Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Радиочувствительность стволовых клеток рака в линиях клеток рака легких

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60046
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research (Ministry of Education/Beijing), Department of Radiation Oncology, Peking University Cancer Hospital and Institute

Summary

Наличие раковых стволовых клеток было связано с рецидивом или плохими исходами после лучевой терапии. Данная рукопись описывает методы изучения радиочувствительности раковых стволовых клеток в линиях раковых клеток легких.

Abstract

Наличие раковых стволовых клеток (CSCs) было связано с рецидивом или плохими исходами после лучевой терапии. Изучение радиорезистентных CSCs может дать ключ к преодолению радиорезистентности. Волтат-gated кальциевый канал No2 '1 субъединицы изоформы 5 было сообщено в качестве маркера для радиорезистентных CSCs в немелкоклеточного рака легких (NSCLC) клеточных линий. В качестве примера маркера CSC представлены методы изучения радиочувствительности CSCs в клеточных линиях NSCLC. ЦСР сортируются с помощью ориентировочных маркеров по цитометрии потока, а способность самообновления отсортированных клеток оценивается по оценке формирования сферы. Анализ формирования колонии, который определяет, сколько клеток теряют способность генерировать потомков формирования колонии после определенной дозы излучения, затем осуществляется для оценки радиочувствительности отсортированных клеток. Данная рукопись содержит первые шаги для изучения радиочувствительности CSCs, что закладывает основу для дальнейшего понимания основополагающих механизмов.

Introduction

Радиотерапия играет важную роль в лечении рака. Однако наличие радиорезистентных раковых стволовых клеток (CSCs) может привести к рецидиву или плохим исходам после лучевой терапии1,2. CSCs характеризуются их самообновления способности и способность генерировать неоднородные раковые клетки3. Бронированные с более эффективной способностью восстановления повреждений ДНК или более высокими уровнями свободно-радикальных систем очистки или других механизмов, CSCs относительно устойчивы к лучевой терапии4,5,6,7 , 8.Выявление маркеров CSC и изучение их механизмов будет способствовать разработке препаратов, которые будут преодолевать радиорезистентность без увеличения нормального повреждения тканей.

Voltage-gated кальциевый канал No2 '1 субединый изоформ 5 было сообщено в качестве маркера для радиостойких CSCs в NSCLC клеточных линий9. Первоначально был идентифицирован как маркер CSC для гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)10. Использование высубтактивной иммунизации с парой линий клеток HCC, полученных из первичных и рецидивирующих опухолей у одного и того же пациента, антитело под названием 1B50-1 было идентифицировано для целевой периодических клеток HCC в частности. 1B50-1-положительные клетки показали высокую эффективность формирования сферы в пробирке и высокую туморигенность in vivo. Его антиген был идентифицирован масс-спектрометрией, как кальциевый канал No2 No1 субунит изоформы 5. No2 No 1 специально выражается в CSCs и не обнаруживается в большинстве нормальных тканей, что делает его потенциальным кандидатом для ориентации CSCs10. Также может служить маркером CSC для клеточных линий NSCLC, и было показано, что он частично придает радиорезистую устойчивость клеткам NSCLC, повышая эффективность восстановления повреждений ДНК в ответ на излучение9.

Изучение радиорезистентных CSCs может дать ключ к преодолению радиорезистентности. В качестве примера можно сделать основные методы изучения радиочувствительности CSC. Как правило, CSCs изолированы с putative маркером поверхности, и характеристики стволовой клетки и радиочувствительность положительных и отрицательных популяций клетки сравниваются. Формирование сферы в среде, свободной от сыворотки, дополненной факторами роста, поддерживающими самообновление, является полезным анализом для оценки стеблий клеток in vitro. Клетки с высокой способностью формирования сферы, вероятно, проявляют высокую опухоленность при введении в иммунодефицитных мышей10,11,12. Колония формирования анализ затем используется для оценки радиочувствительности клеток, который определяет, сколько потеряли способность генерировать потомков формирования колонии после дозы радиации13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги выполняются при указанной температуре. Для шагов, в которых температура не упоминается, выполнять при комнатной температуре (18-25 градусов по Цельсию). Среда культуры клеток должна храниться при 4 градусах Цельсия, а другие реагенты должны храниться в соответствии с руководствами производителя. Средний должен быть предварительно разогрет до 37 градусов по Цельсию, прежде чем добавлять в клетки.

