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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Gezielte Antikörperblockierung durch ein dual-funktionales Konjugat von antigenem Peptid und Fc-III-Mimetik (DCAF)

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

Die Entwicklung eines dual-funktionalen Konjugats von antigenem Peptid und Fc-III-Mimetik (DCAF) ist neu für die Beseitigung schädlicher Antikörper. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Synthese von DCAF1-Molekül, das selektiv 4G2-Antikörper blockieren kann, um Antikörper-abhängige Verbesserungseffekt während der Dengue-Virusinfektion zu beseitigen.

Abstract

Die Beseitigung schädlicher Antikörper aus Organismen ist ein wertvoller Ansatz für die Intervention von Antikörper-assoziierten Krankheiten wie Dengue-Hämorrhagischem Fieber und Autoimmunerkrankungen. Da Tausende von Antikörpern mit unterschiedlichen Epitopen im Blut zirkulieren, wurde keine universelle Methode, mit Ausnahme des dual-funktionalen Konjugats von antigenen Peptid- und Fc-III-Mimetiken (DCAF), berichtet, spezifische schädliche Antikörper zu zielen. Die Entwicklung von DCAF-Molekülen leistet einen wesentlichen Beitrag zum Fortschritt der zielgerichteten Therapie, die gezeigt wurde, um den Antikörper-abhängigen Verbesserungseffekt (ADE) in einem Dengue-Virus-Infektionsmodell (DENV) zu eliminieren und das Acetylcholin-Infektionsmodell zu steigern. Rezeptoraktivität in einem Myasthenia gravis Modell. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Synthese eines DCAF-Moleküls (DCAF1), das selektiv 4G2-Antikörper blockieren kann, um den ADE-Effekt während der Dengue-Virusinfektion abzuschwächen, und die Bindung von DCAF1- an 4G2-Antikörper durch einen ELISA-Assay veranschaulichen kann. Bei unserer Methode wird DCAF1 durch die Konjugation eines Hydrazinderivats eines Fc-III-Peptids und einer rekombinanten, langen,-Helix mit antigener Sequenz durch native chemische Ligation (NCL) synthetisiert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf DCAF1 sowie andere DCAF-Moleküle angewendet, um ihre Cognate-Antikörper gezielt zu untersuchen.

Introduction

Antikörper spielen eine wichtige Rolle bei der humoralen Immunantwort zur Neutralisierung pathogener Bakterien und Viren1. Einige Antikörper zeigen jedoch schädliche Auswirkungen auf die Organismen, wie kreuzreaktive Antikörper im ADE-Effekt während der DENV-Infektion und überreaktive Antikörper in Myasthenia gravis, was eine Autoimmunerkrankungist 2,3. ADE-Effekt wird durch die kreuzreaktiven Antikörper vermittelt, die die Brücke bilden, um DENV und Fc-Rezeptor präsentierenden Zellen4,5, während Myasthenia gravis durch die übermäßigen Antikörper verursacht wird, die Acetylcholin-Rezeptoren angreifen zwischen den Zell-Zell-Kreuzungen im Muskelgewebe6,7. Obwohl teilweise wirksame Ansätze zur Behandlung dieser Krankheiten entwickelt wurden8,9, würde zweifellos die direkte Beseitigung dieser schädlichen Antikörper Fortschritte bei den Interventionen machen.

Kürzlich wurden DCAF-Moleküle, die dual-funktionelle Gruppen haben, für die gezielte Antikörperblockierung10entwickelt. DCAF ist ein langes Peptid, das aus 3 Teilen besteht: 1) ein Antigenteil, das den Cognate-Antikörper spezifisch erkennen kann, 2) ein Fc-III- oder Fc-III-4C-Tag zur starken Bindung an den Fc-Bereich des Antikörpers, um entweder Fc-Rezeptor- oder Komplement-Komponentenproteine zu hemmen , 3) ein langer ,-Helical-Linker, der diese beiden funktionellen Gruppen10konjugiert. Das Linker-Teil, das von der Moesin FERM-Domäne entwickelt wurde, wurde von der Rosseta-Software optimiert, um sicherzustellen, dass das Antigen- und das Fc-III-Teil in einem DCAF-Molekül gleichzeitig an die Fab- und Fc-Regionen von IgG binden kann. Vier DCAF-Moleküle wurden synthetisiert, um 4 verschiedene Antikörper anzusprechen, darunter DCAF1 wurde verwendet, um 4G2-Antikörper zu eliminieren, der ein kreuzreaktiver Antikörper während der DENV-Infektion ist, um zur ADE-Wirkung beizutragen; und DACF4 wurde für die Rettung von Acetylcholin-Rezeptoren durch Blockierung mab35 Antikörper in Myasthenia gravis10entwickelt.

