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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Strahlenempfindlichkeit von Krebsstammzellen in Lungenkrebszelllinien

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60046
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research (Ministry of Education/Beijing), Department of Radiation Oncology, Peking University Cancer Hospital and Institute

Summary

Das Vorhandensein von Krebsstammzellen wurde mit Rückfällen oder schlechten Ergebnissen nach der Strahlentherapie in Verbindung gebracht. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von Krebsstammzellen in Lungenkrebszelllinien.

Abstract

Das Vorhandensein von Krebsstammzellen (CSCs) wurde mit Rückfällen oder schlechten Ergebnissen nach der Strahlentherapie in Verbindung gebracht. Das Studium radioresistenter CSCs kann Hinweise auf die Überwindung der Funkresistenz liefern. Spannungsgegated Calcium Channel 2 -1 Untereinheit Isoform 5 wurde als Marker für radioresistente CSCs in nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinien (NSCLC) gemeldet. Anhand der Kalziumkanal-Untereinheit 2 1 als Beispiel für einen CSC-Marker werden Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs in NSCLC-Zelllinien vorgestellt. CSCs werden mit vermeintlichen Markern nach Durchflusszytometrie sortiert, und die Selbsterneuerungskapazität sortierter Zellen wird durch Kugelbildungstest ausgewertet. Der Koloniebildungstest, der bestimmt, wie viele Zellen die Fähigkeit verlieren, Nachkommen zu erzeugen, die die Kolonie nach einer bestimmten Dosis Strahlung bilden, wird dann durchgeführt, um die Radioempfindlichkeit sortierter Zellen zu bewerten. Dieses Manuskript enthält erste Schritte zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs, die die Grundlage für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen schafft.

Introduction

Die Strahlentherapie spielt eine wichtige Rolle bei der Krebsbehandlung. Die Existenz von radioresistenten Krebsstammzellen (CSCs) kann jedoch nach der Strahlentherapie1,2zu rückfall- oder schlechten Ergebnissen führen. CSCs zeichnen sich durch ihre Selbsterneuerungsfähigkeit und ihre Fähigkeit aus, heterogene Krebszellen zu erzeugen3. Gepanzert mit einer effizienteren DNA-Schadensreparaturkapazität oder höheren Ebenen von Frei-Radikal-Aufräumsystemen oder anderen Mechanismen, CSCs sind relativ resistent gegen Strahlentherapie4,5,6,7 , 8. Die Identifizierung von CSC-Markern und die Erforschung ihrer Mechanismen wird die Entwicklung von Medikamenten erleichtern, die die Radioresistenz überwinden, ohne normale Gewebeschäden zu erhöhen.

Spannungsgegated Calcium-Kanal 2 - 1 Untereinheit Isoform 5 wurde als Marker für radioresistente CSCs in NSCLC-Zelllinien9berichtet. Ursprünglich wurde der CSC-Marker für das hepatozelluläre Karzinom (HCC)10als CSC-Marker identifiziert. Mit subtraktiver Immunisierung mit einem Paar HCC-Zelllinien, die von den primären und rezidivierenden Tumoren bei demselben Patienten abgeleitet wurden, wurde ein Antikörper namens 1B50-1 identifiziert, der speziell auf rezidivierende HCC-Zellen abzielen sollte. 1B50-1-positive Zellen zeigten eine hohe Kugelbildungseffizienz in vitro und eine hohe Tumorigenizität in vivo. Sein Antigen wurde durch Massenspektrometrie identifiziert, als Calciumkanal 2 -1 Untereinheit Isoform 5. Die s21 drückt sich speziell in CSCs aus und ist in den meisten normalen Geweben nicht nachweisbar, was sie zu einem potenziellen Kandidaten für die Ausrichtung auf CSCs10macht. Es hat sich gezeigt, dass nSCLC-Zellen teilweise Radioresistenz gegen NSCLC-Zellen ausstrahlt, indem die Effizienz der REPARATUR von DNA-Schäden als Reaktion auf Strahlung9verbessert wird.

