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Immunology and Infection

Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

Lo sviluppo di un coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF) è nuovo per l'eliminazione di anticorpi nocivi. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi della molecola DCAF1, che può bloccare selettivamente l'anticorpo 4G2 per eliminare l'effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi durante l'infezione da virus Dengue.

Abstract

L'eliminazione di anticorpi nocivi dagli organismi è un approccio prezioso per l'intervento di malattie associate agli anticorpi, come la febbre emorragica dengue e le malattie autoimmuni. Poiché migliaia di anticorpi con epitopi diversi circolano nel sangue, nessun metodo universale, ad eccezione del coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF), è stato segnalato per colpire specifici anticorpi nocivi. Lo sviluppo di molecole DCAF dà un contributo significativo al progresso della terapia mirata, che sono stati dimostrati per eliminare l'effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi (ADE) in un modello di infezione del virus Dengue (DENV) e per aumentare l'acetilcolina l'attività recettore in un modello di myasthenia gravis. Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di una molecola DCAF (DCAF1), che può bloccare selettivamente l'anticorpo 4G2 per attenuare l'effetto ADE durante l'infezione da virus Dengue e illustrare il legame dell'anticorpo DCAF1-4G2 da un saggio ELISA. Nel nostro metodo, la DCAF1 è sintetizzata dalla coniugazione di un derivato idrossizzante di un peptide Fc-III e un ricombinante espresso lungo elicoia con sequenza antigenica attraverso la legatura chimica nativa (NCL). Questo protocollo è stato applicato con successo a DCAF1 e ad altre molecole DCAF per colpire i loro anticorpi cognati.

Introduction

Gli anticorpi svolgono un ruolo importante nella risposta immunitaria umorale per la neutralizzazione di batteri e virus patogeni1. Tuttavia, alcuni anticorpi presentano impatti nocivi per gli organismi, come anticorpi cross-reattivi nell'effetto ADE durante l'infezione Da DENV e anticorpi sovrareattivi nella mioasthenia gravis, che è una malattia autoimmune2,3. L'effetto ADE è mediato dagli anticorpi cross-reattivi che rendono il ponte per collegare DENV e il recettore Fc presentando le cellule4,5, mentre la mioastenia gravis è causata dagli anticorpi eccessivi che attaccano i recettori dell'acetilcolina tra le giunzioni cellule-cellule nel tessuto muscolare6,7. Sebbene siano stati sviluppati approcci parzialmente efficaci per il trattamento di queste malattie8,9, senza dubbio l'eliminazione diretta di questi anticorpi nocivi farebbe progressi per gli interventi.

Recentemente, le molecole DCAF, che hanno gruppi dual-funzionali, sono state sviluppate per il blocco mirato degli anticorpi10. DCAF è un lungo peptide composto da 3 parti: 1) una parte dell'antigene in grado di riconoscere specifiche le sostanze anticorpi cognati, 2) un tag Fc-III o Fc-III-4C per legare fortemente alla regione Fc dell'anticorpo per inibire il recettore Fc o proteine componenti del complemento , 3) un lungo linker con elica a z che coniuga questi due gruppi funzionali10. La parte del linker, progettata dal dominio Moesin FERM, è stata ottimizzata dal software Rosseta per garantire che la parte antigene e la parte Fc-III in una molecola DCAF possano legarsi contemporaneamente alle regioni Fab e Fc di IgG. Quattro molecole DCAF sono state sintetizzate per colpire 4 diversi anticorpi, tra cui DCAF1 è stato utilizzato per eliminare l'anticorpo 4G2, che è un anticorpo cross-reattivo durante l'infezione da DENV per contribuire all'effetto ADE; e DACF4 è stato progettato per il salvataggio dei recettori dell'acetilcolina bloccando l'anticorpo mab35 in myasthenia gravis10.

Nel presente studio, preso DCAF1 come esempio, abbiamo mostrato i protocolli per la sintesi della molecola DCAF e la rilevazione dell'interazione tra una DCAF e il suo anticorpo cognato. La DCAF1 è semi-sintetizzata dall'approccio NCL11,12,13,14, che coniuga il derivato dell'iddrina di un peptide Fc-III e le parti linker-antigene espresse insieme. L'approccio NCL ha vantaggi significativi rispetto alla sintesi completamente chimica e all'espressione completamente ricombinante per la sintesi DCAF1, perché entrambi questi metodi portano a una bassa resa e ad un costo elevato. L'approccio attuale non è solo il modo più conveniente per ottenere l'intera lunghezza DCAF, ma può anche mantenere la conformazione della parte del linker simile alla sua forma nativa. Poiché diverse molecole DCAF hanno sequenze simili ad eccezione delle parti dell'antigene, i nostri metodi per la sintesi DCAF1 e l'analisi di interazione tra gli anticorpi DCAF1 e 4G2 possono essere applicati ad altre molecole DCAF per bloccare mirati anche i loro anticorpi cognati.

