Summary
암 줄기 세포의 존재는 방사선 요법 후에 재발 또는 나쁜 결과와 연관되었습니다. 이 원고는 폐암 세포주에서 암 줄기 세포의 방과성을 연구하는 방법을 설명합니다.
Abstract
암 줄기 세포의 존재 (CSCs) 방사선 요법 후 재발 또는 가난한 결과와 관련 된. 방사능 CSC를 연구하는 것은 방사능 저항을 극복하기 위한 단서를 제공할 수 있습니다. 전압 게이트 칼슘 채널 α2δ1 소단위 이소폰 5는 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주에서 내성 CSC에 대한 마커로서 보고되었다. CSC 마커의 예로 칼슘 채널 α2δ1 소부를 사용하여, NSCLC 세포주에서 CSC의 방과성성을 연구하는 방법이 제시된다. CSC는 유세포측정에 의해 가설 마커로 분류되고, 정렬된 세포의 자기 갱신 능력은 구형 분석에 의해 평가된다. 얼마나 많은 세포가 방사선의 특정 복용량 후에 식민지를 형성하는 자손을 생성하는 능력을 분실하는지 결정하는 식민지 형성 분석, 그 후에 분류된 세포의 방과민성을 평가하기 위하여 능력을 발휘합니다. 이 원고는 CSC의 방과성 연구를 위한 초기 단계를 제공하며, 이는 기본 메커니즘에 대한 추가 이해를 위한 기초를 확립합니다.
Introduction
방사선 요법은 암 치료에 중요한 역할을합니다. 그러나, 방사선 저항하는 암 줄기 세포 (CSC)의 존재는 방사선요법 1,2후에 재발 또는 나쁜 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. CSC는 자기 재생 능력과 이종성 암세포를 생성하는 능력이특징입니다 3. 보다 효율적인 DNA 손상 수리 능력 또는 자유 래 디 칼 청소 시스템 또는 다른 메커니즘의 상부와장갑, CSC는 방사선 요법에 상대적으로 저항 4,5,6,7 , 8.CSC 마커를 식별하고 메커니즘을 탐구하면 정상적인 조직 손상을 증가시지 않고 내성을 극복 할 수있는 약물 개발을 촉진할 수 있습니다.
전압 게이트 칼슘 채널 α2δ1 소단위 이소폰 5는 NSCLC 세포주 9에서방사성 CSC에 대한 마커로서 보고되었다. α2δ1은 원래 간세포암(HCC)10에대한 CSC 마커로 확인되었다. 동일한 환자에서 원발성 및 재발성 종양으로부터 유래된 HCC 세포주 쌍을 이용한 감산 면역을 사용하여, 1B50-1이라는 항체가 재발성 HCC 세포를 특이하게 표적으로 하는 것으로 확인되었다. 1B50-1-양성 세포는 생체외에서 높은 구체 형성 효율을 나타내고 생체 내에서 높은 종양 발생성을 보였다. 이의 항원들은 질량분석법에 의해, 칼슘 채널 α2δ1 소단위 이소암5로서 확인되었다. α2δ1은 특히 CSC에서 표현되며 대부분의 정상 조직에서 탐지할 수 없기 때문에 CSC10을대상으로 하는 잠재적 후보입니다. α2δ1은 또한 NSCLC 세포주를 위한 CSC 마커로서 작용할 수 있으며, 방사선 9에 반응하여 DNA 손상 복구의 효율을향상시킴으로써 부분적으로 NSCLC 세포에 방사성을 부여하는 것으로 나타났다.
방사능 CSC를 연구하는 것은 방사능 저항을 극복하기 위한 단서를 제공할 수 있습니다. NSCLC에서 α2δ1을 예로 사용하여, CSC의 방과성을 연구하는 주요 방법이 제시된다. 일반적으로 CSC는 가성 표면 마커로 단리되고, 양성 및 음성 세포 집단의 줄기 세포 특성 및 방사능 민감도가 비교된다. 자가 재생을 지원하는 성장 인자로 보충된 무혈청 배지에서구 형성은 시험관 내에서 세포의 줄기를 평가하는 유용한 분석이다. 구체 형성 능력이 높은 세포는 면역결핍 마우스10,11,12에주사시 높은 종양성 성을 보일 가능성이 있다. 콜로니 형성 분석은 세포의 방과성을 평가하기 위해 사용되며, 이는 얼마나 많은 사람들이 방사선13의투여 후 식민지를 형성하는 후손을 생성하는 능력을 잃었는지 결정한다.
