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Immunology and Infection

एंटीजेनिक पेप्टाइड और एफसी-III माइमेटिक्स (डीसीएएफ) के दोहरे-फंक्शनल कंजुगेट द्वारा लक्षित एंटीबॉडी ब्लॉकिंग

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

एंटीजेनिक पेप्टाइड और एफसी-III माइमेटिक्स (डीसीएएफ) के दोहरे-कार्यात्मक संयुग्मी का विकास हानिकारक एंटीबॉडी के उन्मूलन के लिए उपन्यास है। यहाँ, हम DCAF1 अणु के संश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, जो चुनिंदा 4G2 एंटीबॉडी ब्लॉक कर सकते हैं डेंगू वायरस संक्रमण के दौरान एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि प्रभाव को खत्म करने के लिए.

Abstract

जीवों से हानिकारक एंटीबॉडी का उन्मूलन एंटीबॉडी से जुड़े रोगों के हस्तक्षेप के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है, जैसे डेंगू रक्तस्रावी बुखार और ऑटोम्यून्यून रोग। के बाद से विभिन्न प्रतीक के साथ एंटीबॉडी के हजारों रक्त में घूम रहे हैं, कोई सार्वभौमिक विधि, एंटीजेनिक पेप्टाइड और एफसी -III mimetics (DCAF) के दोहरे कार्यात्मक संयुग्मी के अलावा, विशिष्ट हानिकारक एंटीबॉडी को लक्षित करने के लिए सूचित किया गया था. DCAF अणुओं के विकास लक्षित चिकित्सा की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण योगदान देता है, जो एक डेंगू वायरस (DENV) संक्रमण मॉडल में एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि (एडीई) प्रभाव को खत्म करने के लिए प्रदर्शन किया गया और acetylcholine को बढ़ावा देने के लिए एक myasthenia gravis मॉडल में रिसेप्टर गतिविधि. यहाँ, हम एक DCAF अणु के संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (DCAF1), जो चुनिंदा 4G2 एंटीबॉडी को ब्लॉक कर सकते हैं डेंगू वायरस संक्रमण के दौरान ADE प्रभाव क्षीण, और एक ELISA परख द्वारा 4G2 एंटीबॉडी के लिए DCAF1 की बाइंडिंग वर्णन. हमारी विधि में, DCAF1 एक Fc-III पेप्टाइड के एक hydrazine व्युत्पन्न और एक रिकॉमबिनेंट देशी रासायनिक ligation (NCL) के माध्यम से एंटीजेनिक अनुक्रम के साथ लंबे समय से व्यक्त की-हेलिक्स के संयोजन द्वारा संश्लेषित है. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक DCAF1 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य DCAF अणुओं के लिए उनके cognate एंटीबॉडी को लक्षित करने के लिए लागू किया गया है.

Introduction

रोगजनक बैक्टीरिया और वायरस1के तटस्थीकरण के लिए हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एंटीबॉडीज महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . हालांकि, कुछ एंटीबॉडी जीवों के लिए हानिकारक प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं, जैसे डीईएवी संक्रमण के दौरान एडीई प्रभाव में क्रॉस-रिएक्टिव एंटीबॉडी और मायस्थेनिया ग्रेविस में अति-सक्रिय एंटीबॉडी, जो एक ऑटोम्यून्यून रोग2,3है। एडीई प्रभाव पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी है कि पुल DENV और एफसी रिसेप्टर पेश कोशिकाओं को जोड़ने के लिए बनाने के द्वारा मध्यस्थता है4,5,जबकि myasthenia gravis अत्यधिक एंटीबॉडी है कि acetylcholine रिसेप्टर्स हमले के कारण होता है मांसपेशी ऊतक6,7में सेल-सेल जंक्शनों के बीच। यद्यपि इन रोगों के उपचार के लिए आंशिक रूप से प्रभावी दृष्टिकोण विकसित किए गएहैं ,9,निस्संदेह इन हानिकारक एंटीबॉडी के प्रत्यक्ष उन्मूलन से हस्तक्षेपों के लिए प्रगति होगी .

हाल ही में, DCAF अणुओं, जो दोहरी कार्यात्मक समूहों है लक्षित एंटीबॉडीअवरुद्ध 10के लिए विकसित किया गया है. DCAF एक लंबे पेप्टाइड है कि 3 भागों से बना है: 1) एक प्रतिजन हिस्सा है कि विशिष्ट cognate एंटीबॉडी पहचान कर सकते हैं, 2) एक Fc-III या Fc-III-4C टैग दृढ़ता से एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र के लिए बाध्यकारी के लिए या तो Fc रिसेप्टर या पूरक घटक प्रोटीन को बाधित करने के लिए , 3) एक लंबा - हेलिक लिंकर जो इन दो कार्यात्मक समूहों10को संयुग्मी करता है . Linker हिस्सा, Moesin FERM डोमेन से डिजाइन, Rosseta सॉफ्टवेयर द्वारा अनुकूलित करने के लिए एक DCAF अणु में प्रतिजन हिस्सा और Fc-III हिस्सा एक साथ IgG के फैब और एफसी क्षेत्रों के लिए बाध्य कर सकते हैं सुनिश्चित किया गया था. चार DCAF अणुओं को लक्षित करने के लिए संश्लेषित किया गया है 4 अलग एंटीबॉडी, उनमें से DCAF1 4G2 एंटीबॉडी को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो एक पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी DENV संक्रमण के दौरान एडीई प्रभाव में योगदान करने के लिए है; और DACF4 myasthenia gravis10में mab35 एंटीबॉडी अवरुद्ध द्वारा acetylcholine रिसेप्टर्स के बचाव के लिए डिजाइन किया गया था .