1. Сортировка клеток

  1. Спряжение антител
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая более короткое время инкубации, антитела с прямой маркировкой предпочтительнее для сортировки клеток. Если нет коммерческих прямых маркировки антитела доступны, используйте флуоресцеин-конъюгирующих реагентов для сопряжения антитела к флуоресцентной краситель в соответствии с руководством производителя (см. Таблица материалов). Как клетки будут культивироваться после сортировки, все шаги должны быть выполнены в биологической безопасности шкаф или ламинар чистой скамейке. Во избежание загрязнения антибиотики (пенициллин и стрептомицин) рекомендуется добавлять в среднюю среду культуры после сортировки.
    1. Добавьте 1 зл реагента модификатора для каждого 10 зл. Смешайте осторожно.
    2. Добавить смесь антител и модификатора непосредственно на лиофилизированный флуоресцеин. Пайпет нежно. Оставьте флакон стоя в течение 3 ч или на ночь при комнатной температуре (RT) в темноте.
    3. Добавьте 1 злителя рекончера реагента на каждые 10 зл. Конъюгет можно использовать после 30 мин. Флуоресцеин конъюгировать может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 18 месяцев.
    4. Перед сортировкой рекомендуется титрирование спряженных антител. Подготовьте ячейки, которые выражают (например, H1299 или A549 для No2'1) и не выражают (например, H1975) маркер. Аликвотировать клетки и инкубировать их антителами в различных концентрациях (например, 15 мкг/мл, 7,5 мкг/мл, 1,5 мкг/мл и 0,75 мкг/мл соответственно).
    5. Выполняйте цитометрический анализ потока (с гистограммой или точечным участком) и выбирайте концентрацию, при которой положительные клетки H1299 или A549 могут быть отделены от контроля изотипаи, а клетки H1975 имеют мало неспецифических сигналов.
  2. Маркировка ячеек
    1. Культура A549 клеток в RPMI 1640 среды дополнены 10% плода бычьей сыворотки (FBS) в 10 см блюд при 37 кс и 5% CO2 в инкубаторе клеточной культуры. Дайджест клеток следующим образом для сортировки, когда они достигают 80%-90% слияния (около 5-10 х 106 клеток на блюдо).
    2. Удалите среду культуры. Вымойте клетки с 3 мл фосфатов буферного солья (PBS) кратко. Добавьте 3 мл 0,05% трипсина к каждому блюду. Удалить трипсин и оставить остаточный трипсин переварить клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 1-3 мин. Проверьте отслоение клеток часто, чтобы избежать переварения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые клеточные линии могут быть относительно трудно усваиваются, такие как линии клеток NSCLC H520 и PC9. В такой ситуации в блюде можно оставить 3 мл трипсина, а не пищеварение с помощью остатого трипсина. Кроме того, время пищеварения может быть продлено.
    3. Когда клетки становятся свободными и начинают отсоединяться от посуды, добавьте 3 мл средней RPMI 1640, дополненной 10% FBS и пипеткой, суспензией клетки в трубку 50 мл.
    4. Центрифуга при 300 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Отбросьте супернатант. Добавьте 10 мл PBS, чтобы повторно приостановить работу клеток. Передача 0,5 мл (или не менее 5 х 105 ячеек) клеточной подвески в новую трубку в качестве изотипа управления. Остальные ячейки для сортировки.
    5. Центрифуга как контроль, так и экспериментальные трубки при 300 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
    6. Подготовьте рабочее решение для окрашивания путем разбавления флуоресцентного красителя-конъюгированного контроля изоттипа или антитела в PBS к оптимальной концентрации титров, как упоминалось выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, FITC-конъюгированный 1B50-1 (антитела No2'1) был разбавлен в 7,5 мкг/мл. Объем рабочего решения зависит от количества клеток.
    7. Resuspend управления и экспериментальных клеток с каждым рабочим решением около 2-5 х 107 клеток / мл и аккуратно перемешать. Инкубировать образцы на RT в течение 30-40 минут в темноте.
    8. Вымойте клетки, добавив 10 мл PBS в образцы, аккуратно перемешайте и центрифуги при 300 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Отбросьте супернатант. Отсеивайте клетки с 10 мл PBS.
    9. Положите 40 мкм-клеточных ситектов на новые 50 мл труб для контроля и экспериментальных клеток соответственно. Нанесите клеточную подвеску на ситечко и соберите поток через.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг удаляет ячейки сгустки, которые могут блокировать капилляры сортировщика ячейки.
    10. Центрифуги потока через 300 х г при 4 кв КС в течение 5 мин. Отбросьте супернатант. Приостановите клетки с 0,2-1,0 мл PBS затем передать в 5 мл трубки для потока цитометрии.
  3. Сортировка клеток по цитометрии потока
    1. Подготовьте две трубки 5 мл для сбора положительных и отрицательных популяций клеток. Добавьте 1 мл среды RPMI 1640 в каждую трубку. Поместите трубки на платформу сбора сортировки ячейки.
    2. Проанализируйте контрольные клетки и экспериментальные клетки соответственно с точки участка. Ворота живые ячейки с параметрами вперед рассеяния (FSC) и боковой рассеяния (SSC). Ворота положительной и отрицательной популяции живых клеток в соответствии с интенсивностью FL-1.
    3. Соберите 2-положительные клетки и отрицательные клетки . Запишите количество полученных ячеек.
    4. Чтобы подтвердить, что популяции собранных клеток имеют разный уровень экспрессии No2, можно провести количественную цепную реакцию полимеразы.
      1. Извлекайте РНК положительных и отрицательных клеток с помощью биоцинатного биоцината гуанидинат и обратное транскрипт РНК в кДНК в соответствии с руководством производителя. Выполните ЗПКР с зеленым реагентом SYBR. Последовательности грунтовок таковы: No2-1-F, CAGTTGAGGAGGATGATG; No2-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTGTC; ГАПДХ-Ф,ГТКГГАГААКАКАЦАТТГГГГГГГ; и GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.