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Protocol
참고: 단계는 표시된 온도에서 수행됩니다. 온도가 언급되지 않은 단계의 경우 실온(18-25°C)에서 수행합니다. 세포 배양 배지는 4°C에서 보관되어야 하며, 다른 시약은 제조사의 가이드에 따라 보관되어야 한다. 배지는 세포에 첨가되기 전에 37°C로 미리 데워야 한다.
1. 셀 정렬
- 항체 컨쥬게이션
참고: 배양 시간이 짧음을 고려할 때, 직접 표지된 항체는 세포 선별에 바람직하다. 상업적인 직접 표지된 항체가 유효하지 않은 경우에, 제조자의 가이드에 따라 형광 염료에 항체를 공액하기 위하여 플루오레세인 컨쥬게이팅 시약을 이용하십시오 (재료표참조). 세포는 선별 후 배양되기 때문에 모든 단계는 생물학적 안전 캐비닛 또는 층상 클린 벤치에서 수행되어야합니다. 오염을 피하기 위해 항생제 (페니실린 및 연쇄상 구균)는 분류 후 배양 배지에 추가하는 것이 좋습니다.- 표지될 항체의 각 10 μL에 대해 수식어 시약 1 μL을 첨가한다. 부드럽게 섞으세요.
- 항체와 수식어의 혼합물을 호우필화된 플루오레세인에 직접 첨가한다. 부드럽게 파이펫. 바이알을 3시간 동안 또는 밤새 실온(RT)에서 방치하십시오.
- 항체 10 μL마다 1 μL의 담금질 시약을 첨가하십시오. 컨쥬게이트는 30분 후에 사용할 수 있습니다. 플루오레세인 컨쥬게이트는 최대 18개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
- 분류하기 전에 응고 된 항체의 적정을 권장합니다. 마커를 발현(예를 들어, α2δ1에 대한 H1299 또는 A549)을 발현하지 않는 세포를 준비한다. 세포를 알리쿼트하고 서로 다른 농도에서 항체로 배양합니다 (예를 들어, 15 μg / mL, 7.5 μg / mL, 1.5 μg / mL, 및 0.75 μg / mL, 각각).
- 유동 세포 분석(히스토그램 또는 도트 플롯 포함)을 수행하고 H1299 또는 A549의 양성 세포가 이소타입 대조군으로부터 분리될 수 있는 농도를 선택하고 H1975 셀은 비특이적 신호가 거의 없습니다.
- 셀 라벨링
- RPMI 1640 배지에서 배양 A549 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2에서 10 cm 접시에 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하였다. 다이제스트 세포는 80%-90% 합류(접시당 약 5-10 x 10 6세포)에 도달할 때 분류하기 위해 다음과 같다.
- 배양 배지를 제거합니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)의 3 mL로 세포를 짧게 씻는다. 각 요리에 0.05% 트립신의 3 mL를 추가합니다. 트립신을 제거하고 1-3 분 동안 37 °C에서 세포를 소화하는 residuary 트립신을 둡니다.
참고: 일부 세포주에서는 NSCLC 세포주 H520 및 PC9와 같이 비교적 소화하기 어려울 수 있습니다. 이러한 상황에서, 3 트립신의 mL 접시에 남아 있을 수 있습니다., residuary 트립신소화 보다는. 또한 소화 시간을 연장 할 수 있습니다. - 세포가 느슨해지고 접시에서 분리되기 시작하면 10 % FBS로 보충 된 RPMI 1640 배지 3 mL을 추가하고 셀 현탁액을 50 mL 튜브에 피펫하십시오.
- 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 폐기한다. PBS 10mL를 추가하여 셀을 다시 일시 중단합니다. 세포 현탁액의 0.5 mL(또는 적어도 5 x 105 5 셀)을 이소타입 대조군으로서 새로운 튜브내로 옮김을 전달한다. 나머지 셀은 정렬용입니다.
- 4°C에서 300 x g에서 300 x g의 대조군 및 실험튜브를 모두 원심분리기5분 동안 폐기한다.
- 위에서 언급한 바와 같이 적정된 최적의 농도로 PBS에서 형광염료-컨쥬게이팅 된 이소타입 제어 또는 항체를 희석시킴으로써 염색을 위한 작업 용액을 준비한다.