वर्तमान अध्ययन में, उदाहरण के रूप में DCAF1 लिया, हम DCAF अणु के संश्लेषण और एक DCAF और उसके cognate एंटीबॉडी के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल दिखाया. DCAF1 एनसीएल दृष्टिकोण11,12 ,13,14, जो एक Fc-III पेप्टाइड और व्यक्त linker-antigen भागों के hydrazine व्युत्पन्न एक साथ conzugates द्वारा अर्द्ध synthesized है. एनसीएल दृष्टिकोण पूरी तरह से रासायनिक संश्लेषण और DCAF1 संश्लेषण के लिए पूरी तरह से पुनः संयोजक अभिव्यक्ति पर महत्वपूर्ण लाभ है, क्योंकि इन तरीकों कम उपज और उच्च लागत के लिए नेतृत्व. वर्तमान दृष्टिकोण न केवल सबसे अधिक लागत प्रभावी तरीका पूर्ण लंबाई DCAF मिल रहा है, लेकिन यह भी linker अपने मूल रूप के रूप में समान भाग की रचना बनाए रख सकते हैं. के बाद से विभिन्न DCAF अणुओं प्रतिजन भागों के अलावा इसी तरह के दृश्यों है, DCAF1 संश्लेषण के लिए हमारे तरीकों और DCAF1 और 4G2 एंटीबॉडी के बीच बातचीत परख अन्य DCAF अणुओं के लिए लागू किया जा सकता है लक्षित ब्लॉक उनके cognate एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से.

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Protocol

1. एक Fc-III पेप्टाइड के हाइड्रैज़ीन व्युत्पन्न के रासायनिक संश्लेषण

  1. 2-Cl-(Trt)-Cl राल को 2-Cl-(Trt)-NHNH2 राल में परिवर्तित करना
    1. वजन 625 मिलीग्राम 2-Cl-(Trt)-Cl राल (0.25 mmol) एक 25 एमएल पेप्टाइड संश्लेषण पोत में.
    2. पोत के ऊपर से राल में एन,एन-डाइमेथिलफॉर्मामाइड (डीएमएफ) के 5 एमएल जोड़ें, टोपी को वापस रखें, 15 एस के लिए बर्तन को धीरे से हिलाएं और फिर इसे छान लें। दो बार के लिए DMF धोने दोहराएँ.
    3. पोत में 5 एमएल डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम) डालें, कैप को वापस रखें, 15 एस के लिए पोत को धीरे से हिलाएं और फिर उसे छान लें। दो बार के लिए डीसीएम धोने दोहराएँ.
    4. चरण 1.1.2 तीन बार दोहराएँ.
    5. 30 मिनट के लिए राल को प्रफुल्लित करने के लिए 50% (vol/vol) DMF/DCM के 6 एमएल का उपयोग करें, और फिर इसे नाली।
    6. 6 एमएल 5% (vol/vol) एनएच2एनएच2 को डीएमएफ में प्रतिक्रिया पोत में स्थानांतरित करें, मिश्रण को 120 आरपीएम पर हिलाएं, 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, और फिर वैक्यूम पंप द्वारा समाधान को छान लें।
      नोट: DMF के 5.7 एमएल में हाइड्रेजीन हाइड्रेट के 0.3 एमएल जोड़ें 5% पाने के लिए (vol/vol) एनएच2एनएच2. उपयोग करने से पहले एनएच2एनएच2 को नए सिरे से तैयार करें।
      चेतावनी: हाइड्रैज़ीन हाइड्रेट एक खतरनाक पदार्थ है और कैंसर का कारण बन सकता है। एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और एक मुखौटा पहनें। एक धूआं हुड में प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं।
    7. पोत में DMF के 5 एमएल जोड़ें, धीरे से इसे 15 s के लिए हिला और फिर इसे नाली.
    8. चरण 1.1.6 दोहराएँ और फिर दो बार के लिए चरण 1.1.2.1.4 दोहरा द्वारा राल धो लें.
    9. पोत में 5% (vol/vol) MeOH/DMF का 6 एमएल जोड़ें, इसे 10 मिनट के लिए हिलाएं और फिर इसे छान लें।
      नोट: यह कदम राल पर unreacted साइटों छाया हुआ है यह सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.
    10. राल को अच्छी तरह से धो लें चरणों को दोहराकर 1.1.2-1.1.4.
    11. राल में डीसीएम का 5 एमएल मिलाकर 15 एस के लिए धीरे से हिलाएं और फिर 2-सीएल-(टीआरटी)-एनएचएनएच2 राल प्राप्त करने के लिए इसे छान लें।
      नोट: प्रतिस्थापन सफल होता है जब राल पीले या हल्के हरे रंग हो जाता है।
  2. पेप्टाइड दीर्घीकरण
    1. Fmoc-Ala-OH (934 mg) का 1 mmol और 0.95 mmol of 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] पाइरिडिनियम हेक्साफ्लोरोफॉस्फेट 3-ऑक्साइड (HATU) (360 mg) एक 5 mL ट्यूब में जोड़ें।
      चेतावनी: HATU के संपर्क में एक एलर्जी की प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है. एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और एक मुखौटा पहनें।
    2. भंग समाधान करने के लिए N,N-diisopropylethylamine (DIEA) (0.36 एमएल) के 2 mmol जोड़ें और 0.5-1 मिनट के लिए भंवर.
      नोट: महत्वपूर्ण कदम: सक्रियण से अधिक नहीं लेना चाहिए 5 मिनट, सक्रिय अमीनो एसिड isomerize से अधिक सक्रिय ओ-प्रपत्र समय के साथ कम सक्रिय एन-रूपों के लिए.
