Summary
وقد ارتبط وجود الخلايا الجذعية السرطانية مع الانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي. تصف هذه المخطوطة طرق دراسة الحساسية الإشعاعية للخلايا الجذعية السرطانية في خطوط خلايا سرطان الرئة.
Abstract
ارتبط وجود الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) بالانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي. دراسة CSCs مقاومة للراديو قد توفر أدلة للتغلب على المقاومة الراديوية. تم الإبلاغ عن قناة الكالسيوم ذات البوابات الجهدية α2δ1 الوحدة الفرعية isoform 5 كعلامة لCSCs المقاومة للأشعة في خطوط الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة الخلية (NSCLC). باستخدام قناة الكالسيوم α2δ1 الفرعية كمثال على علامة CSC، يتم عرض طرق لدراسة حساسية الراديو من CSCs في خطوط الخلايا NSCLC. يتم فرز CSCs مع علامات المفترضة عن طريق قياس التدفق، ويتم تقييم قدرة التجديد الذاتي للخلايا التي تم فرزها عن طريق فحص تشكيل المجال. ثم يتم إجراء فحص تشكيل المستعمرة، الذي يحدد عدد الخلايا التي تفقد القدرة على توليد أحفاد تشكيل المستعمرة بعد جرعة معينة من الإشعاع، لتقييم الحساسية الإشعاعية للخلايا المصنفة. تقدم هذه المخطوطة خطوات أولية لدراسة الحساسية الإشعاعية لـ CSCs، والتي ترسي الأساس لزيادة فهم الآليات الأساسية.
Introduction
يلعب العلاج الإشعاعي دورًا مهمًا في علاج السرطان. ومع ذلك، فإن وجود الخلايا الجذعية السرطانية المقاومة للأشعة (CSCs) قد يؤدي إلى الانتكاس أو النتائج السيئة بعد العلاج الإشعاعي1،2. وتتميز CSCs من خلال قدرتها على التجديد الذاتي والقدرة على توليد الخلايا السرطانية غير المتجانسة3. مدرعة مع قدرة إصلاح تلف الحمض النووي أكثر كفاءة أو مستويات أعلى من أنظمة المسح الجذورالحرة أو غيرها من الآليات، CSCs هي مقاومة نسبيا للعلاج الإشعاعي 4،5،6،7 , 8.تحديد علامات CSC واستكشاف آلياتها سوف تسهل تطوير الأدوية التي من شأنها التغلب على المقاومة الإشعاعية دون زيادة تلف الأنسجة الطبيعية.
تم الإبلاغ عن قناة الكالسيوم المسورة بالجهد α2δ1 وحدة isoform 5 كعلامة لCSCs المقاومة للراديو في خطوط الخلايا NSCLC9. تم تحديد α2δ1 في الأصل كعلامة CSC لسرطان الخلايا الكبدية (HCC)10. باستخدام التحصين الطرحي مع زوج من خطوط الخلايا HCC المستمدة من الأورام الأولية والمتكررة في نفس المريض، تم تحديد جسم مضاد اسمه 1B50-1 لاستهداف خلايا HCC المتكررة على وجه التحديد. 1B50-1-إيجابية أظهرت الخلايا كفاءة تشكيل المجال عالية في المختبر والورم العالي في الجسم الحي. تم تحديد مستضدها عن طريق قياس الطيف الكتلي، كقناة الكالسيوم α2δ1 الوحدة الفرعية isoform 5. α2δ1 يعبر على وجه التحديد في CSCs وغير قابل للكشف في معظم الأنسجة العادية، مما يجعلها مرشح محتمل لاستهداف CSCs 10. α2δ1 يمكن أيضا أن تكون بمثابة علامة CSC لخطوط الخلايا NSCLC، وقد ثبت لنقل المقاومة الراديوية لخلايا NSCLC جزئيا عن طريق تعزيز كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي استجابة للإشعاع9.