참고: 본 실험에서, FITC-컨쥬게이트 1B50-1(α2δ1의 항체)을 7.5 μg/mL로 희석하였다. 작업 용액의 부피는 셀 양에 따라 달라집니다. - 약 2-5 x 107 셀 /mL에서 각 작업 용액으로 제어 및 실험 세포를 다시 중단하고 부드럽게 혼합하십시오. RT에서 샘플을 30-40 분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
- 샘플에 10 mL의 PBS를 추가하여 세포를 세척하고, 300 x g에서 300 x g에서 5 분 동안 4 °C에서 원심 분리기를 부드럽게 섞으십시오. PBS의 10 mL로 셀을 다시 일시 중단합니다.
- 각각 제어 및 실험 세포에 대한 새로운 50 mL 튜브에 40 μm 세포 스트레이너를 넣어. 스트레이너에 셀 현탁액을 적용하고 흐름을 통해 수집합니다.
참고: 이 단계는 세포 선별기의 모세관을 차단할 수 있는 세포 덩어리를 제거합니다. - 원심분리기는 4°C에서 300 x g에서 5분 동안 경유하여 상한액을 버린다. 0.2-1.0 mL PBS로 세포를 다시 일시 중단한 다음 유세포 측정을 위해 5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 합니다.
- 유세포측정에 의한 세포 선별
- 양성 및 음성 세포 집단을 수집하기 위해 2개의 5 mL 튜브를 준비합니다. 각 튜브에 RPMI 1640 배지 1mL를 추가합니다. 튜브를 셀 선별기의 수집 플랫폼에 놓습니다.
- 도트 플롯을 통해 대조군 세포와 실험 셀을 각각 분석합니다. 매개 변수를 앞으로 분산(FSC) 및 측면 산란(SSC)으로 게이트합니다. FL-1 강도에 따라 살아있는 세포의 양성 및 음성 집단을 게이트합니다.
- α2δ1 양성 세포 및 α2δ1 음성 세포를 수집합니다. 얻은 셀 수를 기록합니다.
- 수확된 세포 집단이 α2δ1 발현의 상이한 수준을 가지고 있음을 확인하기 위해, 정량적 중합효소 연쇄 반응(QPCR)을 수행할 수 있다.
- 구니디늄 티오티아네이트 시약으로 양성 및 음성 세포의 RNA를 추출하고 제조업체의 가이드에 따라 RNA를 cDNA로 반전시. SYBR 녹색 시약으로 QPCR을 수행합니다. 프라이머의 서열은 다음과 같습니다: α2δ1-F,CAGTTGAGATAGGATG; α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTGTGTC; GAPDH-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; 및 GAPDH-R, AAAAGCAGCCCTGGGGGACC.
2. 구형성 분석
참고: 구체 형성 분석은 세포의 자기 갱신 능력을 결정하기 위해 적용됩니다. 자기 갱신 능력을 가진 세포는 성장 인자로 보충된 이 혈청 없는 반고형 배지에 있는 구를 형성할 수 있었습니다. 모든 단계는 생물학적 안전 캐비닛 또는 층상 청소 벤치에서 수행해야합니다. 오염을 피하기 위해 항생제 (페니실린 및 연쇄상 구균)는 분류 후 배양 배지에 추가하는 것이 좋습니다.
- 중간 준비
- DMEM/F-12 분말 1L 패키지를 증류수 475mL로 재구성하여 2x DMEM/F-12 배지를 준비합니다. NaHCO3의 2.438 g를 추가하십시오. pH를 7.0-7.2로 천천히 1 N NaOH 또는 1 N HCl을 교반하여 첨가하여 조절한다. 500 mL의 최종 부피에 증류수를 추가하십시오. 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 배지를 살균합니다.
- 증류수 100 mL에 메틸셀룰로오스 2 g을 추가하여 2% 메틸셀룰로오스 용액을 준비합니다. 솔루션을 자동화합니다. 메틸셀룰로오스는 오토클레이브 후 면과 같은 상태를 나타낼 수 있다. 병을 위아래로 몇 번 부드럽게 뒤집어 서 자연 냉각을 위해 그대로 두십시오. 하룻밤 사이에 투명한 반고체가 됩니다.
- 20 mL의 자가 재생 매체를 얻으려면 50 mL 튜브에 2x DMEM / F-12 배지 10 mL를 추가하십시오. 배지에 B27의 400 μL을 추가합니다. 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)를 최종 농도25 ng/mL에 추가합니다. 재조합 인간 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 최종 농도25 ng/mL에 추가합니다. 2% 메틸셀룰로오스를 첨가하여 최종 부피 20 mL에 도달합니다.