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Protocol

1. Sintesi chimica del derivato dell'idzina di un peptide Fc-III

  1. Conversione della resina 2-Cl-(Trt)-Cl in resina 2-Cl-(Trt)-NHNH2
    1. Pesare 625 mg di resina 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) in un recipiente di sintesi peptide da 25 ml.
    2. Aggiungere 5 mL di N,N-dimethylformamide (DMF) alla resina dalla parte superiore del vaso, mettere il tappo indietro, scuotere delicatamente il vaso per 15 s e quindi scolarlo. Ripetere il lavaggio DMF per altre due volte.
    3. Aggiungere 5 mL di diclorometano (DCM) al recipiente, rimettere il tappo, scuotere delicatamente il recipiente per 15 s e quindi scolarlo. Ripetere il lavaggio DCM per altre due volte.
    4. Ripetere il passaggio 1.1.2 tre volte.
    5. Utilizzare 6 mL del 50% (vol/vol) DMF/DCM per gonfiare la resina per 30 min, quindi scolarla.
    6. Trasferire 6 mL 5% (vol/vol) NH2NH in DMF al recipiente di reazione, scuotere la miscela a 120 giri/mm, 30 gradi centigradi per 30 min, quindi drenare la soluzione con la pompa a vuoto.
      NOTA: Aggiungere 0,3 mL di idrato di idzina a 5,7 mL di DMF per ottenere il 5% (vol/vol) NH2NH2. Preparare appena NH2NH2 prima dell'uso.
      AVVISO: L'idrato di idorzina è una sostanza pericolosa e può causare il cancro. Indossare un camice da laboratorio, guanti e una maschera. Eseguire gli esperimenti in una cappa di fumi.
    7. Aggiungere 5 mL di DMF al recipiente, agitarlo delicatamente per 15 s e quindi scolarlo.
    8. Ripetere il passaggio 1.1.6, quindi lavare la resina ripetendo i passaggi 1.1.2-1.1.4 per due volte.
    9. Aggiungere al recipiente 6 mL del 5% (vol/vol), agitarlo delicatamente per 10 min e quindi scolarlo.
      NOTA: Questo passaggio è molto importante per garantire che i siti non reagiti sulla resina siano limitati.
    10. Lavare accuratamente la resina ripetendo i passaggi 1.1.2-1.1.4.
    11. Aggiungere 5 mL di DCM alla resina, agitare delicatamente per 15 s e quindi scolarlo per ottenere 2-Cl-(Trt)-NHNH2 resina.
      NOTA: la resina diventa verde o giallo quando la sostituzione ha esito positivo.
  2. Allungamento del peptide
    1. Aggiungere 1 mmol di Fmoc-Ala-OH (934 mg) e 0,95 mmol di 1-[bis(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] pirdinio hexafluorospfatio 3-ossido (HATU) (360 mg) in un tubo da 5 mL contenente 3 mL.
      AVVISO: l'esposizione all'HATU può causare una reazione allergica. Indossare un camice da laboratorio, guanti e una maschera.
    2. Aggiungere 2 mmol di N,N-diisopropylethylamine (DIEA) (0,36 mL) alla soluzione dissolta e vortice per 0,5-1 min.
      NOTA: Fase critica: L'attivazione non dovrebbe richiedere più di 5 min, poiché gli aminoacidi attivati si isomerizzano dalle forme O più attive alle forme N meno attive nel tempo.
    3. Aggiungere l'Fmoc-Ala-OH attivato al recipiente di reazione contenente la resina 2-Cl-(Trt)-NHNH2, preparata dal punto 1.1. Agitare delicatamente a 120 giri/m, 30 gradi centigradi per 20 min in uno shaker a temperatura costante, quindi scolare la soluzione con la pompa a vuoto.
    4. Aggiungere 5 mL di DMF per lavare la resina, agitarla delicatamente per 15 s e quindi scolarla.
    5. Aggiungere 1 mmol di Fmoc-Ala-OH (934 mg) e 0,95 mmol di 2-(6-cloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluororphosphate (HCTU) (390 mg) in un tubo da 5 mL contenente 3 mL.
