Summary
开发抗原肽和Fc-III仿生（DCAF）的双功能结合物，是消除有害抗体的新颖方法。在这里，我们描述了DCAF1分子合成的详细方案，它可以选择性地阻断4G2抗体，以消除登革热病毒感染期间的抗体依赖增强作用。
Abstract
消除生物体的有害抗体是干预与抗体相关的疾病（如登革热出血热和自身免疫性疾病）的宝贵方法。由于数千种不同表位的抗体在血液中循环，除了抗原肽和Fc-III二酰皮（DCAF）的双重功能结合外，没有通用方法被报告针对特定的有害抗体。DCAF分子的发展对靶向治疗的进展做出了重大贡献，这证明它消除了登革热病毒（DENV）感染模型中的抗体依赖增强（ADE）效应，并促进了乙酰胆碱肌无力性模型中的受体活性。在这里，我们描述了DCAF分子（DCAF1）的合成方案，该方案可以选择性地阻断4G2抗体，以在登革热病毒感染期间减弱ADE效应，并通过ELISA测定说明DCAF1与4G2抗体的结合。在我们的方法中，DCAF1通过Fc-III肽的氢化物衍生物和通过原生化学结扎（NCL）与抗原序列表达的长螺旋的重组剂结合合成。该协议已成功应用于DCAF1以及其他DCAF分子，以靶向其共生抗体。
Introduction
抗体在体液免疫反应中起着重要作用，对致病菌和病毒的中和作用。然而，一些抗体表现出对生物体的有害影响，如在DENV感染期间ADE效应的交叉反应抗体和肌无力性代谢中的过度反应抗体，这是一种自身免疫性疾病2，3。ADE效应由交叉反应抗体介导，使连接DENV和Fc受体的桥梁呈现细胞4，5，而肌无力性是由攻击乙酰胆碱受体的过度抗体引起的在肌肉组织6，7的细胞-细胞结之间。虽然已经开发出部分有效的方法来治疗这些疾病8，9，毫无疑问，直接消除这些有害的抗体将取得进展的干预措施。
最近，DCAF分子，具有双功能组，已经开发出靶向抗体阻断10。DCAF 是一种长肽，由 3 部分组成：1） 一个抗原部分，可以具体识别共体抗体，2） Fc-III 或 Fc-III-4C 标记强结合到抗体的 Fc 区域，以抑制 Fc 受体或补充组分蛋白， 3） 一个长 _-螺旋链接器，结合这两个功能组10。从Moesin FERM域设计的链接器部分，由Rosseta软件进行优化，以确保DCAF分子中的抗原部分和Fc-III部分可以同时与IgG的Fab和Fc区域结合。合成了4种DCAF分子，靶向4种不同的抗体，其中DCAF1用于消除4G2抗体，这是DENV感染期间的交叉反应抗体，有助于ADE效应;和DACF4被设计用于拯救乙酰胆碱受体通过阻止mab35抗体在肌无力性10。
在本研究中，以DCAF1为例，我们展示了DCAF分子的合成和DCAF与其共生抗体相互作用的检测方案。DCAF1由NCL方法11、12、13、14半合成，将Fc-III肽的氢化物衍生物和表达的联结剂-抗原部分结合在一起。NCL 方法在 DCAF1 合成中具有与完全化学合成和完全重组表达的显著优势，因为这两种方法都会导致低产量和高成本。目前的方法不仅是获得全长DCAF的最经济有效的方法，而且还可以保持链接器部件的构象，类似于其原生形式。由于不同的DCAF分子除了抗原部分具有相似的序列，我们的DCAF1合成方法和DCAF1和4G2抗体之间的相互作用测定也可以应用于其他DCAF分子，以靶向块状阻滞其共性抗体。
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Protocol
1. Fc-III肽氢化物衍生物的化学合成
- 将 2-Cl-（Trt）-Cl 树脂转换为 2-Cl-（Trt）-NHNH2树脂
- 将625mg的2-Cl-（Trt）-Cl树脂（0.25毫摩尔）重量放入25mL肽合成容器中。
- 从容器顶部向树脂中加入 5 mL 的 N、N-二甲基甲酰胺 （DMF），将盖子放回放回，轻轻摇动容器 15 s，然后将其排干。再重复 DMF 洗涤两次。
- 向容器中加入 5 mL 的二氯甲烷 （DCM），将盖子放回原位，轻轻摇动容器 15 s，然后将其排干。再重复 DCM 洗涤两次。
- 重复步骤 1.1.2 三次。