In der vorliegenden Studie, die DCAF1 als Beispiel annahm, zeigten wir die Protokolle für die Synthese von DCAF-Molekülen und den Nachweis der Wechselwirkung zwischen einem DCAF und seinem cognate Antikörper. Der DCAF1 wird durch NCL-Ansatz11,12,13,14, der das Hydrazinderivat eines Fc-III-Peptids und die exprimierten Linker-Antigen-Teile zusammenverbindet, halbsynthetiert. Der NCL-Ansatz hat erhebliche Vorteile gegenüber vollständig chemischer Synthese und vollständig rekombinanter Expression für die DCAF1-Synthese, da beide Methoden zu geringem Ertrag und hohen Kosten führen. Der aktuelle Ansatz ist nicht nur der kostengünstigste Weg, um die DCAF in voller Länge zu erhalten, sondern kann auch die Konformation des Linkerteils ähnlich wie seine native Form beibehalten. Da verschiedene DCAF-Moleküle ähnliche Sequenzen haben, mit Ausnahme der Antigenteile, können unsere Methoden zur DCAF1-Synthese und der Interaktionstest zwischen DCAF1- und 4G2-Antikörpern auch auf andere DCAF-Moleküle angewendet werden, um gezielt ihre Cognate-Antikörper zu blockieren.