      AVVISO: L'esposizione all'HCTU può causare una reazione allergica. Indossare un camice da laboratorio, guanti e una maschera.
    6. Aggiungere 2 mmol di DIEA (0,36 mL) al tubo e vortice per 0,5-1 min per scioglierlo.
    7. Aggiungere il Fmoc-Ala-OH attivato al recipiente di reazione. Agitare delicatamente a 120 giri/mm, 30 gradi centigradi per 40-60 min in uno shaker a temperatura costante, quindi scolare la soluzione con pompa a vuoto.
    8. Lavare la resina ripetendo i passaggi 1.1.2-1.1.4.
    9. Aggiungere 4 mL di 20% (vol/vol) piperidina in DMF alla resina, agitare delicatamente per 5 min a temperatura ambiente e quindi scolare la soluzione.
      AVVISO: La piridina è altamente infiammabile e tossica. Eseguire gli esperimenti in una cappa di fumi.
    10. Aggiungere altri 4 mL di 20% (vol/vol) piperidina in DMF alla resina, agitare delicatamente per 15 min a temperatura ambiente e quindi scolare la soluzione.
    11. Seguire i passaggi 1.2.1-1.2.10 per accoppiare e deproteggere Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH e Fmoc-Ala-OH. Ripetere i passaggi 1.2.5-1.2.10 per accoppiare e deproteggere Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH e Fmoc-Asp-OH.
    12. Ripetere i passaggi da 1.1.2-1.1.4 per lavare accuratamente la resina.
    13. Ripetere il passaggio 1.1.3 per lavare la resina e asciugarla sottovuoto per 5 min.
  3. Cleavage del peptide greggio Fc-III derivato dall'idzina
    1. Aggiungere 12 mL di cocktail acido trifluoroacetica (TFA)/2,2'-(ethylenedioxy)diethanethiol (DODT)/triisopropylsilane (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) alla resina, e poi usare uno shaker a temperatura costante per fendere il peptide dalla resina a 200 giri al secondo, 37 s circa 2 h. Filtrare la miscela in un tubo di centrifuga di 50 mL.
    2. Aggiungere 1 mL di cocktail nella resina per lavarla e raccogliere il filtrato nel tubo centrifugato da 50 mL. Ripetere due volte.
    3. Concentrare la miscela a 2 mL da un rotore vaper in un cofano di fumi, quindi aggiungere 20 mL di etere di etilio preraffreddato nel tubo per precipitare peptidi grezzi.
      NOTA: L'etere anidroso deve essere preraffreddato a 0 gradi centigradi per evitare un violento rilascio di calore, che può causare reazioni laterali del peptide grezzo.
    4. Incubare le precipitazioni del peptide a -20 gradi centigradi per 1-2 h.
    5. Centrifuga a 5.000 x g, 4 gradi centigradi per 10 min e rimuovere il solvente dal tubo di centrifuga con attenzione.
    6. Aggiungere 20 mL di etere dietile preraffreddato nel tubo due volte secondo i passi 1.3.3-1.3.5 per lavare la precipitazione. Asciugare all'aria il prodotto peptide in un orologio-vetro per circa 15 min. Conservare i peptidi grezzi secchi a 4 gradi centigradi per ulteriori analisi.
  4. Purificazione del derivato dell'iddrina di un peptide Fc-III
    1. Utilizzare il sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per purificare il peptide da una elusione a gradiente di 30 min (0-1 min, 5% B; 1-20 min, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) ad una velocità di flusso di 1 mL/min.
      NOTA: la colonna è in ID 4,6 mm, lunghezza 250 mm, confezionata con resina C-18. La fase A mobile consisteva dello 0,1% TFA in acqua, e la fase mobile B consisteva in 100% acetonitrile e 0,1% TFA.