- 使用 6 mL 的 50% （vol/vol） DMF/DCM 使树脂膨胀 30 分钟，然后排空。
- 将 6 mL 5%（vol/vol） NH2NH2在 DMF 中转移到反应容器，在 120 rpm 下摇动混合物，30°C 摇动 30 分钟，然后通过真空泵排空溶液。
注： 加入 0.3 mL 的氢化物水合物到 5.7 mL 的 DMF 获得 5% （vol/vol） NH2NH2.使用前应新鲜准备 NH2NH2。
注意：水合物是一种危险物质，可能导致癌症。穿实验室外套、手套和口罩。在烟罩中执行实验。 - 向容器中加入 5 mL 的 DMF，轻轻摇动 15 s，然后排空。
- 重复步骤 1.1.6，然后重复步骤 1.1.2-1.1.4 两次洗涤树脂。
- 向容器添加 6 mL 的 5%（vol/vol）MeOH/DMF，轻轻摇动 10 分钟，然后排空。
注：此步骤对于确保树脂上的未反应部位封顶非常重要。 - 通过重复步骤 1.1.2-1.1.4 彻底清洗树脂。
- 将 5 mL 的 DCM 添加到树脂中，轻轻摇动 15 s，然后排空以获得 2-Cl-（Trt）-NHNH 2树脂。
注：当更换成功时，树脂变为黄色或浅绿色。
- 肽伸长
- 将1毫摩尔的Fmoc-Ala-OH（934毫克）和0.95毫摩尔的1-_bis（二甲基氨基）亚甲基*-1H-1，2，3-三聚一郎-[4，5-b]六氧基磷酸三氧化物（HATU）（360毫克）加入含有3 mL DMF的5 mL管中。
注意：接触HATU可能导致过敏反应。穿实验室外套、手套和口罩。 - 在溶解溶液中加入2毫摩尔的N，N-二丙丙乙胺（DIEA）（0.36 mL），涡旋0.5~1分钟。
注：关键步骤：激活时间不应超过 5 分钟，因为激活的氨基酸从更活跃的 O 型到不太活跃的 N 型。 - 将活性Fmoc-Ala-OH添加到含有2-Cl-（Trt）-NHNH2树脂的反应容器中，该树脂由步骤1.1制备。在 120 rpm 转速下轻轻摇动，在恒温摇床中轻轻摇动 20 分钟，然后通过真空泵排空溶液。
- 加入 5 mL 的 DMF 来清洗树脂，轻轻摇动 15 s，然后排空。
- 将1毫摩尔的Fmoc-Ala-OH（934毫克）和0.95毫摩尔的2-（6-氯-1H-苯甲酰1-yl）-1，1，3，三-四甲基六氟磷酸（HCTU）（390毫克）加入含有3mLDMF的5 mL管中。
注意：接触 HCTU 可能会导致过敏反应。穿实验室外套、手套和口罩。 - 在管子中加入2毫摩尔（0.36 mL），涡旋0.5~1分钟溶解。
- 将激活的 Fmoc-Ala-OH 添加到反应容器中。在 120 rpm 转速下轻轻摇动，在恒温摇床中轻轻摇动 40-60 分钟，然后通过真空泵排空溶液。
- 通过重复步骤 1.1.2-1.1.4 来清洗树脂。
- 在 DMF 中加入 4 mL 的 20%（vol/vol）烟碱，在室温下轻轻摇动 5 分钟，然后排空溶液。
注意：硫丹是高度易燃和有毒的。在烟罩中执行实验。 - 在 DMF 中再加入 4 mL 的 20%（vol/vol）烟碱，在室温下轻轻摇动 15 分钟，然后排空溶液。
- 按照步骤 1.2.1-1.2.10 耦合并保护 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-His-OH 和 Fmoc-Ala-OH。重复步骤 1.2.5-1.2.10 耦合并保护 Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gly-OH 和 Fmoc-Asp-OH。
- 重复步骤 1.1.2-1.1.4 彻底清洗树脂。
- 重复步骤 1.1.3 洗涤树脂，然后对树脂进行真空干燥 5 分钟。
- 将1毫摩尔的Fmoc-Ala-OH（934毫克）和0.95毫摩尔的1-_bis（二甲基氨基）亚甲基*-1H-1，2，3-三聚一郎-[4，5-b]六氧基磷酸三氧化物（HATU）（360毫克）加入含有3 mL DMF的5 mL管中。
- 氢化物衍生的Fc-III粗肽的裂解