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Protocol

1. Chemische Synthese des Hydrazinderivats eines Fc-III-Peptids

  1. Umrüstung von 2-Cl-(Trt)-Cl-Harz in 2-Cl-(Trt)-NHNH2 Harz
    1. Wiegen Sie 625 mg 2-Cl-(Trt)-Cl-Harz (0,25 mmol) in ein 25 ml Peptidsynthesegefäß.
    2. 5 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) von der Oberseite des Gefäßes in das Harz geben, die Kappe zurücklegen, das Gefäß 15 s sanft schütteln und dann abtropfen lassen. Wiederholen Sie das DMF-Waschen noch zwei Mal.
    3. 5 ml Dichlormethan (DCM) in das Gefäß geben, die Kappe zurücklegen, das Gefäß 15 s lang sanft schütteln und dann abtropfen lassen. Wiederholen Sie das DCM-Waschen noch zwei Mal.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.1.2 dreimal.
    5. Verwenden Sie 6 ml 50% (vol/vol) DMF/DCM, um das Harz für 30 min anzuschwellen und dann abtropfen lassen.
    6. 6 ml 5% (vol/vol) NH2NH2 in DMF in das Reaktionsgefäß geben, das Gemisch bei 120 Umdrehungen pro Minute, 30 °C 30 min schütteln und dann die Lösung durch Vakuumpumpe abtropfen lassen.
      HINWEIS: Fügen Sie 0,3 ml Hydrazinhydrat zu 5,7 ml DMF hinzu, um 5% (vol/vol) NH2NH2zu erhalten. NH2NH2 vor Gebrauch frisch zubereiten.
      VORSICHT: Hydrazinhydrat ist eine gefährliche Substanz und kann Krebs verursachen. Tragen Sie einen Labormantel, Handschuhe und eine Maske. Führen Sie die Experimente in einer Dunstabzugshaube durch.
    7. Fügen Sie 5 ml DMF in das Gefäß, schütteln Sie es vorsichtig für 15 s und dann abtropfen lassen.
    8. Wiederholen Sie Schritt 1.1.6 und waschen Sie dann das Harz, indem Sie die Schritte 1.1.2-1.1.4 zweimal wiederholen.
    9. 6 ml 5% (vol/vol) MeOH/DMF in das Gefäß geben, 10 min vorsichtig schütteln und dann abtropfen lassen.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die unreagierten Stellen auf dem Harz begrenzt sind.
    10. Waschen Sie das Harz gründlich, indem Sie die Schritte 1.1.2-1.1.4 wiederholen.
    11. Fügen Sie 5 ml DCM in das Harz, schütteln Sie es vorsichtig für 15 s und dann abtropfen lassen, um 2-Cl-(Trt)-NHNH2 Harz zu erhalten.
      HINWEIS: Das Harz wird gelb oder hellgrün, wenn die Substitution erfolgreich ist.
  2. Peptiddehnung
    1. 1 mmol des Fmoc-Ala-OH (934 mg) und 0,95 mmol 1-[bis(dimethylamino)methylen]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] Pyridinium hexafluorphosphat 3-oxid (HATU) (360 mg) in eine 5 ml-Röhre mit 3 ml DMF.
      VORSICHT: Die Exposition gegenüber HATU kann eine allergische Reaktion hervorrufen. Tragen Sie einen Labormantel, Handschuhe und eine Maske.
    2. 2 mmol N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) (0,36 ml) in die gelöste Lösung geben und wirbeln 0,5–1 min.
      HINWEIS: Kritischer Schritt: Die Aktivierung sollte nicht mehr als 5 min dauern, da die aktivierten Aminosäuren von den aktiveren O-Formen zu den weniger aktiven N-Formen im Laufe der Zeit isomerisieren.
    3. Fügen Sie das aktivierte Fmoc-Ala-OH in das Reaktionsgefäß mit dem 2-Cl-(Trt)-NHNH 2-Harz, hergestellt aus Schritt 1.1, ein. Bei 120 Umdrehungen pro Minute, 30 °C für 20 min in einem Konstanttemperatur-Shaker vorsichtig schütteln und die Lösung dann mit einer Vakuumpumpe abtropfen lassen.
    4. Fügen Sie 5 ml DMF, um das Harz zu waschen, schütteln Sie es vorsichtig für 15 s und dann abtropfen lassen.
    5. 1 mmol des Fmoc-Ala-OH (934 mg) und 0,95 mmol 2-(6-chlor-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3-tetramethylaminium hexafluorophosphat (HCTU) (390 mg) in ein 5 ml-Rohr mit 3 ml DMF geben.
      VORSICHT: Die Exposition gegenüber HCTU kann eine allergische Reaktion hervorrufen. Tragen Sie einen Labormantel, Handschuhe und eine Maske.
    6. Fügen Sie 2 mmol DIEA (0,36 ml) in das Rohr und Wirbel für 0,5-1 min, um es aufzulösen.
    7. Fügen Sie das aktivierte Fmoc-Ala-OH in das Reaktionsgefäß ein. Bei 120 Umdrehungen pro Minute, 30 °C für 40-60 min in einem Konstanttemperatur-Shaker vorsichtig schütteln und die Lösung dann mit einer Vakuumpumpe abtropfen lassen.
    8. Waschen Sie das Harz, indem Sie die Schritte 1.1.2-1.1.4 wiederholen.
    9. 4 ml 20% (vol/vol) Piperidin in DMF in das Harz geben, bei Raumtemperatur vorsichtig 5 min schütteln und dann die Lösung abtropfen lassen.
      VORSICHT: Pyridin ist leicht entzündlich und giftig. Führen Sie die Experimente in einer Dunstabzugshaube durch.
    10. Fügen Sie weitere 4 ml 20% (vol/vol) Piperidin in DMF in das Harz, schütteln Sie es vorsichtig für 15 min bei Raumtemperatur und dann die Lösung abtropfen lassen.
    11. Folgen Sie den Schritten 1.2.1-1.2.10 zu koppeln und deprotect die Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH und Fmoc-Ala-OH. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5-1.2.10, um die Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH und Fmoc-Asp-OH zu koppeln und zu deprotecten.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2-1.1.4, um das Harz gründlich zu waschen.
    13. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3, um das Harz zu waschen und dann das Harz 5 min vakuumtrocknen.
  3. Spaltung des Hydrazins abgeleiteten Fc-III Rohpeptids
    1. Fügen Sie 12 ml Cocktails Trifluoressigsäure (TFA)/2,2,2(Ethylenedioxy)Diethanethiol (DODT)/Triisopropylsilan (TIPS)/H2 O(92,5/2,5/2,5/2,5) in das Harz ein, und verwenden Sie dann einen Konstanttemperatur-Shaker, um das Peptid bei 200 Rpm aus dem Harz zu spalten, 37 °C ca. 2 h. Filtern Sie das Gemisch in ein 50 ml Zentrifugenrohr.
    2. Fügen Sie 1 ml Cocktails in das Harz, um es zu waschen und sammeln Sie das Filtrat in die 50 ml Zentrifuge Rohr. Wiederholen Sie dies zweimal.
    3. Die Mischung durch einen Dampfrotor in einer Dunstabzugshaube auf 2 ml konzentrieren und dann 20 ml vorgekühlten Diethylether in das Rohr geben, um rohe Peptide auszufällen.
      HINWEIS: Der wasserfreie Äther sollte auf 0 °C vorgekühlt werden, um eine heftige Wärmeabkehr zu vermeiden, die Seitenreaktionen des rohen Peptids verursachen kann.
    4. Die Peptidfällung bei -20 °C für 1-2 h inkubieren.
    5. Zentrifuge bei 5.000 x g,4 °C für 10 min und entfernen Sie das Lösungsmittel vorsichtig aus dem Zentrifugenrohr.
    6. 20 ml vorgekühlter Diethylether nach den Schritten 1.3.3-1.3.5 zweimal in das Rohr geben, um die Fällung zu waschen. Das Peptidprodukt ca. 15 min in einem Uhrenglas lufttrocknen. Die getrockneten Rohpeptide bei 4 °C zur weiteren Analyse aufbewahren.
  4. Reinigung des Hydrazinderivats eines Fc-III-Peptids
    1. Verwenden Sie das Hochleistungssystem der Flüssigchromatographie (HPLC), um das Peptid durch eine 30 min Gradientenelution (0-1 min, 5% B; 1-20 min, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) bei einer Durchflussrate von 1 mL/min zu reinigen.
      HINWEIS: Die Säule ist in 4,6 mm ID, 250 mm Länge, verpackt mit C-18 Harz. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % TFA in Wasser, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Acetonitril und 0,1 % TFA.