    3. 2-Cl-(Trt)-NHNH2 राल, चरण 1.1 से तैयार की गई प्रतिक्रिया पोत में सक्रिय Fmoc-Ala-OH जोड़ें। धीरे से 120 आरपीएम पर हिला, एक निरंतर तापमान शेकर में 20 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, और फिर वैक्यूम पंप द्वारा समाधान नाली।
    4. राल धोने के लिए डीएमएफ के 5 एमएल जोड़ें, धीरे से 15 s के लिए इसे हिला और फिर इसे नाली.
    5. Fmoc-Ala-OH (934 mg) का 1 mmol और 0.95 मिलीग्राम 2-(6-क्लोरो-1एच-बेन्जोट्राइज़ोल-1-yl)-1,1,3,3,3-tetramethylaminium हेक्साफ्लोरोफॉस्फेट (HCTU) (HCTU) (390 मिलीग्राम) को 3 एमएल डी युक्त 5 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
      चेतावनी: HCTU के संपर्क में एक एलर्जी की प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है. एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और एक मुखौटा पहनें।
    6. इसे भंग करने के लिए ट्यूब और भंवर में 2 mmol DIEA (0.36 एमएल) जोड़ें।
    7. प्रतिक्रिया पोत में सक्रिय Fmoc-Ala-OH जोड़ें। धीरे से 120 आरपीएम पर हिला, एक निरंतर तापमान शेकर में 40-60 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, और फिर वैक्यूम पंप द्वारा समाधान नाली।
    8. 1.1.2-1.4 चरणों को दोहराकर राल धो लें।
    9. DMF में 20% (vol/vol) piperidine के 4 एमएल जोड़ें राल के लिए, धीरे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इसे हिला और फिर समाधान नाली.
      चेतावनी: पायरीडीन अत्यधिक ज्वलनशील और विषाक्त है। एक धूआं हुड में प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं।
    10. एक और 4 एमएल जोड़ें 20% (vol/vol) piperidine DMF में राल करने के लिए, धीरे कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इसे हिला और फिर समाधान नाली.
    11. दंपती के लिए 1.2.1-1.2.10 चरणों का पालन करें और Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH और Fmoc-Ala-OH की रक्षा करने के लिए। दोहराएँ कदम 1.2.5-1.2.10 जोड़ी और Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH और Fmoc-Asp-OH की रक्षा करने के लिए.
    12. राल अच्छी तरह से धोने के लिए कदम 1.1.2-1.1.4 दोहराएँ.
    13. राल धोने के लिए चरण 1.1.3 दोहराएँ और फिर 5 मिनट के लिए राल को वैक्यूम-ड्रा करें।
  3. हाइड्रेजीन के क्लीवेज व्युत्पन्न एफसी-III क्रूड पेप्टाइड
    1. 12 एमएल कॉकटेल ट्राइफ्लोरोऐसीटिक एसिड (टीएफए)/2,2]-(एथिलीइडियोक्सी)diethethiol (DODT)/triisopropylsilane (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.2.5) को रेजिन में जोड़ें, और फिर एक निरंतर तापमान का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस लगभग 2 ज मिश्रण को 50 एमएल अपकेंद्रित्र नली में छान लें।
    2. इसे धोने के लिए राल में 1 एमएल कॉकटेल जोड़ें और 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में छानलें एकत्र करें। दो बार दोहराएँ.
    3. मिश्रण को एक धुएं के हुड में एक वापर रोटर द्वारा 2 एमएल पर ध्यान केंद्रित करें, और फिर कच्चे पेप्टाइड्स को वेग देने के लिए ट्यूब में 20 एमएल प्रीकूल्ड डाइएथिल ईथर जोड़ें।
      नोट: एनहाइड्रोस ईथर को हिंसक गर्मी रिलीज से बचने के लिए 0 डिग्री सेल्सियस से पहले से ठंडा किया जाना चाहिए, जिससे क्रूड पेप्टाइड की साइड प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं।
    4. पेप्टाइड वर्षण को 1-2 ज के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 5,000 x ग्रामपर सेंट्रीफ्यूज , 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और ध्यान से अपकेंद्रित्र ट्यूब से विलायक को हटा दें।
    6. वर्षा को धोने के लिए चरण 1.3.3-1.3.5 के अनुसार ट्यूब में 20 एमएल प्रीकूल्ड डाइएथिल ईथर को दो बार जोड़ें। लगभग 15 मिनट के लिए घड़ी-ग्लास में पेप्टाइड उत्पाद को एयर-ड्रा करें। आगे के विश्लेषण के लिए सूखे कच्चे पेप्टाइडको 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एक Fc-III पेप्टाइड के हाइड्रैजीन व्युत्पन्न की शुद्धि
    1. 30 मिनट की ढाल वाले एल्यूशन (0-1 मिनट, 5% बी; 1-20 मिनट, 50% बी; 20-25 मिनट, 85% बी; 25-30 मिनट, 85% बी) द्वारा पेप्टाइड को शुद्ध करने के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) प्रणाली का उपयोग करें।
      नोट: स्तंभ में है 4.6 मिमी आईडी, 250 मिमी लंबाई, सी-18 राल के साथ पैक. मोबाइल चरण ए पानी में 0.1% टीएफए शामिल थे, और मोबाइल चरण बी में 100% एसीटोनिट्रिल और 0.1% टीएफए शामिल थे।