- 在树脂中加入12 mL的鸡尾酒三氟乙酸（TFA）/2、2+-（乙氧基）二乙二醇（DODT）/三丙丙氨酸（TIPS）/H2O（92.5/2.5/2.5），然后用恒温摇摇器在200 rpm转速时从树脂中分离肽。37 °C 约 2 小时，将混合物过滤到 50 mL 离心管中。
- 在树脂中加入 1 mL 的鸡尾酒，将其洗涤，并将滤液收集到 50 mL 的离心管中。重复两次。
- 将混合物在烟气罩中由vaper转子浓缩至2 mL，然后将20 mL的预冷却二乙醚加入管中，以沉淀粗肽。
注：无水醚应预冷却至0°C，以避免剧烈热释放，这可能导致粗肽的侧反应。 - 在-20°C下孵育肽沉淀1-2小时。
- 在5000 x g、4°C下离心10分钟，并小心地从离心管中取出溶剂。
- 根据步骤1.3.3-1.3.5将20mL的预冷却二乙醚加入管中两次，以洗净降水。将肽产品在观察玻璃中晾干约15分钟，将干燥的粗肽储存在4°C处，以便进一步分析。
- Fc-III肽的氢化物衍生物的纯化
- 使用高性能液相色谱（HPLC）系统以30分钟梯度洗脱（0-1分钟，5%B;1-20分钟，50%B;20-25分钟，85%B;25-30分钟，85%B）的流速，以1mL/min的流速纯化肽。
注：该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。
- 使用高性能液相色谱（HPLC）系统以30分钟梯度洗脱（0-1分钟，5%B;1-20分钟，50%B;20-25分钟，85%B;25-30分钟，85%B）的流速，以1mL/min的流速纯化肽。
2. 链接剂和抗原部分的蛋白质表达和纯化
- 质粒结构
- 合成可以表达SUMO-链接剂抗原的整个基因序列（见材料表）。
- 在37°C水浴中使用NcoI和XhoI切割10 ngPET-28a空载体和50 ng合成SUMO-linker-抗原DNA片段3小时。
- 通过DNA凝胶提取试剂盒纯化双酶消化载体和DNA片段。
- 将5μL的DNA消化DNA片段、5μL的消化载体、1μL的T4DNA联带、2μL的10倍联苯缓冲液和7μL的ddH2O加入反应管，然后在16°C下孵育过夜。
- 将步骤2.1.4的10μL结扎产物混合到100μL的合格细胞（DH5°）中，将其放入冰浴30分钟。将能胜任的细胞放入42°C水浴中90秒，并快速将其转移到冰浴2分钟。加入800 mLLB液体介质（不含抗生素）到管中，在37°C，180rpm1h摇动。 将能胜任的细胞涂在Kanamycin LB板上，使它们均匀分布，并将板放入37°C的培养箱过夜。
- 从板中挑选5个单菌落，使用37°C摇床在试管中培养5mLLB培养的细菌。
- 使用质粒提取试剂盒从步骤 2.1.6 中采集的细菌中提取质粒。
- 发送质粒进行基因测序，选择能表达SUMO-链接剂-抗原融合蛋白的正聚群。按照步骤2.1.5将阳性质粒转化为BL21（DE3）plys的合格细胞。
- 蛋白质纯化
- 从步骤 2.1.7 选择单个转化剂聚位，从含有卡那霉素 （50 μg/mL） 的 LB 液体介质中选取 5 mL。在 200 rpm、37 °C 下摇动培养物过夜。
- 在含有5 mL过夜培养物的烧瓶中接种1L的预加热LB介质，直到OD600为0.6。
- 将等丙基β-D-硫拉酮（IPTG）加入介质，最终浓度为0.4 mM，并在20°C下以200rpm在200rpm下摇动烧瓶。
注：低温诱导对避免内含体形成很重要，因此请确保温度不超过22°C。 - 收获细胞后，向细胞颗粒中加入50 mL的赖沙缓冲液，以重新悬浮细胞。在200 W时，将细胞分声两次，连续5分钟，在冰上进行超声波3秒，间隔3秒。在15000 x g下在4°C下将其离心30分钟，以收集超生物。
注： 莱沙缓冲液由 50 mM NaH2PO4、 300 mM NaCl、 10 mM imidazole 组成。使用 NaOH 将 pH 值调整为 8.0。 - 将50%Ni-NTA Sephorase的2 mL（通过赖沙缓冲液平衡）加入清除的上生子中，并通过在4°C下摇动（旋转摇床时200rpm）轻轻混合1小时。
- 将赖沙和 Ni-NTA 混合物装入底部出口盖盖的列中，并取下底部盖并丢弃柱流。