2. Proteinexpression und Reinigung von Linker- und Antigenteilen

  1. Plasmidkonstruktion
    1. Synthetisieren Sie die gesamte Gensequenz, die SUMO-Linker-Antigen exprimieren kann (siehe Materialtabelle).
    2. Schneiden Sie 10 ng PET-28a leeren Vektor und 50 ng des synthetisierten SUMO-Linker-Antigen-DNA-Fragments mit NcoI und XhoI in einem 37 °C-Wasserbad für 3 h.
    3. Reinigen Sie das doppelenzymverdaute Vektor- und DNA-Fragment durch das DNA Gel Extraction Kit.
    4. Fügen Sie 5 l DNA-verdautes DNA-Fragment, 5 l verdauten Vektors, 1 L T4-DNA-Ligase, 2 l 10-liter-Ligasepuffer und 7 l ddH2O in ein Reaktionsröhrchen ein, und inkubieren Sie es dann über Nacht bei 16 °C.
    5. Mischen Sie 10 l des Ligationsprodukts von Schritt 2,1,4 in 100 l kompetente Zellen (DH5) und legen Sie es 30 min in ein Eisbad. Setzen Sie die zuständigen Zellen für 90 s in ein 42°C-Wasserbad und übertragen Sie es schnell für 2 min in ein Eisbad. Fügen Sie 800 ml LB flüssiges Medium (ohne Antibiotika) in das Rohr und schütteln Sie es bei 37 °C, 180 U/min für 1 h. Beschichten Sie die kompetenten Zellen auf eine Kanamycin LB Platte, um sie gleichmäßig verteilt zu machen, und legen Sie die Platte in einen 37 °C Inkubator über Nacht.
    6. Wählen Sie 5 einzelne Kolonien von der Platte und kultichen Sie die Bakterien in 5 ml LB-Medium in einem Reagenzglas mit einem 37 °C-Shaker.
    7. Extrahieren Sie Plasmide aus den Bakterien, die ab Schritt 2.1.6 geerntet wurden, indem Sie das Plasmid Extraction Kit verwenden.
    8. Senden Sie die Plasmide für die Gensequenzierung und wählen Sie die positive Kolonie, die SUMO-Linker-Antigen-Fusionsprotein ausdrücken kann. Transformieren Sie das positive Plasmid nach Schritt 2.1.5 in BL21(DE3)plysS kompetente Zellen.
  2. Proteinreinigung
    1. Wählen Sie eine einzige Kolonie von Transformationsmitteln aus Schritt 2.1.7 in 5 ml flüssiges Medium, das Kanamycin (50 g/ml) enthält. Schütteln Sie die Kulturen über Nacht bei 200 Umdrehungen von 15:00 Uhr, 37 °C.
    2. 1 L vorgewärmten LB-Mediums, das Kanamycin (50 g/ml) enthält, in einem Kolben mit 5 ml der Nachtkulturen impfen und bei 37 °C mit kräftigem Schütteln wachsen, bis der OD600 0,6 beträgt.
    3. Isopropyl-D-Thiogalactoside (IPTG) in das Medium auf die Endkonzentration von 0,4 mM geben und den Kolben bei 200 U/min über Nacht bei 20 °C schütteln.
      HINWEIS: Niedrige Temperatur für Proteininduktion ist wichtig, um Inklusion Körperbildung zu vermeiden, so stellen Sie sicher, dass die Temperatur nicht mehr als 22 °C.
    4. Nach der Ernte der Zellen 50 ml Lysepuffer zu den Zellpellets hinzufügen, um die Zellen wieder auszusetzen. Beschallen Sie die Zelle zweimal für 5 min bei 200 W, Ultraschall 3 s, Intervall 3 s auf Eis. Zentrifugieren Sie es bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C, um die Überräube zu sammeln.
      HINWEIS: Der Lysepuffer besteht aus 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 8,0 ein.
    5. 2 ml der 50% Ni-NTA Sephorase, gleichgeausgleicht durch Lysepuffer, zu den gereinigten Überräuten geben und sanft durch Schütteln (200 Umdrehungen pro Minute auf einem Drehschüttler) bei 4 °C für 1 h mischen.
    6. Laden Sie das Lysat- und Ni-NTA-Gemisch in eine Spalte mit dem unteren Auslass, und entfernen Sie die Unterkappe, und entsorgen Sie den Spaltendurchfluss.
    7. Dreimal mit 6 ml Waschpuffer waschen und dann das Zielprotein 3 mal mit 1,5 ml Elutionspuffer ablöschen. Sammeln Sie das Eluat in einem Rohr.
      HINWEIS: Der Waschpuffer besteht aus 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazol. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 8,0 ein. Der Elutionspuffer besteht aus 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 8,0 ein.
    8. Das Eluat in einen Dialysebeutel in 1 L von 50 mM PBS bei 4 °C geben, um das Protein zu entsalzen. Ersetzen Sie neue Phosphatgepufferte Saline (PBS) für 3 Mal.
  3. Cleavage des SUMO-Tags
    1. Fügen Sie 2 ml Small Ubiquitin-Like Modifier (SUMO) getaggtes Protein in der Konzentration von 1 mg/ml, 1 ml SUMO Protease (siehe Materialtabelle),1 ml 10x SUMO Protease Buffer und 6 ml ddH2O zur Vorbereitung der Reaktionslösung hinzu.
      HINWEIS: Die SUMO-Tag-Proteinkonzentration beträgt etwa 1 mg/ml. Übermäßige Konzentrationen nach der Enzymverdauung können die Gerinnung des Proteins verursachen.
    2. Inkubieren Sie die Mischung für 12-16 h bei 4 °C.
    3. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 15.000 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie die Aggregate. 0,5 ml der 50% Ni-NTA Gülle, gleichdümdurch 50 mM PBS, zu den 10 ml gereinigten Überräuern geben und sanft durch Schütteln (200 Rpm auf einem Drehschüttler) bei 4 °C für 60 min mischen.
    4. Das Lysat und die Ni-NTA-Mischung in eine Säule mit dem unteren Auslass verkapseln. Entfernen Sie die untere Kappe und speichern Sie dann den Durchfluss in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
      HINWEIS: Histagged SUMO Protein ist an die Spalte gebunden. Der Linker-Antigen-Teil, der mit Cys für NCL-Reaktion beginnt, befindet sich im Durchfluss.
    5. Zentrifugieren Sie den Durchfluss bei 15.000 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie die Aggregate. Reinigen Sie das Linker-Antigen-Teil mit HPLC durch eine 25 min Gradientenelution (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) bei einer Durchflussrate von 1 mL/min.
      HINWEIS: Die Säule ist in 4,6 mm ID, 250 mm Länge, verpackt mit C-18 Harz. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % TFA in Wasser, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Acetonitril und 0,1 % TFA.
    6. Sammeln Sie das gereinigte Produkt aus dem HPLC, und dann gefrieren-trocken über Nacht, um das Linker-Antigen-Produkt zu erhalten.