دراسة CSCs مقاومة للراديو قد توفر أدلة للتغلب على المقاومة الراديوية. باستخدام α2δ1 في NSCLC كمثال، يتم عرض الأساليب الرئيسية لدراسة حساسية الراديو من CSCs. عادة، يتم عزل CSCs مع علامة السطح المفترضة، ويتم مقارنة خصائص الخلايا الجذعية والحساسية الإشعاعية من مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية. تشكيل المجال في وسط خالية من المصل تكملها عوامل النمو التي تدعم التجديد الذاتي هو فحص مفيد لتقييم جذع الخلايا في المختبر. الخلايا ذات القدرة العالية على تشكيل المجال من المرجح أن تظهر ورم عالية عند حقنها في الفئران التي تعاني من نقص المناعة10،11،12. ثم يتم استخدام فحص تشكيل المستعمرة لتقييم الحساسية الإشعاعية للخلايا، والتي تحدد عدد الذين فقدوا القدرة على توليد أحفاد تشكيل المستعمرة بعد جرعة من الإشعاع13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات تحت درجة الحرارة المشار إليها. بالنسبة للخطوات التي لا يتم فيها ذكر درجة الحرارة، قم بالأداء تحت درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). يجب تخزين وسيط ثقافة الخلية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية، وينبغي تخزين الكواشف الأخرى وفقًا لأدلة الشركة المصنعة. يجب أن تكون متوسطة قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية قبل إضافتها إلى الخلايا.
1. فرز الخلايا
- اقتران الأجسام المضادة
ملاحظة: بالنظر إلى وقت الحضانة أقصر يفضل الأجسام المضادة ذات العلامات المباشرة لفرز الخلايا. إذا لم يكن هناك جسم مضاد تجاري يحمل علامة مباشرة، استخدم الكواشف الفلورية الزوجية لاقتران الجسم المضاد بصبغة فلورية وفقًا لدليل الشركة المصنعة (انظر جدولالمواد). كما سيتم زراعة الخلايا بعد الفرز، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو مقاعد البدلاء لامينار نظيفة. لتجنب التلوث ، ينصح بالمضادات الحيوية (البنسلين والعقديات) لإضافتها إلى وسط الثقافة بعد الفرز.- إضافة 1 ميكرولتر من الكاشف المعدّل لكل 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة ليتم تسميتها. يُخلط المزيج برفق.
- إضافة خليط من الأجسام المضادة ومعدّل مباشرة على الفلورسين lyophilized. بايبت بلطف. اترك القارورة واقفة لمدة 3 ساعات أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام.
- إضافة 1 ميكرولتر من كاشف التبريد لكل 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة. يمكن استخدام المتقارن بعد 30 دقيقة. يمكن تخزين المتقارن الفلورية عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 18 شهرًا.
- قبل الفرز ، يوصى بمعايرة الأجسام المضادة المتقارنة. إعداد الخلايا التي تعبر (على سبيل المثال، H1299 أو A549 لα2δ1) ولا تعبر (على سبيل المثال، H1975) عن العلامة. Aliquot الخلايا واحتضانها مع الأجسام المضادة بتركيزات مختلفة (على سبيل المثال، 15 ميكروغرام / مل، 7.5 ميكروغرام / مل، 1.5 ميكروغرام / مل، و 0.75 ميكروغرام / مل، على التوالي).
- إجراء تحليل مقياس التدفق (مع الرسم البياني أو مؤامرة نقطة) واختيار التركيز الذي يمكن فصل الخلايا الإيجابية من H1299 أو A549 من التحكم isotype وخلايا H1975 لديها إشارات غير محددة قليلاً.
- تسمية الخلايا
- ثقافة A549 الخلايا في RPMI 1640 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في أطباق 10 سم في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة ثقافة الخلية. خلايا تلخيصية على النحو التالي للفرز عندما تصل إلى 80٪ -90٪ التقاء (حوالي 5-10 × 106 خلايا لكل طبق).
- إزالة وسيط الثقافة. غسل الخلايا مع 3 مل من الفوسفات المخزنة المالحة المخزنة (PBS) لفترة وجيزة. أضف 3 مل من 0.05% تريبسين إلى كل طبق. إزالة التربسين وترك التربسين المقيم لهضم الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقيقة.