- 자가 재생 배지가 얻어지게 되도록 와류에 의해 배지를 혼합한다.
- 셀 시딩
- 수확된 세포를 자가 재생 배지로 옮겨 2000 개의 세포 / mL에 도달하고 짧은 소용돌이와 혼합하십시오. 초저 부착 부속 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL의 셀 서스펜션을 추가합니다. 매질이 우물에서 증발 할 가능성이 높기 때문에 플레이트의 가장자리에 우물을 사용하지 마십시오. 이 우물에 멸균 된 물을 추가하십시오.
- 10-14일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 5% CO2를 사용하여 37°C에서 배양하였다. 5-7일째에 셀프 리뉴얼 배지 50 μL을 추가합니다.
- 구 계수 및 계산
- 파종 후 10-14일 후에, 50개 이상의 세포(약) 또는 직경이 100 μm 이상인 구체수를 현미경으로 계산합니다(4배 대물 렌즈, 10x 접안렌즈).
참고: 우물의 왼쪽 위부터 시작하여 현미경의 조이스틱을 사용하여 목표 테이블을 오른쪽으로 수평으로 이동하면서 구를 계산합니다. 그런 다음 목표 테이블을 시각적 필드의 중간 행으로 이동하고 오른쪽에서 왼쪽으로 구를 계산합니다. 그런 다음 아래쪽 행으로 이동하고 왼쪽에서 오른쪽으로 계산합니다. 96 웰 플레이트의 우물은 세 행 내에서 계산 할 수 있습니다. - 시드된 셀 수로 나눈 구 수로 구 형성 효율을 계산합니다. 양성 세포 집단과 음의 세포 집단 사이의 구체 형성 효율을 비교합니다.
- 파종 후 10-14일 후에, 50개 이상의 세포(약) 또는 직경이 100 μm 이상인 구체수를 현미경으로 계산합니다(4배 대물 렌즈, 10x 접안렌즈).
3. 식민지 형성 분석
참고 : 식민지 형성 분석은 세포의 방과성을 결정하기 위해 적용됩니다. 방사선은 방사선 요법에 사용되는 선형 가속기에 의해 전달될 수 있습니다. 실험실 사용을 위한 세포 조사 시스템은 장비를 사용할 수 있는 경우에 또한 이용될 수 있습니다. 단계 3.1, 3.2.3 및 3.2.6은 생물학적 안전 캐비닛 또는 층상 클린 벤치에서 수행해야합니다. 오염을 피하기 위해 항생제 (페니실린 및 연쇄상 구균)는 분류 후 배양 배지에 추가하는 것이 좋습니다.
- 셀 시딩
- 0 Gy 그룹을 포함하여 각 방사선 선량에 대해 6개의 웰 플레이트를 준비한다. 6 웰 플레이트의 각 우물에 중간 크기의 1.5 mL를 추가합니다. 콜로니 형성 분석에 대한 배양 배지는 10% FBS로 보충된 종래의 RPMI 1640 배지이다("완료된 1640"으로 명명됨).
- 1640 배지에서 1000 세포 / mL로 수확 된 세포를 희석하십시오.
- 웰에 셀 서스펜션을 추가합니다. 플레이트를 수평으로 흔들어 세포가 우물에 고르게 분포되도록 합니다. 각 투여량 군에 첨가된 부피를 기록한다.
참고: 일반적으로, 종자 당 0 Gy, 2 Gy에 대한 200 세포, 4 Gy에 대한 400 세포, 6 Gy에 대한 800 세포, 8 Gy에 대한 1600 세포각각. 사전 실험에서 정렬되지 않은 셀의 세포 수를 조정하는 것이 좋습니다. - 세포 배양 인큐베이터에서 5% CO2를 사용하여 37°C에서 배양하였다.
- 방사선
- 세포가 우물의 바닥에 부착 한 후 (일반적으로 파종 후 하루, 더 긴 시간은 세포 증식을 고려하지 않는 것이 좋습니다), 세포 방사선을 수행하기 위해 진행.
- 20cm x 20cm 방사선 필드에서 1cm 깊이에서 각 용량에 대한 모니터 단위(MU)의 수를 계산합니다.