2. Сфер формирования асссе

ПРИМЕЧАНИЕ: Сфер формирования асссе применяется для определения способности самообновления клеток. Клетки с способностью к самообновлению могут образовывать сферы в этой безысыворотке полутвердой среде, дополненной факторами роста. Все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности или ламинарной чистой скамейке. Во избежание загрязнения антибиотики (пенициллин и стрептомицин) рекомендуется добавлять в среднюю среду культуры после сортировки.

  1. Средняя подготовка
    1. Приготовьте 2x DMEM/F-12 среды путем воссоздания 1 l пакет DMEM / F-12 порошок в 475 мл дистиллированной воды. Добавьте 2,438 г NaHCO3. Отрегулируйте рН до 7,0-7,2, медленно добавляя 1 N NaOH или 1 N HCl с перемешиванием. Добавьте дистиллированную воду до конечного объема 500 мл. Стерилизовать среду путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм.
    2. Приготовьте 2% раствор метилцеллюлозы, добавив 2 г метилцеллюлозы в 100 мл дистиллированной воды. Автоклав нот решения. Метилцеллюлоза может показать хлопкоподобное состояние после автоклавирования. Смешайте его, обратив бутылку вверх и вниз осторожно в течение нескольких раз и оставить его для естественного охлаждения. Он станет прозрачным полутвердым в одночасье.
    3. Чтобы получить 20 мл самообновляемого носителя, добавьте 10 мл 2x DMEM/F-12 среднего к 50 мл трубки. Добавьте 400 qL B27 к среде. Добавьте рекомбинантный фактор эпидермального роста человека (EGF) к конечной концентрации 25 нг/мл. Добавьте рекомбинантный основной фактор роста фибробластов человека (bFGF) к конечной концентрации 25 нг/мл. Добавьте 2% метилцеллюлозы, чтобы достичь конечного объема 20 мл.
    4. Смешайте среду по вихрю так, чтобы самообновление среды получены.
  2. Посев ячеек
    1. Перенесите собранные клетки в среду самообновления, чтобы достичь 2000 клеток/мл и смешайте их с кратким вихрем. Добавьте 100 кЛ клеточной подвески к каждой скважине ультра-низкой пластины 96 скважин. Не используйте колодцы на краю пластины, так как среда с большей вероятностью испаряется в этих скважинах. Добавьте стерилизованные воды в эти колодцы.
    2. Культура при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в инкубаторе клеточной культуры в течение 10-14 дней. Добавьте 50 кл.л. среды самообновления в день 5-7.
  3. Подсчет и расчет сферы
    1. Через 10–14 дней после посева подсчитайте количество сфер с более чем 50 клетками (примерно) или диаметром более 100 мкм под микроскопом (4x объектив, 10-x окуляр).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с верхнего левого из колодца, подсчитайте сферы, двигая объективную таблицу горизонтально вправо с помощью джойстика микроскопа. Затем переместите объективную таблицу в средний ряд поля зрения и посчитайте сферы справа налево. Затем перейдите к нижнему ряду и отсчитайте слева направо. Колодец из 96 пластины хорошо можно пересчитать в течение трех рядов.
    2. Рассчитайте эффективность формирования сферы как количество сфер, разделенных на количество посеянных клеток. Сравните эффективность формирования сферы между положительными и отрицательными популяциями клеток.

3. Образование колонии

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ формирования колонии применяется для определения радиочувствительности клеток. Излучение может быть доставлено линейным ускорителем, используемым для лучевой терапии. Система облучения клеток для лабораторного использования также может быть использована при наличии оборудования. Шаги 3.1, 3.2.3 и 3.2.6 должны выполняться в шкафу биологической безопасности или ламинаре чистой скамейке. Во избежание загрязнения антибиотики (пенициллин и стрептомицин) рекомендуется добавлять в среднюю среду культуры после сортировки.