2. प्रोटीन अभिव्यक्ति और linker और प्रतिजन भागों की शुद्धि

  1. प्लाज़्मिड निर्माण
    1. SUMO-linker-antigen व्यक्त कर सकते हैं कि पूरे जीन अनुक्रम संश्लेषित (सामग्री की तालिकादेखें).
    2. पीईटी-28a खाली वेक्टर के 10 एनजी और संश्लेषित सूमो-लिंकर-एंटीजन डीएनए टुकड़ा के 50 एनजी को 3 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में NcoI और XhoI का उपयोग करके काटें।
    3. डीएनए जेल निष्कर्षण किट द्वारा डबल एंजाइम पचा वेक्टर और डीएनए टुकड़ा शुद्ध.
    4. डीएनए पचाडीएनए टुकड़ा, 5 डिग्री सेल्सियस पचावेक वेक्टर, टी 4 डीएनए लिगाज़ का 1 डिग्री एल, 10x लिगे बफर का 2 डिग्री एल और डीडीएच2ओ के 7 डिग्री एल को एक प्रतिक्रिया ट्यूब में जोड़ें, और फिर इसे रात भर में 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. चरण 2.1.4 से 100 डिग्री सेल्सियस सक्षम कोशिकाओं (DH5$) में लिगेशन उत्पाद का 10 डिग्री सेल्सियस मिलाकर 30 मिनट के लिए बर्फ स्नान पर रखें। सक्षम कोशिकाओं को 90 s के लिए 42 डिग्री सेल्सियस जल स्नान में रखें और इसे 2 मिनट के लिए बर्फ स्नान में तेजी से स्थानांतरित करें। 800 एमएल जोड़ें LB तरल माध्यम (एंटीबायोटिक्स के बिना) ट्यूब के लिए और यह 37 डिग्री सेल्सियस पर हिला, 1 एच के लिए 1 80 आरपीएम एक Kanamycin LB प्लेट पर सक्षम कोशिकाओं कोट उन्हें समान रूप से वितरित करने के लिए, और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली डाल रात भर.
    6. प्लेट और संस्कृति से 5 एकल कालोनियों एक परीक्षण ट्यूब में एलबी माध्यम के 5 एमएल में बैक्टीरिया एक 37 डिग्री सेल्सियस शेकर का उपयोग कर उठाओ।
    7. Plasmid निष्कर्षण किट का उपयोग करके चरण 2.1.6 से काटा बैक्टीरिया से प्लाज्मिड निकालें।
    8. जीन अनुक्रमण के लिए प्लाज्मिड भेजें और सकारात्मक कॉलोनी है कि SUMO-linker-एंटीजन संलयन प्रोटीन व्यक्त कर सकते हैं चुनें. चरण 2.1.5 के बाद BL21(DE3)plys सक्षम कोशिकाओं के लिए सकारात्मक प्लाज़्मिड को रूपांतरित करें।
  2. प्रोटीन शोधन
    1. कदम 2.1.7 से 5 एमएल LB तरल माध्यम जिसमें kanamycin (50 डिग्री ग्राम/ 200 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृतियों हिला।
    2. रात भर संस्कृतियों के 5 एमएल के साथ एक फ्लास्क में कानामाइसिन (50 ग्राम/एमएल) युक्त प्रीवार्म्ड एलबी माध्यम के 1 एल टीका, और जोरदार मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है, जब तक OD600 0.6 है।
    3. 0ण्4 उउ के अंतिम सांद्रता के लिए माध्यम में आइसोप्रोपिल जेड-डी-थियोगालैक्टोसाइड (IPTG) जोड़ें, और फ्लास्क को 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 200 बजे हिलाएं।
      नोट: प्रोटीन प्रेरण के लिए कम तापमान शामिल शरीर के गठन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए सुनिश्चित करें कि तापमान 22 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है।
    4. कोशिकाओं की कटाई के बाद, कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए सेल छर्रों में 50 एमएल lysis बफर जोड़ें। Sonicate सेल lysates के लिए दो बार 5 मिनट पर 200 डब्ल्यू, अल्ट्रासाउंड 3 एस, अंतराल 3 बर्फ पर एस. सुपरनेट्स को इकट्ठा करने के लिए इसे 30 मिनट के लिए 15, 000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: lysis बफर 50 mM NaH2पीओ4,300 m NaCl, 10 m imidazole से बना है. NAOH का उपयोग करके 8.0 करने के लिए pH मान समायोजित करें।
    5. 50% नी-NTA Sephoras eforas के 2 एमएल जोड़ें, lysis बफर द्वारा समतुल्य, मंजूरी दे दी supernatants के लिए और धीरे मिलाते हुए (200 आरपीएम एक रोटरी शेकर पर) 1 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण.
    6. नीचे आउटलेट छाया हुआ के साथ एक स्तंभ में lysate और Ni-NTA मिश्रण लोड, और नीचे टोपी को हटाने और स्तंभ प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
    7. 6 एमएल वॉश बफर के साथ तीन बार धोएं, और फिर लक्षित प्रोटीन को 1.5 एमएल एल्यूशन बफर के साथ 3 बार पतला करें। एक नली में एल्यूएट लीजिए।
      नोट: धोने बफर 50 m M NaH2पीओ4,300 एम एम NaCl, 30 m imidazole से बना है। NAOH का उपयोग करके 8.0 करने के लिए pH मान समायोजित करें। इल्यूशन बफर 50 एमएम नह2पीओ4,300 एमएम नैक्ल, 250 एमएम इमिडाज़ोल से बना है। NAOH का उपयोग करके 8.0 करने के लिए pH मान समायोजित करें।
    8. प्रोटीन को डिसेल करने के लिए 50 एम एम पीबीएस के 1 एल में एक डायलिसिस बैग में एल्यूएट रखें। 3 बार के लिए नए फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) को बदलें।
  3. SUMO टैग का क्लीवेज
    1. 2 एमएल लघु यूबिक्विटिन-जैसे संशोधक (SUMO) को 1 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता में टैग किया गया प्रोटीन जोड़ें, 1 एमएल सूमो प्रोटीज़ (सामग्री की तालिकादेखें), 10x SUMO Protease बफर का 1 एमएल और प्रतिक्रिया समाधान तैयार करने के लिए डीएच2ओ का 6 एमएल।
      नोट: SUMO टैग प्रोटीन एकाग्रता के बारे में है 1 mg/ एंजाइम पाचन के बाद अत्यधिक सांद्रता प्रोटीन के जमावट का कारण बन सकती है।
    2. मिश्रण को 12-16 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. मिश्रण को 10 मिनट के लिए 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 x ग्राम पर सेंड्रिफ्यूज करें और समुच्चय को त्याग दें। 50% नी-एनटीए घोल के 0.5 एमएल जोड़ें, 50 एमएल पीबीएस द्वारा बराबर, 10 एमएल मंजूरी दे दी supernatants के लिए और धीरे मिलाते हुए (200 आरपीएम एक रोटरी शेकर पर) 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण।
    4. नीचे आउटलेट छाया हुआ के साथ एक स्तंभ में lysate और Ni-NTA मिश्रण लोड. नीचे टोपी निकालें और फिर एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में के माध्यम से प्रवाह को बचाने के.
      नोट: Histagged SUMO प्रोटीन स्तंभ पर बाध्यकारी है. linker-antigen हिस्सा है, जो एनसीएल प्रतिक्रिया के लिए Cys के साथ शुरू होता है, के माध्यम से प्रवाह में है.
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर प्रवाह के माध्यम से अपकेंद्रण और समुच्चय को त्यागें। एचपीएलसी का उपयोग करते हुए लिंकर-एंटिजन भाग को 25 मिनट ढाल वाले एल्यूशन (0-1 मिनट, 5% बी; 1-3 मिनट, 15% बी; 3-20 मिनट, 45% बी; 20-21 मिनट, 85% बी; 21-25 मिनट, 85% बी) द्वारा 1 एमएल/
      नोट: स्तंभ में है 4.6 मिमी आईडी, 250 मिमी लंबाई, सी-18 राल के साथ पैक. मोबाइल चरण ए पानी में 0.1% टीएफए शामिल थे, और मोबाइल चरण बी में 100% एसीटोनिट्रिल और 0.1% टीएफए शामिल थे।
    6. HPLC से शुद्ध उत्पाद लीजिए, और फिर फ्रीज-सूखी रात भर linker-एंटीजन उत्पाद प्राप्त करने के लिए.