참고: 깊이에 대한 MU = 선량(cGy)/출력 계수(PDD)의 수입니다. 예를 들어 20cm x 20cm 필드의 출력 계수는 1.066이고, 1.0cm에 대한 PDD는 0.987이고, 8Gy(800 cGy)에 대한 MU 수는 760(800/1.066/0.987 = 760.35)입니다. 각 투여량에 대해 여러 플레이트를 방사해야 하는 경우 더 큰 필드를 사용할 수 있으며 MU 의 수는 필드의 크기에 따라 다시 계산되어야 합니다. 출력 계수와 PDD는 서로 다른 가속기에서 다릅니다. 이러한 매개 변수에 대한 방사선 물리학자를 참조하십시오. - 완성 된 1640을 각 우물에 추가하여 매체의 높이가 1cm에 도달합니다.
참고 : 6 웰 플레이트의 세포 성장 영역은 제조업체의 가이드에서 찾을 수 있습니다. 예를 들어, 성장 면적이 6웰 플레이트의 각 웰에 대해 9.5 cm2이고, 전날 에 1.5 mL의 배지 및 0.4 mL의 세포 현탁액이 첨가된 경우, 7.6 mL 배지를 웰에 첨가하였다. 높이 복용량 축적에 필요한. 중간 높이가 0.8cm 미만이면 권장되지 않습니다.
참고: 방사 중에 판을 덮어 두십시오. 플레이트가 세포 배양실과 방사선 치료실 사이에 옮겨질 때, 판을 알루미늄 호일로 감싸거나 오염을 피하기 위해 깨끗한 상자에 넣습니다. 중간 크기로 흘러나오지 않도록 플레이트를 평평하게 잡으하십시오. - 20cm × 20cm 방사선 필드를 설정 합니다. 치료 소파에 1.0 cm 두께의 조직 등가 볼러스를 놓고 볼러스에 6 개의 웰 플레이트를 놓아 접촉하십시오. 전체 플레이트가 방사장 내에 있는지 확인합니다. 소스 피부 거리를 100cm로 설정합니다.
참고 : 동일한 방사선 량의 플레이트는 동시에 방사 될 수 있습니다. 이 경우 더 큰 방사필드가 필요하며 해당 출력 계수에 따라 MU 수를 다시 계산해야 합니다. 모든 플레이트가 방사장 내에 있는지 확인합니다. - 각 플레이트에 할당된 각 용량을 순서대로 전달합니다.
주의: 선형 가속기는 자격을 갖춘 기술자만 조작할 수 있습니다. 방사선을 멀리하십시오. - 접시를 다시 세포 배양실로 가져 가라. 각 웰에 대해 완성된 배지의 2mL로 배지를 변경합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 5% CO2를 사용하여 37°C에서 배양하였다. 3~5일마다 매체를 변경합니다.
- 얼룩
- 방사선 후 7-10 일, 많은 식민지가 형성되고 너무 커지기 전에 함께 병합된 다음 다음과 같이 염색 및 계산을 수행합니다. 중간 을 제거하고 PBS로 짧게 씻어. 세포를 고치기 위해 각 우물에 4 % 포름 알데히드1 mL을 추가하십시오.
주의: 포름알데히드는 휘발성입니다. 연기 후드에 포름알데히드를 사용하십시오. - 10 분 동안 고정 한 후 포름 알데히드를 제거하고 증류수 2 mL로 각각 2 회 잘 씻으하십시오.
- 각 우물에 1% 크리스탈 바이올렛 얼룩 용액 1 mL을 추가하십시오. 10 분 동안 얼룩. 크리스탈 보라색 얼룩 용액을 제거하고 증류수로 3 회 씻으하십시오. 물을 제거하고 접시를 건조.
- 방사선 후 7-10 일, 많은 식민지가 형성되고 너무 커지기 전에 함께 병합된 다음 다음과 같이 염색 및 계산을 수행합니다. 중간 을 제거하고 PBS로 짧게 씻어. 세포를 고치기 위해 각 우물에 4 % 포름 알데히드1 mL을 추가하십시오.
- 식민지 계산 및 계산
- 50 개 이상의 셀을 가진 식민지의 수를 계산합니다. 50 개 미만의 세포를 가진 작은 식민지를 포함하지 마십시오. 현미경으로 식민지를 확인하여 50 개의 세포로 구성된 식민지의 인상을 얻고 마커 펜으로 접시 바닥에 표시하십시오.