Das Studium radioresistenter CSCs kann Hinweise auf die Überwindung der Funkresistenz liefern. Am Beispiel von NSCLC werden wichtige Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs vorgestellt. In der Regel werden CSCs mit einem vermeintlichen Oberflächenmarker isoliert, und die Stammzelleigenschaften und die Radiosensitivität der positiven und negativen Zellpopulationen werden verglichen. Die Kugelbildung in einem serumfreien Medium, ergänzt durch Wachstumsfaktoren, die die Selbsterneuerung unterstützen, ist ein nützlicher Test, um die Stammfähigkeit von Zellen in vitro zu bewerten. Zellen mit hoher Kugelbildungskapazität zeigen wahrscheinlich eine hohe Tumorigenität, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizide Mäuse10,11,12injiziert werden. Koloniebildung Assay wird dann verwendet, um die Radiosensitivität von Zellen zu bewerten, die bestimmt, wie viele die Fähigkeit verloren haben, Nachkommen zu erzeugen, die die Kolonie nach einer Dosis von Strahlungbilden 13.

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Protocol

HINWEIS: Die Schritte werden unter der angegebenen Temperatur durchgeführt. Für Schritte, in denen die Temperatur nicht erwähnt wird, führen Sie unter Raumtemperatur (18–25 °C) aus. Das Zellkulturmedium sollte bei 4 °C gelagert werden, und andere Reagenzien sollten gemäß den Anleitungen des Herstellers gelagert werden. Medium sollte auf 37 °C vorgewärmt werden, bevor es den Zellen zugesetzt wird.