ملاحظة: قد يكون من الصعب نسبياً هضم بعض خطوط الخلايا، مثل خطوط الخلايا NSCLC H520 وPC9. في مثل هذه الحالة، يمكن ترك 3 مل من التربسين في الطبق، بدلا من الهضم مع التربسين المقيم. وعلاوة على ذلك، يمكن تمديد وقت الهضم. - عندما تصبح الخلايا فضفاضة والبدء في فصل من الأطباق، إضافة 3 مل من RPMI 1640 المتوسطة تستكمل مع FBS 10٪ وماصة تعليق الخلية في أنبوب 50 مل.
- الطرد المركزي في 300 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 10 مل من PBS لإعادة تعليق الخلايا. نقل 0.5 مل (أو على الأقل 5 × 105 خلايا) من تعليق الخلية في أنبوب جديد كعنصر تحكم isotype. الخلايا المتبقية للفرز.
- الطرد المركزي كل من أنابيب التحكم والتجريبية في 300 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إعداد حل العمل لتلطيخ عن طريق تخفيف الفلورسنت صبغ مترافق التحكم isotype أو الأجسام المضادة في PBS إلى التركيز الأمثل المعتصّق كما ذكر أعلاه.
ملاحظة: في هذه التجربة، تم تخفيف 1B50-1 (الجسم المضاد لα2δ1) إلى 7.5 ميكروغرام/مل. يعتمد حجم حل العمل على مقدار الخلية. - إعادة تعليق الخلايا التحكم والتجريبية مع كل حل العمل في حوالي 2-5 × 107 خلايا / مل وتخلط بلطف. احتضان العينات في RT لمدة 30-40 دقيقة في الظلام.
- غسل الخلايا عن طريق إضافة 10 مل من PBS إلى العينات، وخلط بلطف والطرد المركزي في 300 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا مع 10 مل من PBS.
- وضع 40 ميكرومتر مصفاة الخلية على أنابيب جديدة 50 مل للسيطرة والخلايا التجريبية على التوالي. تطبيق تعليق الخلية على مصفاة وجمع تدفق من خلال.
ملاحظة: هذه الخطوة إزالة كتل الخلية التي قد تمنع الشعرية فارز الخلية. - طرد مركزي من خلال تدفق في 300 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا مع 0.2-1.0 مل PBS ثم نقل إلى أنبوب 5 مل لتدفق قياس الخلايا.
- فرز الخلايا حسب قياس التدفق الخلوي
- إعداد اثنين من أنابيب 5 مل لجمع السكان الخلايا الإيجابية والسلبية. أضف 1 مل من RPMI 1640 وسطًا في كل أنبوب. وضع الأنابيب في منصة جمع فارز الخلية.
- تحليل خلايا التحكم والخلايا التجريبية على التوالي مع مؤامرة نقطة. بوابة الخلايا الحية مع المعلمات إلى الأمام مبعثر (FSC) وتشتت الجانب (SSC). بوابة السكان إيجابية وسلبية من الخلايا الحية وفقا لشدة FL-1.
- جمع الخلايا الإيجابية α2δ1 والخلايا السالبة α2δ1. تسجيل عدد الخلايا التي تم الحصول عليها.
- للتأكد من أن مجموعات الخلايا التي تم حصادها لها مستوى مختلف من التعبير α2δ1، يمكن إجراء تفاعل متسلسل بوليميراز كمي (QPCR).
- استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا الإيجابية والسلبية مع الغوانيدينيوم ثيوسيانات الإعادة وعكس نسخة الحمض النووي الريبي في cDNA وفقا لدليل الشركة المصنعة. قم بإجراء QPCR باستخدام الكاشف الأخضر SYBR. تسلسل التمهيديات هي كما يلي: α2δ1-F, CAGTTGAGATGGAGGATATG; α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; وGAPDH-R، AAAAGCAGCCCTGTGACC.
2. كرة تشكيل [سّي]
ملاحظة: يتم تطبيق تحليل تشكيل المجال لتحديد قدرة التجديد الذاتي للخلايا. الخلايا ذات القدرة على التجديد الذاتي يمكن أن تشكل مجالات في هذه الوسيلة شبه الصلبة خالية من المصل مع عوامل النمو. وينبغي تنفيذ جميع الخطوات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو مقاعد البدلاء لامينار نظيفة. لتجنب التلوث ، ينصح بالمضادات الحيوية (البنسلين والعقديات) لإضافتها إلى وسط الثقافة بعد الفرز.