참고 : 우물을 촬영하고 소프트웨어 ImageJ를 사용하면 계수 과정이 용이합니다. - 콜로니 의 수를 종자 된 셀의 수로 나눈 콜로니 형성 효율을 계산합니다. 0 Gy에서 콜로니 형성 효율로 나눈 특정 조사 량에서 콜로니 형성 효율로 생존 율을 계산합니다.
- 용량을 y축으로서 x축 및 생존 분율로서 사용하여, 생존 곡선을 얻을 수 있다. 양성 세포 집단과 음성 세포 집단 사이의 생존 곡선을 비교합니다.
- 50 개 이상의 셀을 가진 식민지의 수를 계산합니다. 50 개 미만의 세포를 가진 작은 식민지를 포함하지 마십시오. 현미경으로 식민지를 확인하여 50 개의 세포로 구성된 식민지의 인상을 얻고 마커 펜으로 접시 바닥에 표시하십시오.
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Representative Results
α2δ1-고 및 α2δ1-로우 A549 세포를분류하였다(도 1A). 일부 마커는 뚜렷한 모집단을 표시할 수 있으며 게이트하기가 쉽습니다. 그러나 일부 마커는 뚜렷한 긍정 및 음수 채우기보다는 높고 낮은 식 패턴을 표시합니다. 이 상황에서, 이소형 제어는 게이팅에 매우 중요합니다. 정렬된 셀에서 α2δ1의 발현은 qPCR에 의해 검증된다. Α2δ1을 인코딩하는 유전자인 CACNA2D1의발현은 α2δ1-저세포에 비해 분류된 α2δ1-높은 세포에서 더 높다(도1B).
구체의 일반적인 형태는 그림 2A에나와 있습니다. 구체 형성 효율은 α2δ1-높음 및 α2δ1-저셀(도2B)에서계산된다. α2δ1-높은 세포는 더 높은 구체 형성 효율을 보였으며, 이는 더 높은 자기 재생 능력을 시사한다. 세포 식민지의 전형적인 이미지는 그림 3A에도시되어 있습니다. 대략 50개의 세포를 가진 식민지는 현미경의 밑에 검토되고 참고로 표시될 수 있습니다. 각 투여량에서 생존 분획을 계산할 수 있고, 생존 곡선은 도 3B에제시된다. α2δ1-높은 세포는 α2δ1-저세포에 비해 방사선에 상대적으로 내성이 있다.
짝을 이루지 않은 양면 학생의 t-시험은 그룹 간의 중요성을 평가하기 위해 수행되었다. p<0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 평균 및 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 유사한 결과를 가진 적어도 3개의 생물학적으로 독립적인 실험에서 대표적인 데이터가 제시된다.
그림 1: A549에서 α2δ1-하이 및 α2δ1-로우 셀 분류. (a) α2δ1 발현의 대표적인 유세포 분석. 세포는 등전형 제어에 기초하여 게이트된다. (B) QPCR에 의한 높고 낮은 집단에서 α2δ1 발현의 확인. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: α2δ1-높및 α2δ1-로우 A549 세포의 구체 형성 분석. (a) 정렬된 α2δ1-높 및 α2δ1-저세포에 의해 형성된 구체의 대표적인 형태(bar= 200 μm). (B) α2δ1-높 및 α2δ1-저세포의 구체 형성 효율. 오류 막대는 SD(***p&0.001)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: α2δ1-높및 α2δ1-로우 A549 세포의 콜로니 형성 분석. (a) 분류된 α2δ1-고 및 α2δ1-로우 셀에 의해 형성된 콜로니의 대표적인 이미지. (B) α2δ1-높 및 α2δ1-저세포의 생존 곡선. 종자세포의 수는 0Gy에 대해 웰당 200개의 세포, 4Gy에 대한 웰당 400개의 세포, 8Gy에 대한 800개의 세포였다. 오류 막대는 SD(**p<, 0.05, ***p & 0.001)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 시험관내 암 세포주에서 CSC의 방독증을 연구하는 방법을 설명합니다. 본 연구에서, α2δ1의 발현은 NSCLC 세포주에서 연속적이다. 따라서 게이팅은 이소타입 제어를 기반으로 합니다. 분류하기 전에 α2δ1 발현은 유세포측정에 의해 여러 세포주에서 검사되고 QPCR 또는 웨스턴 블롯에 의해 검증되어야 한다. 유세포측정법에 의해, 형광 현미경하에서 형광을 관찰하거나, 또는 QPCR(선별 후)에 의해 분류된 α2δ1 발현을 재분석하는 것이 좋습니다.