  1. Посев ячеек
    1. Подготовьте одну 6-хорошую пластину для каждой дозы облучения, включая группу 0 Gy. Добавьте 1,5 мл средней к каждому колодцу 6 хорошо пластины. Культура среды для формирования колонии асссе является обычным RPMI 1640 среды дополнены 10% FBS (названный как "завершено 1640").
    2. Разбавить собранные клетки с завершенными 1640 средними до 1000 клеток/мл.
    3. Добавьте суспензию в скважины. Встряхните пластины горизонтально, чтобы клетки равномерно распределялись в колодцах. Запись объема, добавленного в каждой группе дозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, семена 200 клеток на хорошо для 0 Gy, 200 клеток на 2 Gy, 400 клеток для 4 Gy, 800 клеток для 6 Gy, и 1600 клеток для 8 Gy, соответственно. Лучше регулировать номера клеток в несортированных клетках в предэкспериментах.
    4. Культура при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в инкубаторе клеточной культуры.
  2. Излучения
    1. После того, как клетки прикрепились к нижней части колодцев (обычно через день после посева, а более длительное время не рекомендуется рассматривать пролиферацию клеток), приступайте к выполнению клеточного излучения.
    2. Рассчитайте количество блоков монитора (MU) для каждой дозы на глубине 1 см в радиационном поле 20 см х 20 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество дозы MU (cGy)/коэффициент выхода для радиационной поля/процентной доза глубины (PDD) для глубины. Например, коэффициент выхода для поля 20 см х 20 см составляет 1,066, PDD на 1,0 см - 0,987, а количество МУ для 8 Gy (800 cGy) - 760 (800/1,066/0,987 и 760,35). Если несколько пластин должны быть излучаемых для каждой дозы, большее поле также может быть использовано, и число МУ должны быть пересчитаны в зависимости от размера поля. Коэффициент выхода и PDD различаются в разных ускорителях. Обратитесь к физикам радиации для этих параметров.
    3. Добавьте завершенный 1640 к каждому колодцу, чтобы достичь 1 см для высоты среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Площадь роста ячейки 6 хорошо пластины можно найти на руководство производителя. Например, если площадь роста составляет 9,5 см2 для каждой скважины из 6 скважин, а 1,5 мл средней и 0,4 мл клеточной суспензии были добавлены на день раньше, то добавьте 7,6 мл средней к скважине. Высота необходима для наращивания дозы. Не рекомендуется средней высоты менее 0,8 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пластины покрыты во время излучения. Когда пластины передаются между комнатой клеточной культуры и комнатой лучевой терапии, оберните пластины алюминиевой фольгой или положите их в чистую коробку, чтобы избежать загрязнения. Держите пластины плоскими, чтобы избежать среднего разлива.