3. Montage von DCAF1 durch native chemische Ligation

  1. Konjugieren von Fc-III-Peptid und Linker-Antigen-Teil zusammen
    1. Wiegen Sie 1,8 mg Hydrazinderivat eines Fc-III-Peptids in ein 2 ml EP-Rohr und fügen Sie 0,8 ml von 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) Lösung hinzu, um es durch Wirbeln aufzulösen.
      HINWEIS: 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) Lösung wird durch Einstellen des pH-Wertes mit HCl oder NaOH hergestellt.
      VORSICHT: NaOH und HCl sind stark korrosiv. Tragen Sie einen Labormantel, Handschuhe und eine Maske.
    2. Nach zentrifugieren Sie das Rohr bei 7.200 x g für 1 min bei Raumtemperatur, legen Sie das Rohr in ein Eissalzbad und verwenden Sie das magnetische Rühren, um die Lösung für 15 min sanft zu rühren.
    3. Fügen Sie der Lösung 40 l von 0,5 M NaNO2 hinzu, um die Hydrazingruppe zu oxidieren. Rühren Sie die Lösung für weitere 15 min im Eissalzbad sanft auf.
    4. 11 mg gereinigtes Linker-Antigenteil aus Schritt 2,3 und 13,6 mg 4-Mercaptophenylessigsäure (MPAA) in das Reaktionsrohr im Eissalzbad wiegen und in das Reaktionsrohr geben, 5 min rühren und dann den pH-Wert bei Raumtemperatur mit 6 M NaOH auf 6,8-7,0 einstellen.
      HINWEIS: Das Anpassen des pH-Wertes auf neutral ist der entscheidende Schritt, um die Ligationsreaktion zu initiieren.
    5. Nach 12 h 0,4 ml 0,1 M Tris(2-Carboxyethyl)phosphin-Hydroin-Neutral-Lösung (TCEP) neutrale Lösung (pH 7,0) in das Reaktionssystem geben und 20 min rühren, um die Reaktion zu beenden.
      HINWEIS: 0,1 M TCEP-neutrale Lösung (pH 7.0) wird durch Lösen von TCEP in 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) Lösung und Verwendung von NaOH zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 hergestellt.
    6. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 15.000 x g für 10 min, dann analysieren und reinigen Sie das Ligationsprodukt mit HPLC durch eine 26 min Gradientenelution (0-1 min, 5% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) bei einer Durchflussrate von 1 mL/min. Die erwartete Ausbeute für die Ligationsreaktion liegt bei über 50%.
      HINWEIS: Die Säule ist in 4,6 mm ID, 250 mm Länge, verpackt mit C-18 Harz. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % TFA in Wasser, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Acetonitril und 0,1 % TFA.
  2. Entschwefelung des Konjugats
    1. Lösen Sie das konjugierte (3,4 mg, 0,3 ,mol) hergestellt von Schritt 3.1.6 in 50 l von 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) Lösung auf.
    2. Fügen Sie der oben genannten Mischung 50 l von 1 M TCEP, 10 l tBuSH und 5 l 0,1 M VA-044-Lösung hinzu.
      HINWEIS: 0,1 M VA-044 Lösung wird durch Auflösen von 9,7 mg VA-044 Pulver in 0,3 ml von 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) Lösung hergestellt. Die VA-044-Lösung sollte vor gebrauchsfertig frisch zubereitet werden, da VA-044 durch Lufteinwirkung leicht oxidiert wird.
    3. Den endgültigen pH-Wert der Lösung auf 6,9 einstellen und den Solutiomat 37 °C unter Rühren ca. 5 h aufbewahren.
    4. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 15.000 x g für 10 min und entfernen Sie die unlösliche Substanz. Analysieren und reinigen Sie das Ligationsprodukt mit HPLC durch eine 26 min Gradientenelution (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) bei einer Durchflussrate von 1 mL/min. Der erwartete Ertrag für die Entschwefelungsreaktion liegt bei etwa 40%.
      HINWEIS: Die Säule ist in 4,6 mm ID, 250 mm Länge, verpackt mit C-18 Harz. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % TFA in Wasser, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Acetonitril und 0,1 % TFA.
  3. Entfernung von Acm, um das Endprodukt DCAF1 zu erhalten
    1. Lösen Sie das Peptid (1,35 mg, 0,11 mol), das ab Schritt 3.2.4 in 200 l von 32 mM AgOAc hergestellt wird, auf und rühren Sie das Reaktionsgemisch dann bei Raumtemperatur 4 h.
    2. Fügen Sie 3 L von 1M Dithiothreitol (DTT) in 6 M GnHCl in 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) Lösung hinzu, um die Silberthiolate auf Peptid in freie Thiole umzuwandeln.
    3. Nach heftigem Rühren für 1 min zentrieren Sie das Rohr bei 15.000 x g für 10 min, um die unlösliche Substanz zu entsorgen. Analysieren und reinigen Sie das Endprodukt mit HPLC durch eine 26 min Gradientenelution (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) bei einer Durchflussrate von 1 mL/min. Der erwartete Ertrag für die Acm-Deprotection-Reaktion beträgt etwa 30%.
      HINWEIS: Die Säule ist in 4,6 mm ID, 250 mm Länge, verpackt mit C-18 Harz. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % TFA in Wasser, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Acetonitril und 0,1 % TFA.
    4. Nach HPLC-Reinigung das Endprodukt über Nacht einfrieren und das Pulver in PBS auflösen (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8,0). Zentrifugieren Sie das Rohr bei 15.000 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie das Pellet.
    5. Stellen Sie die Konzentrationen des Endprodukts (von Schritt 3.4) und des Linker-Antigen-Teils (von Schritt 2.3.6) auf 10 m ein, erfassen Sie die kreisförmigen Dichroismusspektren (CD) dieser beiden Produkte mit einem CD-Spektrometer bei 25 °C mit 1 mm Bahnlänge.
      ANMERKUNG: CD-Spektren werden verwendet, um die Menge der spiralförmigen Struktur im Endprodukt zu demonstrieren, die so ähnlich ist wie die in der rekombinanten ausgedrückten.