- إعداد متوسط
- إعداد 2X DMEM / F-12 المتوسطة عن طريق إعادة تشكيل حزمة 1 لتر من مسحوق DMEM / F-12 في 475 مل من الماء المقطر. إضافة 2.438 غرام من NaHCO3. ضبط الحموضة إلى 7.0-7.2 عن طريق إضافة ببطء 1 N هيدروكسيد الصوديوم أو 1 N حمض الهيدروكلوريك مع التحريك. إضافة الماء المقطر إلى حجم نهائي من 500 مل. تعقيم المتوسط عن طريق تصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
- إعداد محلول ميثيل سيلولوز 2٪ عن طريق إضافة 2 غرام من ميثيل سيلولوز في 100 مل من الماء المقطر. الأوتوكلاف الحل. قد تظهر ميثيل سيلولوز حالة تشبه القطن بعد الأوتوكلاف. امزجه عن طريق عكس الزجاجة صعودا وهبوطا بلطف لبضع مرات وتركها للتبريد الطبيعي. وسوف تصبح شفافة شبه صلبة بين عشية وضحاها.
- للحصول على 20 مل من وسيلة التجديد الذاتي، أضف 10 مل من 2X DMEM/F-12 متوسطة إلى أنبوب 50 مل. إضافة 400 درجة مئوية من B27 إلى الوسط. إضافة عامل نمو البشرة البشرية المؤتلف (EGF) إلى التركيز النهائي من 25 نانوغرام /مل. إضافة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية البشرية المؤتلف (bFGF) إلى التركيز النهائي من 25 نانوغرام/مل. إضافة 2٪ ميثيل سيلولوز للوصول إلى حجم نهائي من 20 مل.
- خلط المتوسطة من دوامة بحيث يتم الحصول على وسيط ة التجديد الذاتي.
- بذر الخلايا
- نقل الخلايا المقطوعة في وسط التجديد الذاتي للوصول إلى 2000 خلية / مل ومزجها مع دوامة قصيرة. إضافة 100 درجة مئوية من تعليق الخلية إلى كل بئر من مرفق منخفضة جدا 96 لوحة جيدا. لا تستخدم الآبار على حافة اللوحة، كما المتوسطة هي أكثر عرضة للتبخر في هذه الآبار. إضافة الماء المعقم إلى هذه الآبار.
- الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10-14 يوما. أضف 50 ميكرو لتر من وسيلة التجديد الذاتي في اليوم 5-7.
- عد المجال والحساب
- 10-14 يوما بعد البذر، عد عدد المجالات مع أكثر من 50 خلية (تقريبا) أو مع قطر أكثر من 100 ميكرومتر تحت المجهر (عدسة موضوعية 4X، 10X العدسة).
ملاحظة: بدءا من الجزء العلوي الأيسر من البئر، عد المجالات أثناء تحريك الجدول الموضوعي أفقيا نحو اليمين مع عصا التحكم من المجهر. ثم، نقل الجدول الموضوعي إلى الصف الأوسط من الحقل البصري وعد المجالات من اليمين إلى اليسار. ثم انتقل إلى الصف السفلي وعد من اليسار إلى اليمين. بئر من 96 لوحة جيدا يمكن عدها في غضون ثلاثة صفوف. - حساب كفاءة تشكيل الكرة وعدد المجالات مقسوما على عدد الخلايا المصنفة. مقارنة كفاءة تشكيل المجال بين مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية.
- 10-14 يوما بعد البذر، عد عدد المجالات مع أكثر من 50 خلية (تقريبا) أو مع قطر أكثر من 100 ميكرومتر تحت المجهر (عدسة موضوعية 4X، 10X العدسة).
3. تحديد تشكيل المستعمرة
ملاحظة: يتم تطبيق تحليل تشكيل المستعمرة لتحديد حساسية الراديو للخلايا. يمكن توصيل الإشعاع بواسطة مسرّع خطي يستخدم للعلاج الإشعاعي. كما يمكن استخدام نظام تشعيع الخلايا للاستخدام المختبري إذا كانت المعدات متوفرة. وينبغي تنفيذ الخطوات 3-1 و3-2-3 و3-2-6 في خزانة السلامة البيولوجية أو مقاعد البدلاء النظيفة. لتجنب التلوث ، ينصح بالمضادات الحيوية (البنسلين والعقديات) لإضافتها إلى وسط الثقافة بعد الفرز.