구체 형성 분석은 자기 재생 능력을 평가하는 간단한 방법이며, 이는 가설 CSC를 예비적으로 특성화하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 신경교종 또는 유방암 세포에서 줄기 세포를 특성화하기 위해 신경구 또는 유방구를 배양하는 데 사용되었으며, 상기 공식은 다른 유형의 암배양으로변형되어 4,6,10. EGF 및 bFGF는 혈청이 없는 배지에서 줄기 세포의 자가 재생을 지원할 수 있다; 그러나, 기본 매체 및 성장 인자는 다른 세포 모형을 배양하기 위해 다를 수 있습니다. 반고체 배지는 구체가 함께 클러스터링보다는 세포 증식에 의해 형성되도록 세포를 고정시키는 데 사용됩니다. 초저 부착 플레이트는 구 형태학을 유지하기 위해 실험에 사용됩니다. 더욱이, CSC가 구배 배양 후 농축됨에 따라, 구체가 수집, 소화되고, 이차 구체 형성을 위해시드될 때, 구체 형성 효율은 후속 직렬 전파 9,10에서증가할 가능성이 있다. CSC를 특성화하기 위한 보다 엄격한 기준은 일련의 분류된 양성 및 음성 세포가 면역 결핍 마우스에 피하 주사되는 일련의 희석 분석실험을 제한하는 생체 내 이며, 그 다음에는 종양성 세포의 주파수를 양성 및 음세포 집단은10,14로계산됩니다. 가설암 줄기세포 마커가 구형 분석에 의해 확인되는 경우, 생체 내 특성 제한 희석 분석법을 사용하는 것이 좋습니다.
이 연구에서 CSC의 방과성 평가. 식민지 형성 분석은 방과민성을 평가하는 고전적인 방법입니다. 중요 병렬 우물에서 동일한 수의 셀을 시드. 각 웰에 첨가된 셀 현탁액의 부피가 100 μL 이상인지 확인하기 위해 mL당 셀 수를 적당한 범위로 조정한다. 볼륨이 너무 작으면 오류가 증가할 수 있습니다. 세포 방사선의 경우, 1cm 높이의 배지가 투여량 축적을 위해 첨가되고, 조직 과 동등한 볼루스가 투여 량 백스캐터용 플레이트 아래에 놓입니다. 연구원은 세포 방사선 모형을 설치하고 복용량을 계산하기 위하여 방사선 물리학자 및 기술자를 참조하는 것이 좋습니다.
이 원고는 CSC의 방과성 연구를 위한 초기 몇 단계를 제공합니다. 추가 적인 기계장치 연구 결과는 DNA 손상 복구, 반응성 산소 종의 정리, 세포 주기 체포 등과 관련있는 단백질을 관련시킬 수 있습니다15. 이러한 실험은 다량의 세포가 필요합니다. 따라서, 세포의 많은 요리가 준비될 필요가 있다. CSC 유전자의 과발현 또는 녹아웃/녹다운은 또한 CSC가 방사성성을 얻는 방법에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.
이 방법은 잠재적으로 암 조직에 있는 CSC를 확인하기 위하여 적용될 수 있습니다. Zhang 외. NSCLC 외과 샘플에서 CD166 양성 린 음성 세포를 분리하는12. 조직은 멸균 블레이드로 다진 효소 칵테일로 소화되었다. 세포 스트레이너를 통과하여 수집된 세포는 선별을 위해 표지된 다음, 구형 형성 분석및 생체 내 희석 분석법을 특징으로 하였다. α2δ1의 경우, 간세포암 수술 조직 및 소세포 폐암 환자 유래 이종이식 조직10,16에서CSC를 분리하는 것으로 보고되었다. 분석에 필요한 세포의 수가 많다는 것을 고려할 때, 생검 또는 순환 종양 세포에서 CSC를 분리하는 것은 상대적으로 어렵다. 양자택일로, 생검의 단면도를 염색하는 것은 잠재적으로 종양에 있는 CSC의 존재를 위한 단서를 제공할 수 있습니다. 그러나, 이 추정 적용은 참을성 있는 조직 및 임상 데이터에서 평가될 필요가 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81402535 및 81672969)과 국가 핵심 연구 개발 프로젝트 (2016YFC0904703)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