1. Zellsortierung

  1. Antikörperkonjugation
    HINWEIS: Unter Berücksichtigung der kürzeren Inkubationszeit wird ein direkt beschrifteter Antikörper für die Zellsortierung bevorzugt. Wenn kein kommerzieller, direkt gekennzeichneter Antikörper verfügbar ist, verwenden Sie fluoresceinkonjugating Reagenzien, um den Antikörper gemäß der Anleitung des Herstellers zu einem Fluoreszenzfarbstoff zu konjugieren (siehe Tabelle der Materialien). Da die Zellen nach dem Sortieren kultiviert werden, sollten alle Schritte in einem biologischen Sicherheitsschrank oder einer laminaren sauberen Bank durchgeführt werden. Um eine Kontamination zu vermeiden, werden Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) empfohlen, dem Kulturmedium nach der Sortierung zuzugeführt zu werden.
    1. Fügen Sie für jeden zu beschriftenden Antikörper 1 L Modifikator-Reagenz hinzu. Mischen Sie sanft.
    2. Fügen Sie die Mischung aus Antikörper und Modifikator direkt auf das lyophilisierte Fluorescein. Pipetten Sie sanft. Lassen Sie die Durchstechflasche für 3 h stehen oder über Nacht bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln.
    3. Fügen Sie für jeden 10-L-Antikörper 1 L Quencher-Reagenz hinzu. Das Konjugat kann nach 30 min verwendet werden. Das Fluorescein-Konjugat kann bis zu 18 Monate bei 4 °C gelagert werden.
    4. Vor dem Sortieren wird die Titration von konjugierten Antikörpern empfohlen. Bereiten Sie Zellen vor, die (z. B. H1299 oder A549 für 2 ,1) und nicht den Marker ausdrücken (z. B. H1975). Aliquot die Zellen und inkubieren Sie sie mit Antikörpern in unterschiedlichen Konzentrationen (z. B. 15 g/ml, 7,5 g/ml, 1,5 g/ml bzw. 0,75 g/ml).
    5. Führen Sie eine zytometrische Flussanalyse (mit Histogramm oder Punktdiagramm) durch und wählen Sie die Konzentration aus, bei der positive Zellen von H1299 oder A549 von der Isotypsteuerung getrennt werden können und H1975-Zellen wenig unspezifische Signale aufweisen.
  2. Zellbeschriftung
    1. Kultur A549 Zellen in RPMI 1640 medium ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) in 10 cm Schalen bei 37 °C und 5% CO2 in einem Zellkultur-Inkubator. Verdauen Sie Zellen wie folgt für die Sortierung, wenn sie 80%–90% Zusammenfluss erreichen (ca. 5–10 x 106 Zellen pro Schale).
    2. Entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie Zellen mit 3 ml Phosphat gepufferte Saline (PBS) kurz. Fügen Sie 3 ml 0,05% Trypsin zu jedem Gericht hinzu. Entfernen Sie das Trypsin und lassen Sie das residuäre Trypsin, um Zellen bei 37 °C für 1-3 min zu verdauen. Überprüfen Sie die Ablösung der Zellen häufig, um eine Überverdauung zu vermeiden.
      HINWEIS: Einige Zelllinien sind möglicherweise relativ schwer zu verdauen, z. B. die NSCLC-Zelllinien H520 und PC9. In einer solchen Situation können 3 ml Trypsin in der Schale gelassen werden, anstatt mit residuary Trypsin zu verdauen. Darüber hinaus kann die Verdauungszeit verlängert werden.
    3. Wenn Zellen sich lösen und beginnen, sich von den Schalen zu lösen, fügen Sie 3 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS, hinzu und pipette die Zellsuspension in ein 50 ml Rohr.
    4. Zentrifuge bei 300 x g bei 4 °C für 5 min. Den Überstand entsorgen. Fügen Sie 10 ml PBS hinzu, um die Zellen erneut auszusetzen. Übertragen Sie 0,5 ml (oder mindestens 5 x 105 Zellen) der Zellsuspension in ein neues Rohr als Isotypkontrolle. Die verbleibenden Zellen sind zum Sortieren vorgesehen.
    5. Zentrifugieren Sie sowohl die Steuer- als auch die Versuchsröhrchen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
    6. Bereiten Sie die Arbeitslösung für die Färbung vor, indem Sie die fluoreszierende farbkonjugierte Isotypkontrolle oder den Antikörper in PBS auf die oben genannte optimale Konzentration verdünnen.
      ANMERKUNG: In diesem Experiment wurde FITC-konjugierte 1B50-1 (der Antikörper von 2,1) in 7,5 g/ml verdünnt. Das Volumen der Arbeitslösung hängt von der Zellmenge ab.
    7. Setzen Sie die Kontroll- und Versuchszellen mit jeder Arbeitslösung bei etwa 2–5 x 107 Zellen/ml aus und mischen Sie sie sanft. Inkubieren Sie die Proben bei RT für 30-40 min im Dunkeln.
    8. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 ml PBS zu den Proben hinzufügen, sanft mischen und Zentrifugen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min mischen. Resuspend Zellen mit 10 ml PBS.
    9. Legen Sie 40 m Zellsiebe auf neue 50 ml-Röhren für Kontroll- bzw. Versuchszellen. Tragen Sie die Zellsuspension auf das Sieb auf und sammeln Sie den Durchfluss.
      HINWEIS: Mit diesem Schritt werden die Zellklumpen entfernt, die die Kapillare des Zellsortierers blockieren können.
    10. Zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 300 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen mit 0,2–1,0 ml PBS wieder auf und übertragen Sie sie dann in ein 5 ml-Rohr für die Durchflusszytometrie.
  3. Zellsortierung nach Durchflusszytometrie
    1. Bereiten Sie zwei 5 ml-Röhren vor, um die positiven und negativen Zellpopulationen zu sammeln. Fügen Sie 1 ml RPMI 1640 medium in jedem Rohr hinzu. Platzieren Sie die Rohre auf der Sammelplattform des Zellsortierers.
    2. Analysieren Sie die Kontrollzellen bzw. experimentellen Zellen mit dem Punktdiagramm. Gate die lebenden Zellen mit den Parametern Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC). Gate die positive und negative Population von lebenden Zellen nach der FL-1 Intensität.
    3. Sammeln Sie die -2-1-positiven Zellen und die -2-1-negativen Zellen. Notieren Sie die Anzahl der erhaltenen Zellen.
    4. Um zu bestätigen, dass die geernteten Zellpopulationen unterschiedliche Werte der Expression von 2 bis 1 haben, kann eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (QPCR) durchgeführt werden.
      1. Extrahieren Sie RNA von positiven und negativen Zellen mit Guanidinium-Thiocyanat-Reagenz und rektocieren Sie die RNA in cDNA gemäß dem Leitfaden des Herstellers. Führen Sie QPCR mit sYBR-Grünreagenz durch. Die Sequenzen der Primer sind wie folgt: 2 -F,CAGTTGAGATGGAGGATGATG; Nr. 2-R, TTGTATGAGCAGTGTGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.

2. Kugelformationstest

HINWEIS: Der Kugelbildungstest wird angewendet, um die Selbsterneuerungskapazität von Zellen zu bestimmen. Zellen mit Selbsterneuerungskapazität könnten in diesem serumfreien halbfesten Medium Sphären bilden, die durch Wachstumsfaktoren ergänzt werden. Alle Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank oder einer laminaren sauberen Bank durchgeführt werden. Um eine Kontamination zu vermeiden, werden Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) empfohlen, dem Kulturmedium nach der Sortierung zuzugeführt zu werden.