    4. Установите радиационное поле 20 см х 20 см. Поместите ткань эквивалентный болюс 1,0 см толщины на обработке диван, и поместите 6 хорошо пластины на болюс, чтобы держать их в контакте. Убедитесь, что вся пластина находится в радиационном поле. Установите расстояние исходной кожи в 100 см. Выровняйте средний уровень поверхности до уровня лазера, регулируя высоту лечебного дивана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины с той же дозой излучения могут быть излучены в то же время. Для этого необходимо более крупное радиационное поле, а количество МУ должно быть пересчитано в соответствии с соответствующим коэффициентом выхода. Убедитесь, что все пластины находятся в радиационном поле.
    5. Доставьте каждую назначенную дозу каждой пластине последовательно.
      ВНИМАНИЕ: Линейный ускоритель может эксплуатироваться только квалифицированными специалистами. Держитесь подальше от радиации.
    6. Отнеси тарелки обратно в комнату культуры клеток. Измените среду с 2 мл завершенной среды для каждой скважины. Культура при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в инкубаторе клеточной культуры. Меняйте среду каждые 3-5 дней.
  3. Окрашивания
    1. 7-10 дней после излучения, когда многие колонии образуются и, прежде чем они растут слишком большими и сливаются вместе, а затем выполнять окрашивания и подсчета следующим образом. Удалите среду и кратко промыть с помощью PBS. Добавьте 1 мл 4% формальдегида к каждому колодцу, чтобы исправить клетки.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид волатильен. Используйте формальдегид в дымовом капюшоне.
    2. После 10 минут фиксации, удалить формальдегид и промыть с 2 мл дистиллированной воды каждый колодец в два раза.
    3. Добавьте 1 мл 1% кристаллического фиолетового пятна раствор атакжем. Пятно в течение 10 мин. Удалить кристалл фиолетовый пятно раствор, и мыть с дистиллированной водой 3 раза. Снимите воду и высушите тарелки.
  4. Подсчет и расчет колоний
    1. Подсчитайте количество колоний с более чем 50 клетками. Не включайте небольшие колонии с менее чем 50 клетками. Проверьте колонии под микроскопом, чтобы получить впечатление колонии, образованной 50 клетками, и пометьте ее на дне пластины маркерной ручкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фотографирование скважин и использование программного обеспечения ImageJ облегчит процесс подсчета голосов.
    2. Рассчитайте эффективность образования колонии как число колоний, разделенных на количество посеянных клеток. Рассчитайте фракцию выживания как эффективность образования колонии на некоторая доза облучения разделенная эффективностью образования колонии на 0 Gy.
    3. Используя дозу в качестве x-оси и доли выживания, как y-оси, кривая выживания может быть получена. Сравните кривые выживаемости между положительными и отрицательными популяциями клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Были отсортированы ячейки A549(рисунок 1A). Некоторые маркеры могут отображать различные популяции и легко ворота. Тем не менее, некоторые маркеры просто показывают высокие и низкие модели выражения, а не различные положительные и отрицательные популяции. В этой ситуации, изотип управления очень важно для gating. Выражение No2 No1 в отсортированных ячейках проверяется qPCR. Выражение CACNA2D1, гена, который кодирует No2 No1, выше в отсортированных клетках высотой 2 х1 по сравнению с клетками с низкими(рисунок 1B).