4. Detektion der Produkte durch Massenspektrometrie

  1. Trennen Sie das Produkt von jeder chemischen Reaktion durch eine 60 min Gradientenelution (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) bei einer Durchflussrate von 0,300 nL/min mit einem nano-HPLC-System, das direkt mit dem hochauflösenden Massenspektrometer verbunden ist.
    HINWEIS: Die analytische Säule ist in 75'm-ID, 150 mm Länge, verpackt mit C-18-Harz. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure.
  2. Betreiben Sie das Massenspektrometer im Vollscan-Modus und stellen Sie den m/z-Bereich auf 300-2.000 und die Auflösung auf 60.000 ein.
  3. Öffnen Sie die Massenspektrendaten und finden Sie die Spitzen des Produkts in jedem Schritt, um zu bestätigen, dass die chemische Reaktion erfolgreich vorgeformt ist.

5. ELISA-Test der Wechselwirkung zwischen DCAF1 und 4G2-Antikörpern

  1. Beschichten Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit 1 pmol Anti-GST-Antikörper (siehe Materialtabelle) in 100 l Beschichtungspuffer/-gut, versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie bei 4 °C über Nacht auf einem Shaker.
  2. Jeden Brunnen mit 200 l von 1% BSA in PBS blockieren, die Platte versiegeln und bei Raumtemperatur für 1 h auf einem Shaker bebrüten.
  3. Waschen Sie jeden Brunnen 4 Mal mit PBS mit 0,05% Tween 20.
  4. Fügen Sie das GST-verschmelzte Antigenprotein (0,05 pmol in 100 l Blockierlösung) in die Brunnen, versiegeln Sie die Platte und brüten sie 2 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: GST-gebundenes Antigenprotein wird in Bakterien exprimiert und durch GSH Sepharose gereinigt.
  5. Wiederholen Sie Schritt 5.3, um die Platte zu waschen.
  6. Fügen Sie 1 pmol 4G2 Antikörper oder 1 pmol 4G2 Antikörper plus die anderen Liganden: Antigen, Fc-III oder DCAF1 in Serienmengen (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol und 1000 pmol) in 100 l Blockierlösung/Brunnen, versiegeln Sie die Platte und brüten 2 h bei Raumtemperatur auf einem Shaker.
  7. Wiederholen Sie Schritt 5.3, um die Platte zu waschen.
  8. Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener Antikörper (1:20.000 Verdünnung) in 100 l Blockierlösung/Bohrlösung hinzufügen, die Platte versiegeln und 30 min bei Raumtemperatur auf einem Shaker inkubieren.
  9. Waschen Sie jeden Brunnen 6 Mal mit PBS mit 0,05% Tween 20.
  10. TMB-Reagenz A und B 1:1 unmittelbar vor der Anwendung in Volumen mischen, 100 l/well hinzufügen und dann 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
  11. Fügen Sie 100 L / Well der Stop-Lösung, und verwenden Sie einen Plattenleser, um die OD450 Werte für jeden Brunnen innerhalb von 30 min zu messen.