3. देशी रासायनिक लिगेशन द्वारा DCAF1 के संयोजन

  1. कॉन्जुगिंग एफसी-III पेप्टाइड और linker-एंटीजन हिस्सा एक साथ
    1. एक 2 एमएल ईपी ट्यूब में एक Fc-III पेप्टाइड के हाइड्रैजीन व्युत्पन्न के 1.8 मिलीग्राम (1 ]mol वजन और 0.2 एम NaH2पीओ4 (पीएच 3.0) समाधान में 6 एम GnHCl के 0.8 एमएल जोड़ें यह भंवर द्वारा भंग करने के लिए।
      नोट: 6 M GnHCl में 0.2 M NaH2PO4 (पीएच 3.0) समाधान एचसीएल या NaOH के साथ पीएच मूल्य का समायोजन करके तैयार किया जाता है।
      चेतावनी: NaOH और एचसीएल अत्यधिक संक्षारक हैं. एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और एक मुखौटा पहनें।
    2. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 7,200 x ग्राम पर ट्यूब centrifuging के बाद, एक बर्फ नमक स्नान में ट्यूब डाल दिया और चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग करने के लिए 15 मिनट के लिए समाधान धीरे आंदोलन.
    3. हाइड्रैजीन समूह को ऑक्सीकृत करने के लिए समाधान के लिए 0ण्5 एम नानो2 का 40 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। धीरे बर्फ नमक स्नान में एक और 15 मिनट के लिए समाधान आंदोलन.
    4. वजन और जोड़ने के 11 शुद्ध linker-antigen हिस्सा कदम से तैयार 2.3 और 13.6 मिलीग्राम 4-mercaptophenylacetic एसिड (MPAA) बर्फ नमक स्नान में प्रतिक्रिया ट्यूब में, 5 मिनट के लिए हलचल, और फिर 6 एम NaOH के साथ कमरे के तापमान पर पीएच मूल्य को समायोजित 6.8-7.0.
      नोट: पीएच मान को न्यूट्रल में समायोजित करना लिगेशन अभिक्रिया आरंभ करने के लिए महत्वपूर्ण चरण है।
    5. 12 ज के बाद, 0.4 एमएल 0.1 एम ट्राइस (2-कार्बोक्सीएथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड (टीसीईपी) तटस्थ विलयन (पीएच 7.0) को प्रतिक्रिया प्रणाली में जोड़ें और प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए 20 मिनट के लिए हलचल करें।
      नोट: 0.1 एम TCEP तटस्थ समाधान (पीएच 7.0) में TCEP भंग करके तैयार किया जाता है 6 M GnHCl में 0.2 M NaH2PO4 (pH 3.0) समाधान, और NAOH का उपयोग करने के लिए पीएच मान को समायोजित करने के लिए 7.0.
    6. 10 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर एचपीएलसी के साथ लिगिंग उत्पाद को 26 मिनट ढाल वाले उत्सर्जन (0-1 मिनट, 5% बी; 1-21 मिनट, 45% बी; 21-22 मिनट, 85% बी; 22-26 मिनट, 85% बी) द्वारा 1 मीटर की दर से विश्लेषण और शुद्ध करें। लिगेशन प्रतिक्रिया के लिए अपेक्षित उपज 50% से अधिक है।
      नोट: स्तंभ में है 4.6 मिमी आईडी, 250 मिमी लंबाई, सी-18 राल के साथ पैक. मोबाइल चरण ए पानी में 0.1% टीएफए शामिल थे, और मोबाइल चरण बी में 100% एसीटोनिट्रिल और 0.1% टीएफए शामिल थे।
  2. संयुग्मी का विसंजीकरण
    1. 0ण्2 एम एन एच एच2पीओ4 (पीएचएच 7.0) विलयन में 6 एम एन एच सी एल के 50 डिग्री एल में चरण 3.1.6 से तैयार संयुग्मी (3.4 मिलीग्राम, 0.3 डिग्री मोल) को भंग करें।
    2. ऊपर मिश्रण के लिए 1 एम टी सी ई पी के 50 डिग्री एल, टीबीयूएसएच के 10 डिग्री एल और 0ण्1 एम वीए-044 समाधान के 5 डिग्री एल जोड़ें।
      नोट: 0.1 M VA-044 समाधान भंग करके तैयार किया जाता है 9.7 VA-044 पाउडर की मिलीग्राम में 0.3 mL के 6 M GnHCl में 0.2 M NaH2PO4 (pH 7.0) समाधान. VA-044 समाधान उपयोग करने से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए, के रूप में VA-044 आसानी से हवा के संपर्क से ऑक्सीकरण है.
    3. 6.9 के लिए समाधान के अंतिम पीएच समायोजित करें और के बारे में 5 ज के लिए सरगर्मी के साथ solutiomat 37 डिग्री सेल्सियस रखें।
    4. 10 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें और अघुलनशील पदार्थ को हटा दें। एचपीएलसी के साथ लिगेशन उत्पाद का विश्लेषण करें और उसे 26 मिनट ढाल-विदारक (0-1 मिनट, 20% बी; 1-21 मिनट, 45% बी; 21-22 मिनट, 85% बी; 22-26 मिनट, 85% बी) द्वारा 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर शुद्ध करें। desulfurization प्रतिक्रिया के लिए अपेक्षित उपज के बारे में 40% है.
      नोट: स्तंभ में है 4.6 मिमी आईडी, 250 मिमी लंबाई, सी-18 राल के साथ पैक. मोबाइल चरण ए पानी में 0.1% टीएफए शामिल थे, और मोबाइल चरण बी में 100% एसीटोनिट्रिल और 0.1% टीएफए शामिल थे।
  3. Acm को हटाने के अंतिम उत्पाद DCAF1 पाने के लिए
    1. पेप्टाइड भंग (1.35 मिलीग्राम, 0.11 [मोल) चरण से तैयार 3.2.4 में 200 $L 32 m AgOAc के, और फिर 4 ज के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण हलचल.
    2. 0.2 M NaH2PO4 (pH 7.0) समाधान में 6 M GnHCl में 1M Dithiothreitol (DTT) के 3 डिग्री एल जोड़ें पेप्टाइड पर चांदी thiolates मुक्त thiols के लिए परिवर्तित करने के लिए समाधान।
    3. 1 मिनट के लिए हिंसक रूप से हिलाने के बाद, ट्यूब को 10 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण करके अघुलनशील पदार्थ को त्याग दें। एचपीएलसी के साथ अंतिम उत्पाद का विश्लेषण करें और उसे 26 मिनट की ढाल वाले क्षेत्र (0-1 मिनट, 20% बी; 1-21 मिनट, 45% बी; 21-22 मिनट, 85% बी; 22-26 मिनट, 85% बी) द्वारा 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर शुद्ध करें। Acm deprotection प्रतिक्रिया के लिए अपेक्षित उपज के बारे में 30% है.
      नोट: स्तंभ में है 4.6 मिमी आईडी, 250 मिमी लंबाई, सी-18 राल के साथ पैक. मोबाइल चरण ए पानी में 0.1% टीएफए शामिल थे, और मोबाइल चरण बी में 100% एसीटोनिट्रिल और 0.1% टीएफए शामिल थे।
    4. HPLC शुद्धि के बाद, फ्रीज अंतिम उत्पाद रात भर सूखी, और पीबीएस में पाउडर भंग (50 mM NaH2पीओ4, 150 एमएम NaCl, पीएच 8.0). 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें और गोली को त्याग दें।
    5. अंतिम उत्पाद की सांद्रता समायोजित करें (चरण 3.4 से) और linker-antigen भाग (चरण 2.3.6 से 10 डिग्री सेल्सियस तक), परिपत्र dichroism (सीडी) स्पेक्ट्रा से 260 से 195 एनएम इन दोनों उत्पादों के एक सीडी स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर 25 मिमी पथ लंबाई के साथ.
      नोट: CD स्पेक्ट्रम अंतिम उत्पाद में helical संरचना की मात्रा को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में है कि रिकॉमबिनेंट में एक व्यक्त के समान है.

4. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उत्पादों की जांच

  1. एक 60 मिनट ढाल elution द्वारा प्रत्येक रासायनिक प्रतिक्रिया से उत्पाद को अलग (0-8 मिनट, 2% बी; 8-10 मिनट, 5% बी; 10-35 मिनट, 30% बी; 35-50 मिनट, 50% बी; 50-52 मिनट, 80% बी; 52-58 मिनट, 80% बी; 58-59 मिनट, 2% बी; 59-60 मिनट, 2% बी) 0.30 मिनट की प्रवाह दर पर। नैनो-HPLC प्रणाली है जो सीधे उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के साथ interfaced है.
    नोट: विश्लेषणात्मक कॉलम में है 75 डिग्री मीटर आईडी, 150 मिमी लंबाई, सी-18 राल के साथ पैक. मोबाइल फेज ए में पानी में 0.1% फोरमिक एसिड शामिल था, और मोबाइल फेज बी में 100% एसीटोनिट्रिल और 0.1% फोरमिक एसिड शामिल था।
  2. पूर्ण-स्कैन मोड में द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर को संचालित करें और m/z श्रेणी को 300-2,000 पर सेट करें और 60,000 पर रिज़ॉल्यूशन करें।
  3. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम डेटा खोलें और रासायनिक प्रतिक्रिया सफलतापूर्वक preformed है की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक चरण में उत्पाद की चोटियों पाते हैं।

5. ELISA DCAF1 और 4G2 एंटीबॉडी के बीच बातचीत की परख

  1. कोटिंग बफर/वेल के 100 डिग्री एल में 1 बजे के साथ एक 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट को 1 बजे-प्रति-जीएसटी एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कोट करें, प्लेट को सील करें और इसे एक शेकर पर रात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. पीबीएस में 1% बीएसए के 200 $L के साथ प्रत्येक को अच्छी तरह से ब्लॉक करें, प्लेट को सील करें और इसे एक शेकर पर 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  3. 0.05% ट्वीन 20 के साथ पीबीएस का उपयोग करके प्रत्येक को अच्छी तरह से 4 बार धोएं।
  4. कुओं में जीएसटी-फ्यूज्ड एंटीजन प्रोटीन (0.05 pmol को 100 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें) कुओं में, प्लेट को सील करें और कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: जीएसटी-फ्यूज्ड एंटीजन प्रोटीन बैक्टीरिया में व्यक्त किया जाता है और GSH Sepharose द्वारा शुद्ध किया जाता है।
  5. प्लेट को धोने के लिए चरण 5.3 दोहराएँ.
  6. 1 pmol 4G2 एंटीबॉडी या 1 pmol 4G2 एंटीबॉडी प्लस अन्य ligands जोड़ें: एंटीजन, एफसी-III या DCAF1 श्रृंखला मात्रा में (0.1 pmol, 1 pmol, 1 pmol, 100 pmol और 1000 pmol) 100 में समाधान अवरुद्ध /
  7. प्लेट को धोने के लिए चरण 5.3 दोहराएँ.
  8. एंटी-माउस आईजीजी, एचआरपी से जुड़े एंटीबॉडी (1:20,000 कमजोर पड़ने) को अवरुद्ध समाधान/अच्छी तरह से 100 डिग्री एल में जोड़ें, प्लेट को सील करें और एक शेकर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट इनक्यूबेट करें।
  9. 0.05% ट्वीन 20 के साथ पीबीएस का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से 6 बार धो लें।
  10. मिक्स TMB अभिकर्मक A और B 1:1 वॉल्यूम में तुरंत उपयोग करने से पहले, 100 $L/अच्छी तरह से जोड़ें, और फिर अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट इनक्यूबेट करें।
  11. स्टॉप समाधान के 100 डिग्री एल/वेल जोड़ें, और 30 मिनट के भीतर प्रत्येक के लिए ओडी450 मानों को मापने के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग करें।