2. Espressione proteica e purificazione delle parti del linker e dell'antigene

  1. Costruzione plasmide
    1. Sintetizzare l'intera sequenza genica che può esprimere SUMO-linker-antigen (vedere Tabella dei materiali).
    2. Tagliare 10 ng di PET-28a vettore vuoto e 50 ng del frammento di DNA SUMO-linker-antigen sintetizzato utilizzando NcoI e XhoI in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 3 h.
    3. Purificare il vettore digerito a doppio enzima e il frammento di DNA da DNA Gel Extraction Kit.
    4. Aggiungete 5 le V di DNA digerito, 5 ll di vettore digerito, 1-L di legaolio di DNA T4, 2 l una di 10x buffer di ligase e 7 luna di ddH2O a un tubo di reazione, quindi incubarlo durante la notte a 16 gradi centigradi.
    5. Mescolare 10 l del prodotto di ligazione dal passo 2.1.4 a 100 - L di celle competenti (DH5) e metterlo su un bagno di ghiaccio per 30 min. LB mezzo liquido (senza antibiotici) al tubo e agitarlo a 37 , 180 rpm per 1 h. Coprire le cellule competenti su una piastra LB Kanamicina per renderle equamente distribuite, e mettere la piastra in un'incubatrice di 37 gradi centigradi durante la notte.
    6. Scegli 5 colonie singole dalla piastra e coltura i batteri in 5 mL di LB medio in una provetta utilizzando uno shaker 37 .
    7. Estrarre i plasmidi dai batteri raccolti dal punto 2.1.6 utilizzando il kit di estrazione Plasmid.
    8. Inviare i plasmidi per il sequenziamento genico e scegliere la colonia positiva che può esprimere la proteina di fusione SUMO-linker-antigen. Trasformare il plasmide positivo in celle competenti BL21(DE3)plysS dopo il passaggio 2.1.5.
  2. Purificazione delle proteine
    1. Scegli una singola colonia di trasformativi da passo 2.1.7 in 5 mL di LB mezzo liquido contenente kanamycin (50 g/mL). Agitare le colture durante la notte a 200 giri/min, 37 gradi centigradi.
    2. Inoculare 1 L di preriscaldato lB medio contenente kanamycin (50 g/mL) in una fiaschetta con 5 mL delle colture notturne, e crescere a 37 gradi centigradi con vigoroso agitazione, fino a quando l'OD600 è 0,6.
    3. Aggiungere l'isopropile "IPTg-thiogalactoside" (IPTg) nel mezzo fino alla concentrazione finale di 0,4 mM, e agitare il pallone a 200 rpm durante la notte a 20 gradi centigradi.
      NOTA: La bassa temperatura per l'induzione delle proteine è importante per evitare l'inclusione della formazione del corpo, quindi assicurati che la temperatura non sia superiore a 22 gradi centigradi.
    4. Dopo aver raccolto le cellule, aggiungere 50 mL di tampone di lisi ai pellet cellulari per rimettere in sospensione le cellule. Sonicare la cellula lisa due volte per 5 min a 200 W, ultrasuoni 3 s, intervallo 3 s sul ghiaccio. Centrifugaa a 15.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi per raccogliere i supernatanti.
      NOTA: Il buffer di lisi è composto da 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo. Regolare il valore di pH su 8.0 utilizzando NaOH.
    5. Aggiungere 2 mL del 50% Ni-NTA Sephorase equilibrato, con cuscinetto di lisi, ai supernatanti cancellati e mescolare delicatamente agitando (200 rpm su uno shaker rotante) a 4 gradi centigradi per 1 h.
    6. Caricare la miscela lysate e Ni-NTA in una colonna con il tappo inferiore della presa, e rimuovere il tappo inferiore e scartare il flusso della colonna.
    7. Lavare tre volte con 6 mL di tampone di lavaggio, quindi eluire la proteina mirata 3 volte con 1,5 mL di tampone di eluizione. Raccogliere l'eluate in un tubo.
      NOTA: Il buffer di lavaggio è composto da 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole. Regolare il valore di pH su 8.0 utilizzando NaOH. Il buffer di eluizione è composto da 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole. Regolare il valore di pH su 8.0 utilizzando NaOH.
    8. Mettere l'eluato in un sacchetto di dialisi in 1 L di 50 m PBS a 4 gradi centigradi per disinserire la proteina. Sostituire il nuovo salina con buffer fosfato (PBS) per 3 volte.
  3. Cleavage del tag SUMO
    1. Aggiungere 2 mL di piccola ubiquitina-like Modifier (SUMO) proteina etichettata alla concentrazione di 1 mg/mL, 1 mL di SUMO Protease (vedi Tabella dei materiali),1 mL di 10x SUMO Protease Buffer e 6 mL di ddH2O per preparare la soluzione di reazione.
      NOTA: la concentrazione di proteine del tag SUMO è di circa 1 mg/mL. Concentrazioni eccessive dopo la digestione enzimatica possono causare la coagulazione della proteina.
    2. Incubare il composto per 12-16 h a 4 gradi centigradi.
    3. Centrifugare la miscela a 15.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e scartare gli aggregati. Aggiungere 0,5 mL del 50% di liquami Ni-NTA, equilibrato da 50 mM PBS, ai 10 mL sgombonati supernatanti e mescolare delicatamente agitando (200 giri (200 rpm su uno shaker rotante) a 4 gradi centigradi per 60 min.
    4. Caricare la miscela lisata e Ni-NTA in una colonna con il tappo inferiore della presa. Rimuovere il tappo inferiore e quindi salvare il flusso attraverso in un tubo di centrifuga 15 mL.
      NOTA: la proteina SUMO suocera si sta legando alla colonna. La parte linker-antigen, che inizia con Cys per la reazione NCL, è nel flusso attraverso.
    5. Centrifugare il flusso fino a 15.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e scartare gli aggregati. Purificare la parte linker-antigen utilizzando HPLC con una elusione a gradiente di 25 min (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) ad una velocità di flusso di 1 mL/min.
      NOTA: la colonna è in ID 4,6 mm, lunghezza 250 mm, confezionata con resina C-18. La fase A mobile consisteva dello 0,1% TFA in acqua, e la fase mobile B consisteva in 100% acetonitrile e 0,1% TFA.
    6. Raccogliere il prodotto purificato dall'HPLC, quindi congelare durante la notte per ottenere il prodotto linker-antigene.