- 用6 mL洗涤缓冲液洗涤三次，然后用1.5 mL的洗脱缓冲液洗涤目标蛋白洗涤3次。在一根管子中收集埃卢特。
注： 洗涤缓冲液由 50 mM NaH2PO4， 300 mM NaCl， 30 mM imidazole.使用 NaOH 将 pH 值调整为 8.0。洗脱缓冲液由50mNaH2PO 4，300 mM NaCl，250 mM imidazole组成。使用 NaOH 将 pH 值调整为 8.0。 - 将脱脂蛋白放入透析袋中，在4°C下分1L的50 mM PBS，以脱盐蛋白质。更换新的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 3 次。
- SUMO 标签的裂解
- 在浓度为1mg/mL的1mg/mL下加入2 mL的小泛素状修饰剂（SUMO）标记蛋白，1 mL的SUMO蛋白酶（见材料表），10xSUMO蛋白酶缓冲液和6 mL ddH2O，以制备反应溶液。
注：SUMO标签蛋白浓度约为1毫克/mL。酶消化后浓度过高可能导致蛋白质凝固。 - 在4°C下孵育混合物12-16小时。
- 在 4°C 下在 15，000 x g下将混合物离心 10 分钟，然后丢弃骨料。将 50% Ni-NTA 浆料的 0.5 mL（由 50 mM PBS 平衡）添加到 10 mL 清除的上生子中，并在 4°C 下摇动（旋转摇床时 200 rpm）60 分钟，轻轻混合。
- 将赖沙和 Ni-NTA 混合物装入底部出口盖盖的柱中。拆下底部盖，然后将流量保存到 15 mL 的离心管中。
注： 他标记的 SUMO 蛋白在柱上结合。链接-抗原部分，从Cys开始，用于NCL反应，在流中。 - 在 4°C 下以 15，000 x g将流量离心 10 分钟，然后丢弃骨料。使用HPLC用25分钟梯度洗脱（0-1分钟，5%B;1-3分钟，15%B;3-20分钟，45%B;20-21分钟，85%B;21-25分钟，85%B）净化链接抗原部分，流速为1 mL/min。
注：该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。 - 从HPLC收集纯化产物，然后冷冻干燥过夜，以获得链接剂抗原产品。
- 在浓度为1mg/mL的1mg/mL下加入2 mL的小泛素状修饰剂（SUMO）标记蛋白，1 mL的SUMO蛋白酶（见材料表），10xSUMO蛋白酶缓冲液和6 mL ddH2O，以制备反应溶液。
3. 通过原生化学结扎组装DCAF1
- 将Fc-III肽和联结剂抗原部分结合在一起
- 将Fc-III肽的氢化物衍生物称重1.8毫克（1μmol），放入2 mL EP管中，在0.2M NaH2PO 4（pH 3.0）溶液中加入0.8 mL的6M GnHCl溶液，通过涡旋将其溶解。
注：通过使用 HCl 或 NaOH 调整 pH 值，在 0.2 M NaH2PO4 （pH 3.0） 溶液中制备 6 M GnHCl。
注意：NaOH 和 HCl 具有很强的腐蚀性。穿实验室外套、手套和口罩。 - 在室温下，在7，200 x g下离心管1分钟后，将管子放入冰盐浴中，使用磁搅拌搅拌，轻轻搅拌溶液15分钟。
- 在溶液中加入40μL的0.5 M NaNO2，以氧化氢化物组。在冰盐浴中轻轻搅拌溶液15分钟。
- 将步骤2.3和13.6mg的4-甲苯甲酸（MPAA）制备的11mg纯化链接剂抗原部分称重并加入冰盐浴中的反应管中，搅拌5分钟，然后在室温下将pH值调整至6.8-7.0，室温为6M NaOH。
注： 将 pH 值调整为中性值是启动结扎反应的关键步骤。 - 12小时后，将0.4 mL的0.1M三分（2-碳boxyl）磷酸盐酸（TCEP）中性溶液（pH 7.0）加入反应系统，搅拌20分钟以终止反应。
注：0.1M TCEP中性溶液（pH 7.0）通过溶解6M GnHCl中的TCEP在0.2M NaH2PO4（pH 3.0）溶液中，并使用NaOH将pH值调整至7.0。 - 在15，000 x g下将管离心10分钟，然后用HPLC分析并净化结扎产物，用26分钟梯度洗脱（0-1分钟，5%B;1-21分钟，45%B;21-22分钟，85%B;22-26分钟，85%B），流速为1 mL/min。结扎反应的预期收率超过50%。