6. ELISA Fc-III और आईजीजी अणु के बीच बातचीत की परख

  1. कोटिंग बफर/अच्छी तरह से 100 डिग्री सेल्सियस में 1 बजे के साथ एक 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट को 1 बजे के साथ कोट करें और एक शेकर पर रात भर इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 5.2 से 5.3 तक चरणों को दोहराएँ.
  3. कुओं के लिए Fc-III या Fc-III-4C जुड़े सीए प्रोटीन (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 और 1 pmol समाधान अवरुद्ध के 100 $L में) कुओं के लिए जोड़ें, थाली सील और कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट.
    नोट: Fc-III या Fc-III-4C जुड़े सीए प्रोटीन बैक्टीरिया में व्यक्त किया जाता है और Ni-NTA द्वारा शुद्ध.
  4. 5.7 से 5.11 तक चरणों को दोहराएँ और परिणामों की जाँच करें।

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Representative Results

इस आलेख में मूल रासायनिक लिगेशन द्वारा संश्लेषण मार्ग के लिए प्रवाहचार्ट चित्र 1 में दर्शायागया है। आंकड़े 2-6 एक Fc-III पेप्टाइड के रासायनिक संश्लेषित hydrazine व्युत्पन्न के क्रोमैटोग्राम (ए) और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा (बी)दिखाने के लिए, रिकॉमबिनेंट व्यक्त linker और प्रतिजन हिस्सा, एनसीएल प्रतिक्रिया से शुद्ध उत्पाद, शुद्ध desulfurization प्रतिक्रिया और शुद्ध अंतिम उत्पाद DCAF1 से उत्पाद, क्रमशः. क्रोमैटोग्राम सभी उत्पादों के शुद्ध को दर्शाते हैं 90% से अधिक हैं, जबकि द्रव्यमान स्पेक्ट्रम प्रत्येक प्रतिक्रिया के बाद उत्पाद के आणविक वजन का संकेत देता है। deconvolutional आणविक वजन भी आंकड़े 3-6में दिखाए जाते हैं, जो प्रत्येक उत्पाद की सटीक आणविक वजन को प्रतिबिंबित. चित्रा 7 ELISA परख के सिद्धांत से पता चलता है (ए) और प्रतिजन पेप्टाइड के परिणाम, Fc-III और DCAF1 competitively 4G2 एंटीबॉडी बंधन बाधा. दोनों प्रतिजन पेप्टाइड और DCAF1 काफी ब्लॉक 4G2 बाध्यकारी, जबकि Fc-III पेप्टाइड प्रतिजन antibody बातचीत को प्रभावित नहीं करता है.