3. Assemblaggio di DCAF1 mediante legatura chimica nativa

  1. Coniugare la parte di peptide fc-III e linker-antigene
    1. Pesare 1,8 mg (1 mol) di idzina derivato di un peptide Fc-III in un tubo EP da 2 mL e aggiungere 0,8 mL di 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) soluzione per dissolverlo mediante vortice.
      NOTA: 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) soluzione viene preparata regolando il valore di pH con HCl o NaOH.
      PROCEDIMENTI: NaOH e HCl sono altamente corrosivi. Indossare un camice da laboratorio, guanti e una maschera.
    2. Dopo aver centrifugato il tubo a 7.200 x g per 1 min a temperatura ambiente, mettere il tubo in un bagno di sale di ghiaccio e utilizzare la mescolatura magnetica per agitare delicatamente la soluzione per 15 min.
    3. Aggiungere alla soluzione 40 -L di 0,5 M NaNO2 per ossidare il gruppo di iddrina. Agitare delicatamente la soluzione per altri 15 min nel bagno di sale di ghiaccio.
    4. Pesare e aggiungere 11 mg di parte purificata linker-antigen preparata a partire dal passo 2.3 e 13.6 mg di 4-mercaptofenilifeoliacetica acida (MPAA) nel tubo di reazione nel bagno di sale di ghiaccio, mescolare per 5 min, quindi regolare il valore di pH a 6.8-7.0 a temperatura ambiente con 6 M NaOH.
      NOTA: regolare il valore del pH su neutro è il passaggio critico per avviare la reazione di legatura.
    5. Dopo 12 h, aggiungere al sistema di reazione 0,4 mL di 0,1 M (2 carboxyethyl) la soluzione neutra TCEP (Neutro) (TCEP) e mescolare per 20 min per terminare la reazione.
      NOTA: 0,1 M TCEP soluzione neutra (pH 7.0) viene preparata sciogliendo TCEP in 6 M GnHCl in 0.2 M NaH2PO4 (pH 3.0) soluzione e utilizzando NaOH per regolare il valore di pH a 7.0.
    6. Centrifugare il tubo a 15.000 x g per 10 min, quindi analizzare e purificare il prodotto di ligazione con HPLC con una eluizione di gradiente di 26 min (0-1 min, 5% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85 B% ad una velocità di flusso di 1 min/. Il rendimento previsto per la reazione di legatura è superiore al 50%.
      NOTA: la colonna è in ID 4,6 mm, lunghezza 250 mm, confezionata con resina C-18. La fase A mobile consisteva dello 0,1% TFA in acqua, e la fase mobile B consisteva in 100% acetonitrile e 0,1% TFA.
  2. Desulfurizzazione del coniugato
    1. Sciogliere il coniugato (3,4 mg, 0,3 ml) preparato a partire dal passo 3,1,6 su 50 - L di 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) soluzione.
    2. Aggiungere 50 l di 1 M TCEP, 10 ll di tBuSH e 5 -L di 0,1 M VA-044 soluzione alla miscela di cui sopra.
      NOTA: 0,1 M Soluzione VA-044 viene preparata sciogliendo 9,7 mg di polvere VA-044 in 0,3 mL di 6 M GnHCl nella soluzione 0.2 M NaH2PO4 (pH 7.0). La soluzione VA-044 deve essere preparata appena prima dell'uso, in quanto VA-044 è facilmente ossidato dall'esposizione all'aria.
    3. Regolare il pH finale della soluzione a 6,9 e mantenere il solutiomat 37 gradi con agitazione per circa 5 h.
    4. Centrifugare il tubo a 15.000 x g per 10 min e rimuovere la sostanza insolubile. Analizzare e purificare il prodotto di ligazione con HPLC con una elusione a gradiente di 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) ad una velocità di flusso di 1 mL/min. Il rendimento previsto per la reazione di desulfurazione è di circa il 40%.
      NOTA: la colonna è in ID 4,6 mm, lunghezza 250 mm, confezionata con resina C-18. La fase A mobile consisteva dello 0,1% TFA in acqua, e la fase mobile B consisteva in 100% acetonitrile e 0,1% TFA.
  3. Rimozione di Acm per ottenere il prodotto finale DCAF1
    1. Sciogliere il peptide (1,35 mg, 0,11 mol) preparato a partire dal punto 3,2,4 in 200 - L di 32 mS AgOAc, quindi mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 4 h.
    2. Aggiungere 3 -L di 1M Dithiothreitol (DTT) in 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) soluzione per convertire i tiolati d'argento sul peptide in thiols liberi.
    3. Dopo aver mescolato violentemente per 1 min, centrificare il tubo a 15.000 x g per 10 min per scartare la sostanza insolubile. Analizzare e purificare il prodotto finale con HPLC con una eluizione di gradiente di 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) ad una velocità di flusso di 1 mL/min. Il rendimento previsto per la reazione di deprotection Acm è di circa il 30%.
      NOTA: la colonna è in ID 4,6 mm, lunghezza 250 mm, confezionata con resina C-18. La fase A mobile consisteva dello 0,1% TFA in acqua, e la fase mobile B consisteva in 100% acetonitrile e 0,1% TFA.
    4. Dopo la purificazione dell'HPLC, congelare il prodotto finale durante la notte e sciogliere la polvere in PBS (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8.0). Centrifugare il tubo a 15.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e scartare il pellet.
    5. Regolare le concentrazioni del prodotto finale (dal passaggio 3.4) e della parte linker-antigen (dal passaggio 2.3.6) a 10 m, registrare gli spettri di dicroismo circolare (CD) da 260 a 195 nm di questi due prodotti utilizzando uno spettrometro CD a 25 gradi centigradi con lunghezza del percorso di 1 mm.
      NOTA: gli spettri CD sono utilizzati per dimostrare la quantità di struttura elicoidale nel prodotto finale è simile a quella del ricombinante espressa.