- بذر الخلايا
- إعداد لوحة واحدة 6 جيدا لكل جرعة الإشعاع بما في ذلك مجموعة 0 Gy. إضافة 1.5 مل من المتوسطة إلى كل بئر من 6 لوحة جيدا. ثقافة وسط لمستعمرة تشكيل عيّس التقليديّة [ربّي] 1640 متوسّطة يكمّل مع 10% [فبس] (يعيّن بما أنّ "يتمّ 1640").
- تمييع الخلايا المقطوعة مع 1640 خلية متوسطة إلى 1000 خلية/مل.
- إضافة تعليق الخلية إلى الآبار. هز الأطباق أفقيا لجعل الخلايا توزع بالتساوي في الآبار. تسجيل الحجم المضافة في كل مجموعة جرعة.
ملاحظة: بشكل عام، البذور 200 خلية لكل بئر ل0 غراي، 200 خلية ل2 غراي، 400 خلية ل4 غراي، 800 خلية ل6 غراي، و 1600 خلية ل8 غراي، على التوالي. فمن الأفضل لضبط أرقام الخلايا في الخلايا غير المصنفة في ما قبل التجارب. - الثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة ثقافة الخلية.
- الاشعاع
- بعد أن تعلق الخلايا على الجزء السفلي من الآبار (عادة بعد يوم واحد من البذر، ولا ينصح بوقت أطول النظر في انتشار الخلايا)، والمضي قدما في أداء الإشعاع الخلوي.
- حساب عدد وحدات الرصد (MU) لكل جرعة على عمق 1 سم في حقل إشعاع 20 سم × 20 سم.
ملاحظة: عدد الكمية من الكمية = الجرعة (cGy)/معامل الإخراج لجرعة عمق حقل الإشعاع/النسبة المئوية للعمق. على سبيل المثال، عامل الإخراج لحقل 20 سم × 20 سم هو 1.066، PDD ل1.0 سم هو 0.987، وعدد MU ل8 غراي (800 cGy) هو 760 (800/1.066/0.987 = 760.35). إذا كانت هناك حاجة إلى تشعيع لوحات متعددة لكل جرعة، يمكن أيضا استخدام حقل أكبر، وأرقام MU تحتاج إلى إعادة حساب وفقا لحجم الحقل. يختلف عامل الإخراج وPDD في مسرعات مختلفة. الرجوع إلى علماء الفيزياء الإشعاعية لهذه المعلمات. - إضافة الانتهاء من 1640 إلى كل بئر للوصول إلى 1 سم لارتفاع المتوسطة.
ملاحظة: منطقة نمو الخلية من 6 لوحة جيدا يمكن العثور على دليل الشركة المصنعة. على سبيل المثال، إذا كانت منطقة النمو 9.5 سم2 لكل بئر من 6 لوحة بئر، و 1.5 مل من المتوسطة و 0.4 مل من تعليق الخلية قد أضيفت في اليوم السابق، ثم إضافة 7.6 مل المتوسطة إلى البئر. هناك حاجة إلى الارتفاع لتراكم الجرعة. لا ينصح بارتفاع متوسط يقل عن 0.8 سم.
ملاحظة: الحفاظ على لوحات مغطاة أثناء الإشعاع. عندما يتم نقل لوحات بين غرفة زراعة الخلايا وغرفة العلاج الإشعاعي، التفاف لوحات مع رقائق الألومنيوم أو وضعها في مربع نظيف لتجنب التلوث. عقد لوحات مسطحة لتجنب تسرب المتوسطة. - تعيين 20 سم × 20 سم حقل الإشعاع. وضع بولوس الأنسجة المكافئة من سمك 1.0 سم على الأريكة العلاج، ووضع لوحة جيدا 6 على بولس للحفاظ عليها في اتصال. تأكد من أن اللوحة بأكملها داخل مجال الإشعاع. تعيين مسافة الجلد المصدر كما 100 سم.
ملاحظة: يمكن تشعّى الأطباق التي تحتوي على نفس الجرعة الإشعاعية في نفس الوقت. وفي هذه الحالة، هناك حاجة إلى مجال إشعاع أكبر، وينبغي إعادة حساب عدد الـ MU وفقاً لعامل الناتج المقابل. تأكد من أن جميع الصفائح داخل مجال الإشعاع. - تسليم كل جرعة معينة لكل لوحة في تسلسل.