  1. Mittlere Vorbereitung
    1. 2x DMEM/F-12 medium vorbereiten, indem Sie eine 1 L Packung DMEM/F-12 Pulver in 475 ml destilliertes Wasser umstellen. 2.438 g NaHCO3hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.0–7.2 ein, indem Sie langsam 1 N NaOH oder 1 N HCl unter Rühren hinzufügen. Destilliertes Wasser auf ein Endvolumen von 500 ml geben. Sterilisieren Sie das Medium durch Filterung durch einen 0,2 m Filter.
    2. Bereiten Sie eine 2% Methylcelluloselösung vor, indem Sie 2 g Methylcellulose in 100 ml destilliertes Wasser geben. Autoclave die Lösung. Die Methylcellulose kann nach dem Autoklavieren einen baumwollähnlichen Zustand aufweisen. Mischen Sie es, indem Sie die Flasche für einige Male sanft nach oben und unten umkehren und für eine natürliche Kühlung lassen. Es wird über Nacht zu einem transparenten Halbfest.
    3. Um 20 ml Selbsterneuerungsmedium zu erhalten, fügen Sie 10 ml 2x DMEM/F-12 medium auf ein 50 ml Rohr hinzu. Fügen Sie dem Medium 400 l B27 hinzu. Fügen Sie den rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) zu einer Endkonzentration von 25 ng/ml hinzu. Fügen Sie den rekombinanten menschlichen Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) zu einer Endkonzentration von 25 ng/ml hinzu. Fügen Sie 2% Methylcellulose hinzu, um ein Endvolumen von 20 ml zu erreichen.
    4. Mischen Sie das Medium durch Wirbel, so dass das Selbsterneuerungsmedium erhalten wird.
  2. Zellsaatierung
    1. Übertragen Sie die geernteten Zellen in das Selbsterneuerungsmedium, um 2000 Zellen/ml zu erreichen und mischen Sie sie mit einem kurzen Wirbel. Fügen Sie 100 l Zellsuspension zu jedem Brunnen einer ultra-niedrigen Befestigung 96 Well Platte. Verwenden Sie die Brunnen nicht am Rand der Platte, da das Medium eher in diesen Brunnen verdunstet. Fügen Sie sterilisiertes Wasser in diese Brunnen.
    2. Kultur bei 37 °C mit 5% CO2 im Zellkultur-Inkubator für 10–14 Tage. Fügen Sie an Tag 5–7 50 L Selbsterneuerungsmedium hinzu.
  3. Kugelzählung und -berechnung
    1. Zählen Sie 10–14 Tage nach der Aussaat die Anzahl der Kugeln mit mehr als 50 Zellen (ungefähr) oder mit einem Durchmesser von mehr als 100 m unter dem Mikroskop (4x Objektivlinse, 10x Okular).
      ANMERKUNG: Beginnend von der oberen linken Seite des Brunnens, zählen Sie die Kugeln, während Sie die Objektivtabelle horizontal nach rechts mit dem Joystick des Mikroskops bewegen. Verschieben Sie dann die Zieltabelle in die mittlere Zeile des Gesichtsfelds, und zählen Sie die Kugeln von rechts nach links. Wechseln Sie dann in die untere Zeile, und zählen Sie von links nach rechts. Ein Brunnen von 96 Brunnenplatte kann in drei Reihen gezählt werden.
    2. Berechnen Sie die Effizienz der Kugelbildung als anzahl der Kugeln dividiert durch die Anzahl der ausgesäten Zellen. Vergleichen Sie die Effizienz der Kugelbildung zwischen den positiven und negativen Zellpopulationen.

3. Koloniebildung Assay

HINWEIS: Der Koloniebildungstest wird angewendet, um die Radiosensitivität von Zellen zu bestimmen. Die Strahlung kann über einen Linearbeschleuniger für die Strahlentherapie abgegeben werden. Das Zellbestrahlungssystem für den Laboreinsatz kann auch verwendet werden, wenn das Gerät verfügbar ist. Die Schritte 3.1, 3.2.3 und 3.2.6 sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank oder einer laminaren reinigungsbank durchgeführt werden. Um eine Kontamination zu vermeiden, werden Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) empfohlen, dem Kulturmedium nach der Sortierung zuzugeführt zu werden.