4. Rilevamento dei prodotti mediante spettrometria di massa

  1. Separare il prodotto da ogni reazione chimica con un'eluzione di gradiente di 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) ad una velocità di flusso di 0,300L/min con una min con una percentuale di 0,300L nano-HPLC che si interfaccia direttamente con lo spettrometro di massa ad alta risoluzione.
    NOTA: La colonna analitica è in 75 ID, 150 mm di lunghezza, imballata con resina C-18. La fase mobile A consisteva dello 0,1% dell'acido formica nell'acqua, e la fase mobile B consisteva nel 100% di acetonitrile e dello 0,1% per l'acido mitico.
  2. Azionare lo spettrometro di massa in modalità full-scan e impostare l'intervallo m/z a 300-2.000 e la risoluzione a 60.000.
  3. Aprire i dati degli spettri di massa e trovare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica è preformata con successo.

5. Analisi dell'interazione tra gli anticorpi DCAF1 e 4G2

  1. Rivestire una piastra di microtiteri da 96 pozzetti con 1 pmol anti-GST anticorpo (vedi Tabella dei Materiali)in 100 - L di tampone/pozzo di rivestimento, sigillare la piastra e incubarla a 4 gradi durante la notte su uno shaker.
  2. Bloccare ogni pozzo con 200 - L dell'1% di BSA in PBS, sigillare la piastra e incubarla a temperatura ambiente per 1 h su uno shaker.
  3. Lavare ogni pozzo 4 volte utilizzando PBS con 0.05% Tween 20.
  4. Aggiungere la proteina antigene fusa GST (0,05 pmol in 100 gradi di soluzione di blocco) ai pozze, sigillare la piastra e incubare per 2 h a temperatura ambiente.
    NOTA: la proteina antigene fusa tramite GST è espressa in batteri e purificata da GSH Sepharose.
  5. Ripetere il passaggio 5.3 per lavare la piastra.
  6. Aggiungere 1 pmol 4G2 anticorpo o 1 pmol 4G2 anticorpo più gli altri ligando: antigene, Fc-III o DCAF1 a quantità di serie (0.1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 10 pmol e 1000 pmol e 1000 pmol) in 100 : L di soluzione di blocco/bene, sigillare la piastra e incubare 2 h in camera.
  7. Ripetere il passaggio 5.3 per lavare la piastra.
  8. Aggiungere Anti-mouse IgG, anticorpo HRP-linked (1:20,000 diluizione) in 100 - L di soluzione di blocco/bene, sigillare la piastra e incubare 30 min a temperatura ambiente su uno shaker.
  9. Lavare ogni pozzo 6 volte utilizzando PBS con 0.05% Tween 20.
  10. Mescolare il reagente TMB A e B 1:1 in volume immediatamente prima dell'uso, aggiungere 100 l/po, quindi incubare 30 min a temperatura ambiente al buio.
  11. Aggiungete 100 l/po di soluzione di arresto e utilizzate un lettore di lastre per misurare i valori OD450 per ogni bene entro 30 min.