تحذير: لا يمكن تشغيل المسرع الخطي إلا من قبل فنيين مؤهلين. ابتعد عن الإشعاع - خذ الصحون إلى غرفة ثقافة الزنزانة تغيير المتوسط مع 2 مل من المتوسطة المكتملة لكل بئر. الثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة ثقافة الخلية. تغيير المتوسط كل 3-5 أيام.
- تلطيخ
- 7-10 أيام بعد الإشعاع، عندما تشكل العديد من المستعمرات وقبل أن تنمو كبيرة جدا وتندمج معا، ثم أداء تلطيخ والعد على النحو التالي. إزالة المتوسطة وغسل لفترة وجيزة مع PBS. إضافة 1 مل من الفورمالديهايد 4٪ إلى كل بئر لإصلاح الخلايا.
تحذير: الفورمالديهايد متقلبة. استخدام الفورمالديهايد في غطاء الدخان. - بعد 10 دقائق من التثبيت، وإزالة الفورمالديهايد وغسل مع 2 مل من الماء المقطر كل جيدا مرتين.
- إضافة 1 مل من 1٪ الكريستال البنفسجي وصمة عار الحل لكل بئر. وصمة عار لمدة 10 دقيقة إزالة محلول وصمة عار البنفسج الكريستال، وغسل بالماء المقطر 3 مرات. إزالة الماء وتجفيف لوحات.
- 7-10 أيام بعد الإشعاع، عندما تشكل العديد من المستعمرات وقبل أن تنمو كبيرة جدا وتندمج معا، ثم أداء تلطيخ والعد على النحو التالي. إزالة المتوسطة وغسل لفترة وجيزة مع PBS. إضافة 1 مل من الفورمالديهايد 4٪ إلى كل بئر لإصلاح الخلايا.
- عد المستعمرة وحسابها
- عد عدد المستعمرات مع أكثر من 50 خلية. لا تشمل المستعمرات الصغيرة مع أقل من 50 خلية. تحقق من المستعمرات تحت المجهر للحصول على انطباع من مستعمرة تشكلها 50 خلية ووضع علامة عليه على الجزء السفلي من لوحة مع قلم علامة.
ملاحظة: تصوير الآبار واستخدام البرنامج ImageJ سوف تسهل عملية العد. - حساب كفاءة تشكيل المستعمرة وعدد المستعمرات مقسوما على عدد الخلايا المصنفة. حساب كسر البقاء على قيد الحياة ككفاءة تشكيل مستعمرة في جرعة التشعيع معينة مقسومة على كفاءة تشكيل المستعمرة في 0 غراي.
- باستخدام الجرعة كمحور س وكسر البقاء على قيد الحياة كمحور ص، يمكن الحصول على منحنى البقاء على قيد الحياة. قارن منحنيات البقاء على قيد الحياة بين مجموعات الخلايا الإيجابية والسلبية.
- عد عدد المستعمرات مع أكثر من 50 خلية. لا تشمل المستعمرات الصغيرة مع أقل من 50 خلية. تحقق من المستعمرات تحت المجهر للحصول على انطباع من مستعمرة تشكلها 50 خلية ووضع علامة عليه على الجزء السفلي من لوحة مع قلم علامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم فرز خلايا A549 عالية α2δ1 وα2δ1 منخفضة (الشكل 1A). قد تظهر بعض العلامات مجموعات سكانية متميزة وسهلة البوابات. ومع ذلك، تظهر بعض العلامات فقط أنماط التعبير العالية والمنخفضة، بدلاً من مجموعات سكانية إيجابية وسلبية متميزة. في هذه الحالة، عنصر تحكم نوع isotype مهم جداً للزماة. يتم التحقق من صحة التعبير α2δ1 في الخلايا التي تم فرزها بواسطة qPCR. التعبير عن CACNA2D1، الجين الذي ترميز α2δ1 ، هو أعلى في فرز الخلايا α2δ1 عالية مقارنة مع الخلايا α2δ1 منخفضة (الشكل 1B).