注：该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。
- 将Fc-III肽的氢化物衍生物称重1.8毫克（1μmol），放入2 mL EP管中，在0.2M NaH2PO 4（pH 3.0）溶液中加入0.8 mL的6M GnHCl溶液，通过涡旋将其溶解。
- 共偶脱硫
- 在0.2 M NaH2PO4 （pH 7.0） 溶液中溶解从步骤3.1.6在50 μL中的6M GnHCl制备的偶联物（3.4毫克，0.3μmol）。
- 在上述混合物中加入50μL的1M TCEP、10μL的tBuSH和5μL的0.1M VA-044溶液。
注：0.1 M VA-044溶液通过将9.7mg的VA-044粉末溶解成0.3 m GnHCl的0.3 m GHCl，在0.2M NaH2PO4 （pH 7.0） 溶液中制备。VA-044 溶液应在使用前新鲜制备，因为 VA-044 很容易因暴露于空气中而氧化。 - 将溶液的最终pH值调整至6.9，保持溶质37°C搅拌约5小时。
- 将管在15，000 x g下离心10分钟，并去除不溶性物质。以26分钟的梯度洗脱（0-1分钟，20%B;1-21分钟，45%B;21-22分钟，85%B;22-26分钟，85%B）分析并净化HPLC的结扎产物，流速为1 mL/min。脱硫反应的预期收率约为40%。
注：该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。
- 去除 Acm 以获得最终产品 DCAF1
- 溶解从步骤3.2.4在32 mM AgOAc的200μL中制备的肽（1.35mg，0.11μmol），然后在室温下搅拌反应混合物4小时。
- 在 0.2 M NaH2PO4 （pH 7.0） 溶液中加入 3 μL 的 1M 二硫酸醇 （DTT）， 将肽上的银硫酸盐转换为游离硫醇。
- 剧烈搅拌1分钟后，将管在15，000 x g下离心10分钟，以丢弃不溶性物质。以 26 分钟的梯度洗脱（0-1 分钟，20% B;1-21 分钟，45% B;21-22 分钟，85% B;22-26 分钟，85% B）分析并净化最终产品，流速为 1 mL/min。Acm 去保护反应的预期收率约为 30%。
注：该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。 - HPLC纯化后，在一夜之间冷冻干燥最终产品，并将粉末溶解在PBS（50mM NaH2PO 4，150 mM NaCl，pH 8.0）中。在 4°C 下以 15，000 x g将管离心 10 分钟，然后丢弃颗粒。
- 将最终产品（从步骤 3.4）和链接剂抗原部分（从步骤 2.3.6）调整到 10 μM，使用 25°C 的 CD 光谱仪，在 25°C 和 1 mm 路径长度下，记录这两种产品的圆形双色 （CD） 光谱从 260 到 195 nm。
注：CD光谱用于演示最终产品中的α螺旋结构与重组表示的相似量。
4. 通过质谱法检测产品
- 将产品与每种化学反应分离 60 分钟梯度洗脱（0-8 分钟， 2% B;8-10分钟，5%B;10-35分钟，30%B;35-50分钟，50%B;50-52分钟，80%B;52-58分钟，80%B;58-59分钟，2%B;59-60分钟，2%B），流量为0.300μL/min，带1纳米HPLC系统，与高分辨率质谱仪直接接口。
注：分析柱为75 μm ID，150毫米长，装有C-18树脂。移动A阶段包括水中0.1%的甲酸，移动阶段B包括100%乙酰乙酸和0.1%的甲酸。 - 在全扫描模式下操作质谱仪，并将 m/z 范围设置为 300-2，000，分辨率为 60，000。
- 打开质谱数据，找到产品在每一步的峰值，以确认化学反应已成功预成型。
5. DCAF1和4G2抗体相互作用的ELISA测定