6. ELISA: il saggio dell'interazione tra la molecola Fc-III e IgG

  1. Rivestire una piastra di microtiteri da 96 pozzetti con 1 pmol anti-CA anticorpo (vedi Tabella dei Materiali)in 100 - L di tampone/pozzo di rivestimento, sigillare la piastra e incubarla a 4 gradi durante la notte su uno shaker.
  2. Ripetere i passaggi da 5.2 a 5.3.
  3. Aggiungere la proteina FFC-III o Fc-III-4C CA fusa (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 e 1 pm ol in 100 l di soluzione di blocco) ai pozze, sigillare la piastra e incubare per 2 h a temperatura ambiente.
    NOTA: la proteina CA fusa Fc-III o Fc-III-4C è espressa in batteri e purificata da Ni-NTA.
  4. Ripetere i passaggi da 5.7 a 5.11 e controllare i risultati.

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Representative Results

Il diagramma di flusso per il percorso di sintesi per legatura chimica nativa in questo articolo è illustrato nella Figura 1. Le figure 2-6 mostrano i cromatogrammi (A) e gli spettri di massa (B) del derivato di iddrina sintetizzato chimico di un peptide Fc-III, linker espresso ricombinante e parte dell'antigene, il prodotto purificato dalla reazione NCL, il purificato reazione di desulfurazione e del prodotto finale purificato DCAF1, rispettivamente. I cromatogrammi mostrano che le purifiche di tutti i prodotti sono superiori al 90%, mentre gli spettri di massa indicano il peso molecolare del prodotto dopo ogni reazione. I pesi molecolari deconvolutivi sono mostrati anche nelle figure 3-6, che riflettono il peso molecolare accurato di ogni prodotto. La figura 7 mostra il principio del saggio ELISA (A) e i risultati del peptide antigene, Fc-III e DCAF1 che inibiscono concorrenzialmente il legame degli anticorpi 4G2. Sia il peptide antigene che la DCAF1 bloccano significativamente il legame 4G2, mentre il peptide Fc-III non influisce sull'interazione antigene-anticorpo.