  1. Zellsaatierung
    1. Bereiten Sie eine 6 Well-Platte für jede Strahlendosis einschließlich der 0 Gy Gruppe vor. Fügen Sie 1,5 ml Medium zu jedem Brunnen von 6 Well Platte. Kulturmedium für Koloniebildung assay ist das konventionelle RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS (benannt als "completed 1640").
    2. Verdünnung von geernteten Zellen mit abgeschlossenen 1640 mittleren bis 1000 Zellen/ml.
    3. Fügen Sie die Zellsuspension zu den Brunnen hinzu. Schütteln Sie die Platten horizontal, um Zellen gleichmäßig in den Brunnen verteilen zu lassen. Zeichnen Sie das in jeder Dosisgruppe hinzugefügte Volumen auf.
      HINWEIS: Im Allgemeinen Samen 200 Zellen pro Brunnen für 0 Gy, 200 Zellen für 2 Gy, 400 Zellen für 4 Gy, 800 Zellen für 6 Gy und 1600 Zellen für 8 Gy, beziehungsweise. Es ist besser, die Zellzahlen in unsortierten Zellen in Vorexperimenten anzupassen.
    4. Kultur bei 37 °C mit 5% CO2 im Zellkultur-Inkubator.
  2. strahlung
    1. Nachdem Zellen an der Unterseite der Brunnen befestigt haben (in der Regel einen Tag nach der Aussaat, und längere Zeit wird nicht empfohlen, unter Berücksichtigung der Zellproliferation), gehen Sie mit zelliger Strahlung.
    2. Berechnen Sie die Anzahl der Monitoreinheiten (MU) für jede Dosis in einer Tiefe von 1 cm in einem Strahlungsfeld von 20 cm x 20 cm.
      ANMERKUNG: Anzahl der MU = Dosis (cGy)/Output-Faktor für die Strahlenfeld/Prozenttiefendosis (PDD) für die Tiefe. Beispielsweise beträgt der Ausgabefaktor für ein Feld von 20 cm x 20 cm 1,066, PDD für 1,0 cm 0,987 und die Anzahl der MU für 8 Gy (800 cGy) 760 (800/1.066/0.987 = 760.35). Wenn für jede Dosis mehrere Platten abgestrahlt werden müssen, kann auch ein größeres Feld verwendet werden, und die Anzahl der MU muss entsprechend der Größe des Feldes neu berechnet werden. Ausgabefaktor und PDD unterscheiden sich in verschiedenen Beschleunigern. Beziehen Sie sich auf Strahlenphysiker für diese Parameter.
    3. Fügen Sie abgeschlossene 1640 zu jedem Brunnen, um 1 cm für die Höhe des Mediums zu erreichen.
      HINWEIS: Der Zellwachstumsbereich von 6 Wellplatten finden Sie auf der Anleitung des Herstellers. Wenn z. B. der Wachstumsbereich 9,5 cm2 für jeden Brunnen von 6 Well-Platte beträgt und am Vortag 1,5 ml mittlere und 0,4 ml Zellsuspension hinzugefügt wurden, dann fügen Sie dem Brunnen 7,6 ml Medium hinzu. Die Höhe wird für den Dosisaufbau benötigt. Eine mittlere Höhe von weniger als 0,8 cm wird nicht empfohlen.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Platten während der Strahlung auf. Wenn die Platten zwischen Zellkulturraum und Strahlentherapieraum übertragen werden, wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie oder legen Sie sie in eine saubere Box, um Verunreinigungen zu vermeiden. Halten Sie die Platten flach, um ein Austreten des Mediums zu vermeiden.
    4. Stellen Sie ein Strahlungsfeld von 20 cm x 20 cm ein. Legen Sie einen gewebeäquivalenten Bolus von 1,0 cm Dicke auf die Behandlungscouch und legen Sie die 6 Brunnenplatte auf den Bolus, um sie in Kontakt zu halten. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Platte innerhalb des Strahlungsfeldes befindet. Stellen Sie den Hautabstand der Quelle auf 100 cm ein. Richten Sie die mittlere Oberflächenebene auf die Laserebene aus, indem Sie die Höhe der Behandlungscouch anpassen.
      HINWEIS: Platten mit der gleichen Strahlendosis können gleichzeitig abgestrahlt werden. In diesem Fall wird ein größeres Strahlungsfeld benötigt, und die Anzahl der MU sollte entsprechend dem entsprechenden Outputfaktor neu berechnet werden. Stellen Sie sicher, dass sich alle Platten innerhalb des Strahlungsfeldes befinden.
    5. Liefern Sie die jeweils zugewiesene Dosis nacheinander an jede Platte.
      VORSICHT: Der Linearbeschleuniger kann nur von qualifizierten Technikern betrieben werden. Von Strahlung fernhalten.
    6. Nehmen Sie die Platten zurück in den Zellkulturraum. Ändern Sie das Medium mit 2 ml abgeschlossenem Medium für jeden Brunnen. Kultur bei 37 °C mit 5% CO2 im Zellkultur-Inkubator. Ändern Sie das Medium alle 3 bis 5 Tage.
  3. Färbung
    1. 7–10 Tage nach der Strahlung, wenn sich viele Kolonien bilden und bevor sie zu groß werden und zusammenverschmelzen, führen Sie dann Färbung und Zählen wie folgt durch. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es kurz mit PBS. Fügen Sie 1 ml 4% Formaldehyd zu jedem Brunnen hinzu, um die Zellen zu fixieren.
      VORSICHT: Formaldehyd ist flüchtig. Verwenden Sie Formaldehyd in einer Dunstabzugshaube.
    2. Nach 10 min Fixierung das Formaldehyd entfernen und mit 2 ml destilliertem Wasser jeweils zweimal waschen.
    3. Fügen Sie 1 ml 1% kristallviolette Fleckenlösung zu jedem Brunnen hinzu. 10 min. 10 min. Entfernen Sie die kristallviolette Fleckenlösung und waschen Sie sie 3 Mal mit destilliertem Wasser. Entfernen Sie das Wasser und trocknen Sie die Platten.
  4. Koloniezählung und -berechnung
    1. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien mit mehr als 50 Zellen. Schließen Sie keine kleinen Kolonien mit weniger als 50 Zellen ein. Überprüfen Sie die Kolonien unter dem Mikroskop, um einen Eindruck von einer Kolonie zu erhalten, die aus 50 Zellen besteht, und markieren Sie sie auf der Unterseite der Platte mit einem Markerstift.
      HINWEIS: Das Fotografieren der Brunnen und die Verwendung der Software ImageJ erleichtert den Zählvorgang.
    2. Berechnen Sie die Effizienz der Koloniebildung als die Anzahl der Kolonien geteilt durch die Anzahl der ausgesäten Zellen. Berechnen Sie die Überlebensfraktion als Die Koloniebildungseffizienz bei einer bestimmten Bestrahlungsdosis geteilt durch die Koloniebildungseffizienz bei 0 Gy.
    3. Mit der Dosis als x-Achse und Überlebensfraktion als y-Achse kann eine Überlebenskurve erhalten werden. Vergleichen Sie die Überlebenskurven zwischen den positiven und negativen Zellpopulationen.