Figure 1
चित्र 1. DCAF1 अणु के अर्द्ध संश्लेषण के लिए देशी रासायनिक ligation विधि के कार्यप्रवाह.
सबसे पहले, एक Fc-III पेप्टाइड के hydrazine व्युत्पन्न ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण द्वारा प्राप्त की है. फिर, SUMO टैग जुड़े लिंकर और प्रतिजन हिस्सा व्यक्त किया है और बैक्टीरिया से शुद्ध, SUMO टैग दरार के बाद. दो टुकड़ों की एनसीएल प्रतिक्रिया के बाद, उत्पाद desulfurization से होकर गुजरती है और Acm समूहों को हटाने के लिए DCAF1 अणु बन जाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. एक Fc-III पेप्टाइड के हाइड्रेजीन व्युत्पन्न के क्रोमैटोग्राम और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम.
यह आंकड़ा दर्शाता है कि शुद्ध पेप्टाइड (ए) की एलसी प्रोफाइल और उधz 915.92 पर मोनो-आइसोटोप चोटी का मिलान डुपल आवेशित पेप्टाइड (बी) से मेल खाता है। यह आंकड़ा संदर्भ 10, चित्र 2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. लिंकर और प्रतिजन भाग के क्रोमैटोग्राम और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम।
यह आंकड़ा शुद्ध खंड (ए) के एलसी प्रोफाइल को दर्शाता है और इस खंड के deconvolutional आणविक वजन की गणना द्रव्यमान स्पेक्ट्रम (बी) से 9429.0 के रूप में की जाती है . यह आंकड़ा संदर्भ 10, चित्र S2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. एनसीएल प्रतिक्रिया द्वारा संयोजन उत्पाद के क्रोमैटोग्राम और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम।
यह आंकड़ा 0 ज (ऊपर), 12 ज (मध्य) और शुद्ध पेप्टाइड (नीचे)(नीचे) (ए) और इस उत्पाद के deconvolutional आणविक वजन पर लिगेशन उत्पाद की निगरानी एलसी प्रोफ़ाइल से पता चलता है 11227.0 के रूप में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम से गणना की जाती है (बी)। यह आंकड़ा संदर्भ 10, चित्र S2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. desulfurization प्रतिक्रिया के बाद उत्पाद के क्रोमैटोग्राम और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम।
यह आंकड़ा शुद्ध उत्पाद (ए) के एलसी प्रोफाइल को दर्शाता है और इस उत्पाद के deconvolutional आणविक वजन की गणना द्रव्यमान स्पेक्ट्रम (बी) से 11195.0 के रूप में की जाती है . यह आंकड़ा संदर्भ 10, चित्र S2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. DCAF1 अणु के क्रोमैटोग्राम, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम और सीडी स्पेक्ट्रम.
यह आंकड़ा शुद्ध DCAF1 के LC प्रोफ़ाइल से पता चलता है (ए), इस अणु के deconvolutional आणविक वजन के रूप में गणना 11053.0 द्रव्यमान स्पेक्ट्रम से (बी) और अंतिम उत्पाद की सीडी स्पेक्ट्रम (ठोस रेखा) और linker-antigen भाग ( डैश लाइन) FCAF1 में. यह आंकड़ा संदर्भ 10, चित्र 2 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7. ELISA DCAF1 अणु की परख.
(ए) सैंडविच एलिसा परख का कार्यप्रवाह। पहले जीएसटी विरोधी एंटीबॉडी को एक अच्छी थाली पर लेपित किया जाता है। फिर जीएसटी-फ्यूजेड एंटीजन पेप्टाइड को इनक्यूबेट किया जाता है। फिर DCAF1 के विभिन्न सांद्रता के साथ 4G2 एंटीबॉडी, प्रतिजन या Fc-III colorimetric विश्लेषण के लिए जोड़ा जाता है. (बी)एंटीजन, एफसी-III और डीसीएएफ1 के ELSIA परिणाम विभिन्न लिगन्ड सांद्रता का उपयोग करते हुए 4G2 बाइंडिंग के निषेध प्रभावों का प्रदर्शन करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ प्रोटोकॉल एनसीएल प्रकिया, जो चित्र 1में दिखाया गया है का उपयोग करके DCAF1 के अर्द्ध संश्लेषण और पता लगाने का वर्णन करता है। संक्षेप में, DCAF1 के दो टुकड़े रासायनिक संश्लेषित और recombinantly व्यक्त कर रहे हैं, क्रमशः; तो, पूर्ण लंबाई DCAF1 अणु इकट्ठा, संशोधित और शुद्ध है. के लिए hydrazine व्युत्पन्न Fc-III टुकड़ा संश्लेषण, कम क्षमता का उपयोग कर 2-सीएल राल काफी महत्वपूर्ण है, क्योंकि उच्च क्षमता hydrazine पीढ़ी के लिए एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है और उत्पाद की कम उपज की ओर जाता है. लिंकर और प्रतिजन हिस्सा दो कारणों के लिए SUMO टैग के साथ व्यक्त कर रहे हैं: पहले, SUMO टैग संलयन प्रोटीन की विलेयता में वृद्धि कर सकते हैं; दूसरा, SUMO protease एक conformation-मान्यता प्राप्त protease है, जो जारी उत्पाद आगे लिगेशन प्रतिक्रिया के लिए Cys अवशेषों के साथ शुरू करने के लिए अनुमति देता है. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक सूमो प्रोटीज़ क्लीवेज है। SUMO टैग-फ्यूज्ड प्रोटीन की एकाग्रता उचित रेंज के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. एक बहुत अधिक या बहुत कम एकाग्रता पाचन के बाद आगे शुद्धि के लिए प्रोटीन एकत्रीकरण या कठिनाई के लिए नेतृत्व करेंगे. इस प्रोटोकॉल का एक अन्य महत्वपूर्ण कदम एनसीएल प्रतिक्रिया के दौरान पीएच मान का समायोजन है, जो थायोल-एस्टर विनिमय पर आधारित है जो तटस्थ बफर में होना चाहिए। अभिक्रिया बफर में पीएच मान का सूक्ष्म नियंत्रण लिगेशन दक्षता को बढ़ाने में सहायक होता है।

इस प्रोटोकॉल विभिन्न प्रतिजन दृश्यों के साथ अन्य DCAF अणुओं के संश्लेषण के लिए उपयुक्त है, क्योंकि विभिन्न DCAF अणुओं के दृश्यों काफी समान हैं और प्रतिजन हिस्सा आमतौर पर पूरी संरचना और DCAF की प्रकृति के लिए थोड़ा योगदान देता है. उदाहरण के लिए, हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग उनके सहजात एंटीबॉडी को लक्षित करने के लिए एक और तीन DCAF अणुओं को संश्लेषित करने के लिए किया। उनमें से, DCAF4 mAb35 एंटीबॉडी ब्लॉक करने के लिए डिजाइन किया गया था, जो acetylcholine रिसेप्टर बेअसर कर सकते हैं और एक चूहे मॉडल में myasthenia gravis कारण. हम DCAF4 का इस्तेमाल किया mAb35 प्रेरित myasthenia gravisके साथ चूहे में नैदानिक लक्षणों को कम करने के लिए, और पूरक घटक प्रोटीन को बाधित करके acetylcholine रिसेप्टर बचाव.

हमारी तकनीक के आवेदन कई कारकों द्वारा सीमित है: पहले, वर्तमान दृष्टिकोण द्वारा संश्लेषित DCAF अणु की उपज कम है (आमतौर पर कम से कम 10%) कई शुद्धि चरणों के कारण; दूसरा, conformational निर्धारकों के साथ एंटीबॉडी DCAF द्वारा लक्षित करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं; तीसरा, DCAF पारंपरिक छोटे यौगिक दवा की तुलना में जीवों में अतिरिक्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित कर सकते हैं. हम कल्पना है कि अन्य एंटीबॉडी प्रेरित रोग स्थितियों के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन में मदद मिलेगी और अधिक DCAF अणुओं संश्लेषित हानिकारक एंटीबॉडी को खत्म करने को लक्षित करने के लिए.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में Tsinghua विश्वविद्यालय-गेट्स फाउंडेशन (नहीं) द्वारा समर्थित किया गया था. OPP1021992), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नहीं, 21502103, 21877068 और 041301475), और चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (नहीं, 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

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Retraction अंक 151 DCAF लक्षित चिकित्सा एंटीबॉडी देशी रासायनिक ligation ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि एलिसा
एंटीजेनिक पेप्टाइड और एफसी-III माइमेटिक्स (डीसीएएफ) के दोहरे-फंक्शनल कंजुगेट द्वारा लक्षित एंटीबॉडी ब्लॉकिंग
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Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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