يظهر المورفولوجيا النموذجية للمجالات في الشكل 2A. يتم حساب كفاءة تكوين المجال في الخلايا α2δ1 عالية وα2δ1 منخفضة (الشكل2B). وأظهرت الخلايا α2δ1 عالية أعلى كفاءة تشكيل المجال، مما يشير إلى قدرة أعلى التجديد الذاتي. تظهر الصور النموذجية لمستعمرات الخلايا في الشكل 3A. يمكن فحص مستعمرة مع حوالي 50 خلية تحت المجهر ووضع علامة كمرجع. ويمكن حساب كسر البقاء على قيد الحياة في كل جرعة، وترد منحنيات البقاء على قيد الحياة في الشكل 3B. الخلايا العالية α2δ1 مقاومة نسبيا للإشعاع مقارنة بالخلايا المنخفضة α2δ1.
تم إجراء اختبار t-غير المقترن للطلاب على الوجهين لتقييم الأهمية بين المجموعات. واعتُبرت قيمة 0.05 قيمة ذات أهمية إحصائية. يتم تمثيل البيانات مع الانحراف المتوسط والمعياري (SD). وتقدم بيانات تمثيلية من ثلاث تجارب مستقلة بيولوجيا على الأقل مع نتائج مماثلة.
الشكل 1: فرز الخلايا العالية α2δ1 وα2δ1 منخفضة في A549. (أ) تحليل قياس التدفق التمثيلي لتعبير α2δ1. يتم بوابات الخلايا استناداً إلى عنصر تحكم isotype. (ب) تأكيد التعبير α2δ1 في السكان عالية ومنخفضة من قبل QPCR. أشرطة الخطأ تشير إلى SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد تشكيل المجال لخلايا A549 عالية α2δ1 وα2δ1 منخفضة. (أ) مورفولوجيا تمثيلية للمجالات التي شكلتها الخلايا المصنفة α2δ1-high وα2δ1-low (شريط = 200 ميكرومتر). (ب) كفاءة تكوين المجال للخلايا العالية α2δ1 وα2δ1 منخفضة. تشير أشرطة الخطأ إلى SD (***p < 0.001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد تكوين المستعمرة لخلايا A549 عالية α2δ1 وα2δ1 منخفضة. (أ) صور تمثيلية للمستعمرات التي شكلتها الخلايا التي تم فرزها α2δ1-عالية وα2δ1-منخفضة. (ب) منحنيات البقاء على قيد الحياة من الخلايا α2δ1 عالية وα2δ1 منخفضة. وكانت أعداد الخلايا المصنفة 200 خلية لكل بئر ل0 غراي، 400 خلية لكل بئر لمدة 4 غراي، و 800 خلية ل8 غراي. تشير أشرطة الخطأ إلى SD (**p < 0.05, ***p < 0.001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول طرق دراسة الحساسية الإشعاعية لـ CSCs في خطوط الخلايا السرطانية في المختبر. في هذه الدراسة، والتعبير عن α2δ1 مستمر في خطوط الخلايا NSCLC. لذلك، يستند gating على عنصر تحكم isotype. قبل الفرز، يجب فحص تعبير α2δ1 في خطوط خلايا متعددة بواسطة قياس التدفق الخلوي والتحقق من صحتها بواسطة QPCR أو اللطخة الغربية. من المستحسن إعادة تحليل التعبير α2δ1 من الخلايا α2δ1-عالية وα2δ1-منخفضة فرزها عن طريق قياس التدفق، عن طريق مراقبة الفلورة تحت المجهر الفلورسنت، أو من قبل QPCR (بعد الفرز).