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Representative Results

Die Zellen wurden sortiert (Abbildung 1A). Einige Marker können unterschiedliche Populationen aufweisen und sind leicht zu tororieren. Einige Marker weisen jedoch nur hohe und niedrige Ausdrucksmuster auf, anstatt deutliche positive und negative Populationen zu zeigen. In dieser Situation ist eine Isotypkontrolle sehr wichtig für die Gating. Die Expression von 2 x 1 in sortierten Zellen wird durch qPCR validiert. Die Expression von CACNA2D1, dem Gen, das die Kodierung von 2 ,1 , ist in sortierten Zellen mit 2 bis 1 Jahren höher als in den zellenniedriger Zelle von 2 x 1 (Abbildung 1B).

Typische Morphologie von Kugeln ist in Abbildung 2Adargestellt. Die Kugelbildungseffizienz wird in 2-1-hohen und 2 -1-niedrigen Zellen berechnet (Abbildung 2B). Die 2-1-hohen Zellen wiesen eine höhere Wirkungsgrad der Kugelbildung auf, was auf eine höhere Selbsterneuerungskapazität hindeutet. Typische Bilder von Zellkolonien sind in Abbildung 3Adargestellt. Eine Kolonie mit etwa 50 Zellen kann unter dem Mikroskop untersucht und als Referenz markiert werden. Eine Überlebensfraktion bei jeder Dosis kann berechnet werden, und die Überlebenskurven sind in Abbildung 3Bdargestellt. Die 2-1-hohen Zellen sind relativ beständig gegen Strahlung im Vergleich zu den zellenarmen Zellen von 2 bis 1 %.