Figure 1
come illustrato nella Figura 1. Flusso di lavoro del metodo di legatura chimica nativa per la semisintesi della molecola DCAF1.
In primo luogo, il derivato dell'iddrina di un peptide Fc-III è ottenuto dalla sintesi di peptidi a fase solida. Quindi, il tag SUMO ha fuso il linker e la parte dell'antigene viene espresso e purificato dai batteri, seguito dalla scissione del tag SUMO. Dopo la reazione NCL dei due frammenti, il prodotto subisce la desulfurizzazione e la rimozione di gruppi di Acm per diventare molecola DCAF1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. Lo cromatogramma e lo spettro di massa del derivato dell'iddrina di un peptide Fc-III.
Questa figura mostra che il profilo LC del peptide purificato (A) e il picco mono-isotopo a m/z 915.92 corrispondevano al peptide caricato duple (B). Questa cifra è stata modificata dal riferimento 10, Figura 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
come illustrato nella figura 3. Il cromatogramma e lo spettro di massa della parte del linker e dell'antigene.
Questa figura mostra il profilo LC del frammento purificato (A) e il peso molecolare disvoluzionale di questo frammento viene calcolato come 9429.0 dallo spettro di massa (B). Questa cifra è stata modificata dal riferimento 10, Figura S2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
come illustrato nella Figura 4. Il cromatogramma e lo spettro di massa del prodotto coniugale dalla reazione NCL.
Questa figura mostra il profilo LC che monitora il prodotto di ligazione a 0 h (superiore), 12 h (al centro) e il peptide purificato (in basso) (A) e il peso molecolare deconvolutivo di questo prodotto è calcolato come 11227.0 dallo spettro di massa (B). Questa cifra è stata modificata dal riferimento 10, Figura S2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
come illustrato nella Figura 5. Il cromatogramma e lo spettro di massa del prodotto dopo la reazione di desulfurizzazione.
Questa figura mostra il profilo LC del prodotto purificato (A) e il peso molecolare disvoluzionale di questo prodotto è calcolato come 11195.0 dallo spettro di massa (B). Questa cifra è stata modificata dal riferimento 10, Figura S2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
come illustrato nella Figura 6. Il cromatogramma, lo spettro di massa e gli spettri CD della molecola DCAF1.
Questa figura mostra il profilo LC del DCAF1 purificato (A), il peso molecolare dissovoluzionale di questa molecola calcolato come 11053.0 dallo spettro di massa (B) e gli spettri CD del prodotto finale (linea solida) e la parte linker-antigen ( dash) in FCAF1. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 10, Figura 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
come illustrato nella Figura 7. Saggio ELISA della molecola DCAF1.
(A) Il flusso di lavoro del saggio ELISA sandwich. Il primo anticorpo anti-GST è rivestito su una piastra del pozzo. Quindi il peptide antigene gST-fuso viene incubato. Quindi viene aggiunto l'anticorpo 4G2 con diverse concentrazioni di DCAF1, antigene o Fc-III per l'analisi colorimetrica. (B) I risultati dell'ELSIA dell'antigene, dell'Fc-III e della DCAF1 dimostrano effetti di inibizione del legame 4G2 utilizzando diverse concentrazioni di ligando. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo qui descrive la semisintesi e il rilevamento di DCAF1 utilizzando l'approccio NCL, come illustrato nella Figura 1. In breve, i due frammenti di DCAF1 sono sintetizzati chimicamente e ricombinantemente espressi, rispettivamente; quindi, la molecola DCAF1 di intera lunghezza viene assemblata, modificata e purificata. Per la sintesi del frammento fc-III derivato da idzina, l'utilizzo di resina a 2 Cl a bassa capacità è molto importante, perché l'alta capacità ha un effetto negativo per la generazione di idzine e porta a una bassa resa del prodotto. La parte del linker e dell'antigene sono espressi con il tag SUMO per due motivi: in primo luogo, il tag SUMO può migliorare la solubilità delle proteine di fusione; in secondo luogo, la proteasi SUMO è una proteasi riconosciuta dalla conformazione, che consente al prodotto rilasciato di iniziare con i residui di Cys per l'ulteriore reazione di legatura. Uno dei passaggi più critici nell'espressione e purificazione delle proteine è la scissione proteasi SUMO. La concentrazione di proteine SUMO tag-fused deve essere regolata alla giusta gamma. Una concentrazione troppo alta o troppo bassa porterebbe all'aggregazione delle proteine o a difficoltà per l'ulteriore purificazione dopo la digestione. Un altro passo critico di questo protocollo è la regolazione del valore di pH durante la reazione NCL, che si basa sullo scambio di tio-ester che dovrebbe avvenire in buffer neutro. Un controllo preciso del valore del pH nel buffer di reazione è utile per migliorare l'efficienza della legatura.

Questo protocollo è adatto per la sintesi di altre molecole DCAF con diverse sequenze di antigeni, perché le sequenze di diverse molecole DCAF sono abbastanza simili e la parte dell'antigene di solito contribuisce poco all'intera struttura e alla natura della DCAF. Per esempio, abbiamo usato questo protocollo per sintetizzare altre tre molecole DCAF per colpire i loro anticorpi cognati. Tra questi, DCAF4 è stato progettato per bloccare l'anticorpo mAb35, che può neutralizzare il recettore dell'acetilcolina e causare gravis di myasthenia in un modello di ratto. Abbiamo usato DCAF4 per ridurre i sintomi clinici nel ratto con mAb35-indotta myasthenia gravis, e salvare il recettore dell'acetilcolina inibendo le proteine componenti del complemento.

L'applicazione della nostra tecnica è limitata da diversi fattori: in primo luogo, la resa della molecola DCAF sintetizzata dall'approccio attuale è bassa (di solito meno del 10%) a causa delle molteplici fasi di purificazione; in secondo luogo, gli anticorpi con determinanti conformazionali sono difficili da colpire dalla DCAF; terzo, la DCAF può indurre una risposta immunitaria extra negli organismi rispetto ai piccoli farmaci composti tradizionali. Prevediamo che l'applicazione di questo protocollo ad altre condizioni patologiche indotte da anticorpi aiuterà a sintetizzare più molecole DCAF per eliminare mirati gli anticorpi nocivi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Tsinghua University-Gates Foundation (n. OPP1021992), la National Natural Science Foundation of China (n. 21502103, 21877068 e 041301475), e il National Key Research and Development Program of China (n. 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Retrazione Numero 151 DCAF terapia mirata anticorpo legatura chimica nativa sintesi di peptidi a fase solida espressione e purificazione delle proteine ELISA
Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)
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Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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