6. ELISA-Test der Wechselwirkung zwischen Fc-III und IgG-Molekül

  1. Beschichten Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit 1 pmol Anti-CA-Antikörper (siehe Materialtabelle) in 100 l Beschichtungspuffer/-gut, versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie bei 4 °C über Nacht auf einem Shaker.
  2. Wiederholen Sie die Schritte von 5.2 bis 5.3.
  3. Fügen Sie das fc-III oder Fc-III-4C geschmolzene CA-Protein (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 und 1 pmol in 100 l Blockierlösung) in die Brunnen, versiegeln Sie die Platte und brüten für 2 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Fc-III oder Fc-III-4C geschmolzenes CA-Protein wird in Bakterien exprimiert und durch Ni-NTA gereinigt.
  4. Wiederholen Sie die Schritte von 5.7 bis 5.11, und überprüfen Sie die Ergebnisse.

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Representative Results

Das Flussdiagramm für den Syntheseweg nach nativer chemischer Ligation in diesem Artikel ist in Abbildung 1dargestellt. Die Abbildungen 2-6 zeigen die Chromatogramme (A) und Massenspektren (B) des chemischen synthetisierten Hydrazinderivats eines Fc-III-Peptids, rekombinant exprimierten Linkers und Antigenteils, das gereinigte Produkt aus NCL-Reaktion, das aus der Entschwefelungsreaktion bzw. dem gereinigten Endprodukt DCAF1. Die Chromatogramme zeigen, dass die Reinigung aller Produkte über 90% liegt, während die Massenspektren das Molekulargewicht des Produkts nach jeder Reaktion angeben. Die dekonvolutionalen Molekulargewichte sind auch in den Abbildungen 3-6dargestellt, die das genaue Molekulargewicht jedes Produkts widerspiegeln. Abbildung 7 zeigt das Prinzip des ELISA-Assays (A) und die Ergebnisse von Antigenpeptid, Fc-III und DCAF1, die die 4G2-Antikörperbindung hemmen. Sowohl Antigenpeptid als auch DCAF1 blockieren signifikant die 4G2-Bindung, während das Fc-III-Peptid die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung nicht beeinflusst.