Ungepaarter zweiseitiger Schüler-t-Testwurde durchgeführt, um die Bedeutung zwischen Gruppen zu bewerten. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Daten werden mit dem Mittelwert und der Standardabweichung (SD) dargestellt. Repräsentative Daten aus mindestens drei biologisch unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen werden vorgestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Sortieren von 2 -1-hohen und 2 -1-niedrigen Zellen in A549. (A) Repräsentative Strömungszytometrie-Analyse des Ausdrucks 2 x 1. Zellen werden basierend auf der Isotypkontrolle abgegrenzt. (B) Bestätigung des Ausdrucks von 2 x 1 in hohen und niedrigen Populationen durch QPCR. Die Fehlerbalken zeigen SD an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Kugelbildungstest von A549-Zellen mit einer Höhe von 2,1 und 2,1 000. (A) Repräsentative Morphologie der Kugeln, die durch die sortierten Zellen mit 2,1- und 2-1-niedrigen Zellen gebildet werden (bar = 200 m). (B) Wirkungsgrad der Kugelbildung von 2 -1-hohen und 2 -1-niedrigen Zellen. Die Fehlerbalken geben SD (***p < 0.001) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Koloniebildungstest von A549-Zellen mit einer Höhe von 2,1 und 2,1 000. (A) Repräsentative Bilder der Kolonien, die durch die sortierten Zellen mit einer Höhe von 2 x 1 und 2,1 -1 gebildet werden. (B) Überlebenskurven von 2 -1-hohen und 2 -1-niedrigen Zellen. Die Anzahl der gesäten Zellen war 200 Zellen pro Brunnen für 0 Gy, 400 Zellen pro Brunnen für 4 Gy und 800 Zellen für 8 Gy. Die Fehlerbalken geben SD an (**p < 0.05, ***p < 0.001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Radiosensitivität von CSCs in Krebszelllinien in vitro. In dieser Studie ist die Expression von 2 x 1 in NSCLC-Zelllinien kontinuierlich. Daher basiert Gating auf einer Isotypkontrolle. Vor der Sortierung sollte der Ausdruck 2 x 1 in mehreren Zelllinien durch Durchflusszytometrie untersucht und durch QPCR oder Western Blot validiert werden. Es wird empfohlen, die Expression der sortierten, 2,1-hohen und 2-1-niedrigen Zellen durch Durchflusszytometrie, durch Beobachtung der Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzmikroskop oder durch QPCR (nach sortierung) neu zu analysieren.

Kugelbildungstest ist eine einfache Möglichkeit, selbsterneuerungskapazität zu bewerten, die verwendet werden kann, um vermeintliche CSCs vorläufig zu charakterisieren. Diese Methode wurde verwendet, um Neurosphären oder Mammosphären zu kultiieren, um Stammzellen in Gliom- oder Brustkrebszellen zu charakterisieren, und die Formel wird modifiziert, um andere Arten von Krebs zu kulturisieren4,6,10. EGF und bFGF können die Selbsterneuerung von Stammzellen in serumfreiem Medium unterstützen; Grundlegende Mittel- und Wachstumsfaktoren können jedoch bei der Kultivierung verschiedener Zelltypen unterschiedlich sein. Das halbfeste Medium wird verwendet, um Zellen zu immobilisieren, so dass Kugeln durch Zellproliferation gebildet werden, anstatt sich zu bündeln. Ultralow Befestigungsplatte wird im Experiment verwendet, um Kugelmorphologie zu erhalten. Da CSCs nach der Sphärenkultur angereichert sind, wenn die Kugeln gesammelt, verdaut und für die sekundäre Kugelbildung gesät werden, wird die Effizienz der Kugelbildung wahrscheinlich in der nachfolgenden seriellen Vermehrung9,10zunehmen. Ein strengeres Kriterium für die Charakterisierung von CSCs ist in vivo begrenzung der Verdünnungsuntersuchung, bei der eine Reihe von sortierten positiven und negativen Zellen subkutan in immundefizienten Mäusen injiziert werden, dann die Frequenzen tumorgener Zellen in positiver und negative Zellpopulationen werden berechnet10,14. Wenn ein vermeintlicher Krebsstammzellmarker durch Kugelbildungstest identifiziert wird, wird eine weitere Charakterisierung durch in vivo begrenzende Verdünnungstest empfohlen.