Типичная морфология сфер показана на рисунке 2A. Эффективность формирования сферы рассчитывается в клетках с высотой 2 х1 и 2х1 -низких(рисунок 2B). Клетки с высоким уровнем 2х1 показали более высокую эффективность формирования сферы, что свидетельствует о более высокой способности к самообновлению. Типичные изображения клеточных колоний показаны на рисунке 3A. Колония с около 50 клетками может быть исследована под микроскопом и помечена как эталон. Доля выживания в каждой дозе может быть рассчитана, и кривые выживания представлены на рисунке 3B. Клетки с высокими высотами 2х1 относительно устойчивы к радиации по сравнению с клетками с низкими и низкими.

Для оценки значимости между группами был проведен неспаренный двухсторонний тестстудента. Значение p qlt; 0.05 было сочтено статистически значимым. Данные представлены со средним и стандартным отклонением (SD). Представлены репрезентативные данные по крайней мере трех биологически независимых экспериментов с аналогичными результатами.

Figure 1
Рисунок 1: Сортировка ячеек A549 высотой 2 х1 и 2 х1. (A) Представительный анализ цитометрии потока выражения No2. Клетки закрыты на основе контроля изотипов. (B) Подтверждение выражения No2-1 в высоких и низких популяциях ЗПКР. Бары ошибок указывают SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Сферформирование асссес и 2-1-высокие и No 2 -1-низкий A549 клеток. (A) Представительная морфология сфер, образованных отсортированными клетками высотой 2 х1 и 2х1 (бар no 200 мкм). (B) Эффективность формирования сферы ячеек высотой 2 х1 и 2 х1. Бары ошибок указывают на SD (зп злт; 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Образование колонии ассссис из 2-1-высокий и No 2 -1-низкий A549 клеток. (A) Репрезентативные изображения колоний, образованных отсортированными клетками no2 и 2х1-низкими. (B) Кривые выживаемости ячеек высотой 2 х1 и 2-1-низкими. Число сеяных клеток было 200 клеток на скважину для 0 Gy, 400 клеток на хорошо для 4 Gy, и 800 клеток для 8 Gy. Бары ошибок указывают на SD (зп злт; 0,05, qp lt; 0.001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает методы для изучения радиочувствительности CSCs в раковых клеточных линий в пробирке. В этом исследовании выражение No2 No1 непрерывна в линиях клеток NSCLC. Таким образом, gating основан на изотипном контроле. Перед сортировкой выражение No2 No1 должно быть исследовано в нескольких клеточных линиях цитометрией потока и проверено ЗПКР или западным пятном. Рекомендуется повторно проанализировать экспрессию отсортированных клеток No2 х1 и 2х1-низких клеток по цитометрии потока, наблюдая за флуоресцентной флуоресцентной микроскопом, или с помощью ЦПКР (после сортировки).

Анализ формирования сферы – это простой способ оценки способности к самообновлению, который можно использовать для предварительной характеристики мнимых CSCs. Этот метод был использован для культуры нейросфер или маммосфер, чтобы охарактеризовать стволовые клетки в глиоме или раковых клетках молочной железы, и формула модифицируется в культуру других видов рака4,6,10. EGF и bFGF могут поддерживать самообновление стволовых клеток в среде, свободной от сыворотки; однако основные факторы среднего и роста могут отличаться для культивирования различных типов клеток. Полутвердая среда используется для обездвиживания клеток, так что сферы образуются путем пролиферации клеток, а не кластеризации вместе. Ультранизкая пластина крепления используется в эксперименте для поддержания морфологии сферы. Более того, по мере обогащения CSCs после культуры сферы, когда сферы собраны, усваиваются, и семя для формирования вторичной сферы, эффективность формирования сферы, вероятно, возрастет в последующем последовательном распространении9,10. Более строгим критерием для характеристики CSCs является in vivo ограничение разбавления анализ, в котором ряд номеров отсортированных положительных и отрицательных клеток вводятся подкожно в иммунодефицитных мышей, то частоты опухолевых клеток в положительную и отрицательные популяции клеток рассчитаны10,14. Если предположенный маркер стволовых клеток рака определяется по сфере формирования ассе, дальнейшая характеристика in vivo ограничение разбавления асссеерекомендуете рекомендуется.