Figure 1
Abbildung 1. Der Arbeitsablauf der nativen chemischen Ligationsmethode zur Halbsynthese des DCAF1-Moleküls.
Zunächst wird das Hydrazinderivat eines Fc-III-Peptids durch Festphasen-Peptidsynthese gewonnen. Dann wird das SUMO-Tag geschmolzener Linker und Antigenteil exprimiert und von Bakterien gereinigt, gefolgt von der SUMO-Tag-Spaltung. Nach der NCL-Reaktion der beiden Fragmente wird das Produkt entschwefelt und Acm-Gruppen entfernt, um DCAF1-Molekül zu werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Das Chromatogramm und das Massenspektrum des Hydrazinderivats eines Fc-III-Peptids.
Diese Abbildung zeigt, dass das LC-Profil des gereinigten Peptids (A) und des Monoisotopenspitzen bei m/z 915.92 mit dem mit dem Gleichen geladenen Peptid (B) übereinstimmten. Diese Zahl wurde ab Punkt 10, Abbildung 2 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Das Chromatogramm und das Massenspektrum des Linker- und Antigenteils.
Diese Abbildung zeigt das LC-Profil des gereinigten Fragments (A) und das dekonvolutionale Molekulargewicht dieses Fragments wird als 9429.0 aus dem Massenspektrum (B) berechnet. Diese Zahl wurde ab Referenz 10, Abbildung S2 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. Das Chromatogramm und das Massenspektrum des Konjugationsprodukts durch NCL-Reaktion.
Diese Abbildung zeigt das LC-Profil, das das Ligationsprodukt bei 0 h (oben), 12 h (Mitte) und das gereinigte Peptid (unten) (A) überwacht, und das dekonvolutionale Molekulargewicht dieses Produkts wird als 11227.0 aus dem Massenspektrum (B )berechnet. Diese Zahl wurde ab Referenz 10, Abbildung S2 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5. Das Chromatogramm und das Massenspektrum des Produkts nach Derulfurtisierungsreaktion.
Diese Abbildung zeigt das LC-Profil des gereinigten Produkts (A) und das dekonvolutionale Molekulargewicht dieses Produkts wird als 11195.0 aus dem Massenspektrum (B) berechnet. Diese Zahl wurde ab Referenz 10, Abbildung S2 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6. Das Chromatogramm, das Massenspektrum und die CD-Spektren des DCAF1-Moleküls.
Diese Abbildung zeigt das LC-Profil des gereinigten DCAF1 (A), das dekonvolutionale Molekulargewicht dieses Moleküls, berechnet als 11053.0 aus dem Massenspektrum (B) und die CD-Spektren des Endprodukts (feste Linie) und des Linker-Antigen-Teils ( Dash-Linie) in FCAF1. Diese Zahl wurde ab Punkt 10, Abbildung 2 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7. ELISA-Assay des DCAF1-Moleküls.
(A) Der Workflow des Sandwich-ELISA-Assays. Der erste Anti-GST-Antikörper ist auf einer Brunnenplatte beschichtet. Dann wird GST-fused Antigen Peptid inkubiert. Dann wird 4G2 Antikörper mit verschiedenen Konzentrationen von DCAF1, Antigen oder Fc-III für die farbmetrische Analyse hinzugefügt. (B) Die ELSIA-Ergebnisse von Antigen, Fc-III und DCAF1 zeigen Hemmungswirkung der 4G2-Bindung unter Verwendung verschiedener Ligandenkonzentrationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das Protokoll beschreibt hier die Semisynthese und Detektion von DCAF1 mithilfe des NCL-Ansatzes, der in Abbildung 1dargestellt ist. Kurz gesagt, die beiden Fragmente von DCAF1 sind chemisch synthetisiert bzw. rekombinant exprimiert; dann wird das DCAF1-Molekül in voller Länge zusammengesetzt, modifiziert und gereinigt. Für die hydrazin abgeleitete Fc-III-Fragmentsynthese ist die Verwendung von 2-Cl-Harz mit geringer Kapazität sehr wichtig, da eine hohe Kapazität einen negativen Effekt auf die Hydrazin-Erzeugung hat und zu einer geringen Ausbeute des Produkts führt. Der Linker- und Antigenteil wird aus zwei Gründen mit DemO-Tag ausgedrückt: Erstens kann das SUMO-Tag die Löslichkeit der Fusionsproteine verbessern; zweitens ist SUMO-Protease eine konforme Protease, die es dem freigesetzten Produkt ermöglicht, mit Cys-Rückständen für die weitere Ligationsreaktion zu beginnen. Einer der kritischsten Schritte bei der Proteinexpression und -reinigung ist die SUMO-Proteasespaltung. Die Konzentration des SUMO-Tag-fused Proteins sollte an den richtigen Bereich angepasst werden. Eine zu hohe oder zu niedrige Konzentration würde zu einer Proteinaggregation oder Schwierigkeiten bei der weiteren Reinigung nach der Verdauung führen. Ein weiterer wichtiger Schritt dieses Protokolls ist die Anpassung des pH-Werts während der NCL-Reaktion, der auf dem Thiol-Ester-Austausch basiert, der im neutralen Puffer erfolgen sollte. Eine feinfeine Kontrolle des pH-Wertes im Reaktionspuffer ist hilfreich, um die Ligationseffizienz zu steigern.

Dieses Protokoll eignet sich für die Synthese anderer DCAF-Moleküle mit unterschiedlichen Antigensequenzen, da die Sequenzen verschiedener DCAF-Moleküle sehr ähnlich sind und der Antigenteil in der Regel wenig zur gesamten Struktur und Natur von DCAF beiträgt. Zum Beispiel haben wir dieses Protokoll verwendet, um drei weitere DCAF-Moleküle zu synthetisieren, um ihre cognate Antikörper zu zielen. Unter ihnen, DCAF4 wurde entwickelt, um mAb35 Antikörper zu blockieren, die Acetylcholin-Rezeptor neutralisieren können und Myasthenia gravis in einem Rattenmodell verursachen können. Wir verwendeten DCAF4, um die klinischen Symptome bei Ratten mit mAb35-induzierter Myasthenia graviszu reduzieren und den Acetylcholin-Rezeptor zu retten, indem wir die Komplementkomponentenproteine hemmen.

Die Anwendung unserer Technik wird durch mehrere Faktoren begrenzt: Erstens ist die Ausbeute des DCAF-Moleküls, das durch den aktuellen Ansatz synthetisiert wird, gering (in der Regel weniger als 10%) aufgrund der mehrfachen Reinigungsschritte; zweitens sind Antikörper mit konformen Determinanten von DCAF schwer zu zielen; drittens kann DCAF eine zusätzliche Immunantwort bei Organismen im Vergleich zu herkömmlichen kleinen Wirkstoffen auslösen. Wir stellen uns vor, dass die Anwendung dieses Protokolls auf andere antikörperinduzierte pathologische Bedingungen dazu beitragen wird, mehr DCAF-Moleküle zu synthetisieren, um schädliche Antikörper gezielt zu beseitigen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise von der Tsinghua University-Gates Foundation (Nr. OPP1021992), die National Natural Science Foundation of China (Nr. 21502103, 21877068 und 041301475) und das National Key Research and Development Program of China (Nr. 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Tags

Retraktion Ausgabe 151 DCAF gezielte Therapie Antikörper native chemische Ligation Festphasen-Peptidsynthese Proteinexpression und -reinigung ELISA
Gezielte Antikörperblockierung durch ein dual-funktionales Konjugat von antigenem Peptid und Fc-III-Mimetik (DCAF)
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Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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