اختبار تشكيل المجال هو وسيلة بسيطة لتقييم قدرة التجديد الذاتي، والتي يمكن استخدامها لوصف أولي CSCs المفترضة. وقد استخدمت هذه الطريقة لثقافة المجالات العصبية أو الماموجوسفيرات لتوصيف الخلايا الجذعية في الورمالدبقي أو خلايا سرطان الثدي، ويتم تعديل الصيغة لثقافة أنواع أخرى من السرطان 4،6،10. EGF وbFGF يمكن أن تدعم التجديد الذاتي للخلايا الجذعية في وسط خالية من المصل; ومع ذلك، قد تختلف عوامل الوسط والنمو الأساسية لزراعة أنواع الخلايا المختلفة. يتم استخدام الوسيلة شبه الصلبة لشل الخلايا بحيث يتم تشكيل المجالات عن طريق انتشار الخلايا بدلا من التجمع معا. يتم استخدام لوحة مرفق فائقة اللول في التجربة للحفاظ على مورفولوجيا الكرة. وعلاوة على ذلك، وبما أن مراكز دعم الجرائم غير الحكومية تُثري بعد ثقافة الكرة، وعندما تُجمع المجالات وتهضم وتُبذر لتكوين المجال الثانوي، فمن المرجح أن تزداد كفاءة تكوين المجال في الانتشار المتسلسل اللاحق9و10. وهناك معايير أكثر صرامة لتوصيف CSCs هو في الجسم الحي الحد من اختبار التخفيف، والتي يتم حقن سلسلة من الأرقام من الخلايا الإيجابية والسلبية فرزها تحت الجلد في الفئران نقص المناعة، ثم ترددات الخلايا الورمية في إيجابية و يتم حساب مجموعات الخلايا السالبة10،14. إذا تم تحديد علامة الخلايا الجذعية السرطانية المفترضة عن طريق اختبار تشكيل المجال، يوصى بمزيد من التوصيف من خلال فحص تخفيف الحد من الجسم الحي.
في هذه الدراسة يتم تقييم حساسية الراديو من CSCs. تقييم تشكيل المستعمرة هو وسيلة كلاسيكية لتقييم الحساسية الإشعاعية. بذر نفس العدد من الخلايا في الآبار المتوازية في المهم. ضبط رقم الخلية لكل مل إلى نطاق مناسب لضمان حجم تعليق الخلية المضافة إلى كل بئر هو أكثر من 100 درجة مئوية. إذا كانت وحدة التخزين صغيرة جداً، فمن المحتمل أن يزيد الخطأ. بالنسبة لإشعاع الخلايا، يتم إضافة متوسطة مع ارتفاع 1 سم لتراكم الجرعة، ويتم وضع بولوس مكافئ للأنسجة تحت اللوحة للمبعثر الخلفي للجرعة. ويوصى الباحثون بالرجوع إلى الفيزيائيين الإشعاعيين والفنيين لإعداد نموذج الإشعاع الخلوي وحساب الجرعة.
توفر هذه المخطوطة الخطوات القليلة الأولية لدراسة الحساسية الإشعاعية لـ CSCs. وقد تشمل دراسات الآلية الأخرى بروتينات تتعلق بإصلاح تلف الحمض النووي، وإزالة أنواع الأكسجين التفاعلية، والقبض على دورة الخلايا، وما إلىذلك. هذه التجارب تحتاج إلى كمية كبيرة من الخلايا; لذلك، هناك حاجة إلى العديد من أطباق الخلايا لتكون مستعدة. كما يوفر التعبير المفرط أو الضربة القاضية/الضربة القاضية لجينات CSC رؤى هامة حول كيفية اكتساب CSCs للمقاومة الإشعاعية.
ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحديد CSCs في أنسجة السرطان. ووصف تشانغ وآخرون عزل CD166 إيجابية لين السلبية من عينات جراحية NSCLC12. تم تقطيع الأنسجة بشفرة معقمة وهضمها مع كوكتيل إنزيم. تم تصنيف الخلايا التي تم جمعها من خلال تمرير مصافي الخلايا للفرز، ومن ثم تتميز باختبار تشكيل الكرة وفي الجسم الحي الحد من اختبار التخفيف. لα2δ1 كعلامة CSC، وقد أفيد لعزل CSC في الأنسجة الجراحية سرطان الخلايا الكبدية والخلايا الصغيرة سرطان الرئة المستمدة من الأنسجة xenograft10،16. وبالنظر إلى وجود عدد كبير من الخلايا مطلوبة للتحليل، فمن الصعب نسبيا لعزل CSCs في الخزعات أو تعميم الخلايا السرطانية. بدلا من ذلك، تلطيخ أقسام الخزعات قد توفر أدلة على وجود CSC في الأورام. ومع ذلك، يجب تقييم هذا التطبيق المفترض في أنسجة المرضى والبيانات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81402535 و 81672969) والمشروع الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (2016YFC0904703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