In dieser Studie wird die Radiosensitivität von CSCs bewertet. Koloniebildung Assay ist ein klassischer Weg, um die Radiosensibilität zu beurteilen. Säen der gleichen Anzahl von Zellen in parallelen Brunnen in wichtig. Passen Sie die Zellenzahl pro ml auf einen geeigneten Bereich an, um sicherzustellen, dass das Volumen der Zellsuspension, die jedem Bohrkörper zugesetzt wird, mehr als 100 l beträgt. Wenn das Volume zu klein ist, wird der Fehler wahrscheinlich erhöht. Für die Zellstrahlung wird ein Medium mit einer Höhe von 1 cm für den Dosisaufbau hinzugefügt, und ein gewebeäquivalenter Bolus wird zur Dosisrückstreuung unter die Platte gelegt. Den Forschern wird empfohlen, sich an Strahlenphysiker und Techniker zu wenden, um das Zellstrahlungsmodell einzurichten und die Dosis zu berechnen.

Dieses Manuskript enthält die ersten Schritte für die Radiosensitivitätsstudie von CSCs. Weitere Mechanismusstudien können Proteine im Zusammenhang mit DNA-Schäden Reparatur, Clearance von reaktiven Sauerstoffspezies, Zellzyklus arrest, etc.15. Diese Experimente benötigen eine große Menge an Zellen; Daher sind viele Gerichte von Zellen benötigt, um zubereitet werden. Überexpression oder Knockout/Knockdown von CSC-Genen liefern auch wichtige Einblicke, wie CSCs Radioresistenz erlangen.

Diese Methoden können möglicherweise angewendet werden, um CSCs in Krebsgeweben zu identifizieren. Zhang et al. beschrieben Isolierung CD166-positive Lin-negative Zellen aus NSCLC chirurgischen Proben12. Gewebe wurden mit einer sterilen Klinge gehackt und mit einem Enzymcocktail verdaut. Zellen, die durch das Durchlaufen von Zellsieben gesammelt wurden, wurden zur Sortierung beschriftet und dann durch Kugelbildungstest und in vivo begrenzenden Verdünnungstest gekennzeichnet. Für 2 x1 als CSC-Marker, Es wurde berichtet, CSC in hepatozellulären Karzinom chirurgischegewebe und kleinzelligen Lungenkrebs Patienten abgeleitet Xenograft Gewebe10,16zu isolieren. Wenn man bedenkt, dass eine hohe Anzahl von Zellen für die Analyse benötigt wird, ist es relativ schwierig, CSCs in Biopsien oder zirkulierenden Tumorzellen zu isolieren. Alternativ kann die Färbung der Abschnitte von Biopsien möglicherweise Hinweise auf die Existenz von CSC in den Tumoren liefern. Diese mutmaßliche Anwendung muss jedoch in Patientengeweben und klinischen Daten bewertet werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81402535 und 81672969) und dem National Key Research and Development Project (2016YFC0904703) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red Thermo Fisher 15400054 Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water
1B50-1 This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)
4% formaldehyde solution Solarbio G2160
A549 ATCC RRID: CVCL_0023
B27 Thermo Fisher 17504044
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher 1336
Centrifuge Eppendorf 5910R
DMEM/F-12 Thermo Fisher 12500062
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher PHG0311
Fetal bovine serum Thermo Fisher 16140071
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher PHG0261
Flow cytometer/cell sorter BD FACSARIA III
H1299 ATCC RRID: CVCL_0060
H1975 ATCC RRID: CVCL_1511
Lightning-Link Fluorescein Kit Innova Biosciences 310-0010
linear accelerator VARIAN CLINAC 600C/D
Methyl cellulose Sigma Aldrich M7027
Penicillin-Streptomycin, Liquid Thermo Fisher 15140122
Phosphate buffered saline Solarbio P1020
RPMI-1640 Thermo Fisher 11875093
SYBRGREEN TOYOBO QPK-201
TRIzol Thermo Fisher 15596026
Violet crystal staining solution Solarbio G1062

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References

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Strahlenempfindlichkeit von Krebsstammzellen in Lungenkrebszelllinien
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Sui, X., Geng, J. H., Yu, H. M., Li, Y. H., Wang, W. H. Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (150), e60046, doi:10.3791/60046 (2019).

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