В этом исследовании оценивается радиочувствительность CSCs. Анализ формирования колонии является классическим способом оценки радиочувствительности. Посев одинаковое количество клеток в параллельных скважинах в важном. Отрегулируйте номер ячейки на мл до подходящего диапазона, чтобы обеспечить объем клеточной подвески, добавленной к каждой скважине, более чем на 100 л. Если объем слишком мал, вероятность увеличения погрешности. Для клеточного излучения, средний с высотой 1 см добавляется для наращивания дозы, и ткани эквивалентный болюс помещается под пластину для дозы backscatter. Исследователям рекомендуется обратиться к физикам радиации и техникам для настройки модели излучения клеток и расчета дозы.

Данная рукопись содержит первые несколько шагов для исследования радиочувствительности CSCs. Дальнейшие исследования механизма могут включать белки, связанные с восстановлением повреждений ДНК, очистка реактивных видов кислорода, арест клеточного цикла и т.д.15. Эти эксперименты требуют большого количества клеток; поэтому, многие блюда из клеток должны быть подготовлены. Переэкспрессия или нокаут / нокдаун генов CSC также обеспечивают важное понимание того, как CSCs получить радиорезистентности.

Эти методы потенциально могут быть применены для выявления CSCs в раковых тканях. Чжан и др. описаны изоляции CD166-положительных Лин-отрицательных клеток из NSCLC хирургических образцов12. Ткани нарезали стерильным лезвием и переваривали ферментным коктейлем. Клетки, собранные путем прохождения через клеточные ситечко, были помечены для сортировки, а затем характеризуются сферой формирования асссеи и in vivo, ограничивающими разбавление. Для No 2 '1 в качестве маркера CSC, было сообщено, чтобы изолировать CSC в гепатоцеллюлярной карциномы хирургических тканей и мелкоклеточного рака легких пациента полученных ксенотрансплантат тканей10,16. Учитывая большое количество клеток, необходимых для анализа, это относительно трудно изолировать CSCs в биопсии или циркулирующих опухолевых клеток. Кроме того, окрашивание участков биопсии потенциально может дать ключ к существованию CSC в опухолях. Тем не менее, это предполагаемое применение должно быть оценено в тканях пациента и клинических данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81402535 и 81672969) и Национальным проектом ключевых исследований и разработок (2016YFC0904703).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red Thermo Fisher 15400054 Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water
1B50-1 This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)
4% formaldehyde solution Solarbio G2160
A549 ATCC RRID: CVCL_0023
B27 Thermo Fisher 17504044
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher 1336
Centrifuge Eppendorf 5910R
DMEM/F-12 Thermo Fisher 12500062
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher PHG0311
Fetal bovine serum Thermo Fisher 16140071
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher PHG0261
Flow cytometer/cell sorter BD FACSARIA III
H1299 ATCC RRID: CVCL_0060
H1975 ATCC RRID: CVCL_1511
Lightning-Link Fluorescein Kit Innova Biosciences 310-0010
linear accelerator VARIAN CLINAC 600C/D
Methyl cellulose Sigma Aldrich M7027
Penicillin-Streptomycin, Liquid Thermo Fisher 15140122
Phosphate buffered saline Solarbio P1020
RPMI-1640 Thermo Fisher 11875093
SYBRGREEN TOYOBO QPK-201
TRIzol Thermo Fisher 15596026
Violet crystal staining solution Solarbio G1062

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
  2. Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
  3. Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
  4. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  5. Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
  6. Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
  7. Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
  8. Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
  9. Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
  10. Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
  11. Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
  12. Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
  13. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  14. O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
  15. Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
  16. Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).

Tags

Исследования рака выпуск 150 радиочувствительность рак стволовых клеток рак легких лучевая терапия анализ формирования колонии анализ формирования сферы цитометрия потока
Радиочувствительность стволовых клеток рака в линиях клеток рака легких
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sui, X., Geng, J. H., Yu, H. M., Li, … More

Sui, X., Geng, J. H., Yu, H. M., Li, Y. H., Wang, W. H. Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (150), e60046, doi:10.3791/60046 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter