会增加。对于细胞辐射，为剂量积累添加1厘米高度的介质，并在板下放置一个组织等效的bolus，用于剂量反向散射。建议研究人员参考辐射物理学家和技术人员来建立细胞辐射模型并计算剂量。
本手稿提供了 CSC 的辐射敏感性研究的最初几个步骤。进一步的机制研究可能涉及与DNA损伤修复、活性氧物种清除、细胞周期阻扣等相关的蛋白质。这些实验需要大量的细胞;因此，许多细胞的菜肴需要准备。CSC基因的过度表达或敲除/敲除也提供了CSC如何获得放射性抗性的重要见解。
这些方法可能用于识别癌症组织中的 CSC。张等人介绍说，从NSCLC手术样本12中分离出CD166阳性Lin阴性细胞。组织用无菌刀片切碎，用酶鸡尾酒消化。通过细胞过滤器收集的细胞被标记为分拣，然后以球形形成测定和体内限制稀释测定为特征。对于#2_1作为CSC标记，它已被报告分离CSC在肝细胞癌手术组织和小细胞肺癌患者衍生的异种移植组织10，16 。考虑到分析需要大量细胞，在活检或循环肿瘤细胞中分离CSC相对比较困难。或者，染色的活检部分可能为CSC在肿瘤中的存在提供线索。然而，这种推定应用需要在患者组织和临床数据中进行评估。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（81402535和81672969）和国家重点研究开发项目（2016YFC0904703）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
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