- 在100μL涂层缓冲液/孔中涂上1pmol抗GST抗体（见材料表）的96孔微蒂剂板，密封板并在4°C的摇床上孵育。
- 在 PBS 中用 200 μL 的 BSA 块每口孔，密封板并在室温下在摇床上孵育 1 小时。
- 使用 0.05% 补间 20 的 PBS 洗净每个井 4 次。
- 将GST熔融抗原蛋白（0.05pmol在100μL的阻滞溶液中）加入井中，密封板并在室温下孵育2小时。
注：GST熔融抗原蛋白在细菌中表达，并通过GSH塞沙罗斯纯化。 - 重复步骤 5.3 洗盘子。
- 在100μL的阻断溶液/孔中加入1pmol 4G2抗体或1pmol 4G2抗体加其他配体：抗原、Fc-III或DCAF1，在系列量（0.1pmol、1pmol、10pmol、100 pmol和1000 pmol）中，密封板，并在室温下在摇床上孵育2小时。
- 重复步骤 5.3 洗盘子。
- 在100μL的阻滞溶液/孔中加入抗小鼠IgG、HRP链接抗体（1：20，000稀释），密封板，在室温下在摇床上孵育30分钟。
- 使用 0.05% 补间 20 的 PBS 洗好每个井 6 次。
- 在使用前将TMB试剂A和B1：1混合在体积中，加入100μL/井，然后在室内温度下在黑暗中孵育30分钟。
- 添加 100 μL/孔停止溶液，并使用板读取器在 30 分钟内测量每口井的 OD450值。
6. ELISA测定Fc-III和IgG分子之间的相互作用
- 在100μL涂层缓冲液/孔中涂上1pmol抗CA抗体（见材料表）的96孔微蒂剂板，密封板并在4°C的摇床上孵育。
- 重复从 5.2 到 5.3 的步骤。
- 将Fc-III或Fc-III-4C融合的CA蛋白（0.01、0.05、0.1、0.5和1pmol在100μL的阻滞溶液中）加入井中，密封板并在室温下孵育2小时。
注：Fc-III或Fc-III-4C融合CA蛋白在细菌中表达，并通过Ni-NTA纯化。 - 重复从 5.7 到 5.11 的步骤并检查结果。
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Representative Results
本文中原生化学结扎合成路线的流程图如图1所示。图2-6显示了Fc-III肽的化学合成氢化物衍生物的色谱图（A）和质量谱（B），重组表达链接剂和抗原部分，NCL反应的纯化产物，纯化脱硫反应产物和纯化最终产物DCAF1。色谱图显示，所有产品的纯度均超过90%，而质谱表示产品每次反应后的分子量。图3-6也反映了去量分子量，反映了每种产品的准确分子量。图7显示了ELISA测定（A）的原理和抗原肽、Fc-III和DCAF1竞争抑制4G2抗体结合的结果。抗原肽和DCAF1显著阻断4G2结合，而Fc-III肽不影响抗原-抗体相互作用。
图 1.DCAF1分子半合成的原生化学结扎方法的工作流程。
首先，通过固相肽合成获得Fc-III肽的氢化物衍生物。然后，将SUMO标记融合链接器和抗原部分表达并从细菌中纯化，然后表达SUMO标记裂解。在两个片段的NCL反应后，产品进行脱硫和去除Acm组，成为DCAF1分子。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.Fc-III肽的氢化物衍生物的色谱和质量谱。
该图显示，纯化肽（A） 的 LC 轮廓和 m/z 915.92 的单同位素峰值与 duple 带电肽 （B） 匹配。此图已由参考文献 10（图 2）修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.链接器和抗原部分的色谱和质量谱。
下图显示了纯化片段（A） 的 LC 轮廓，该片段的去量分子量从质量谱 （B） 计算为 9429.0。此图已从参考图 S2 中修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.NCL反应的共聚产物的色谱和质量谱。
下图显示了在0小时（顶部）、12小时（中）和纯化肽（底部）（A）处监测结扎产物的LC轮廓，从质量谱（B）计算，该产品的去角分子量为11227.0。此图已从参考图 S2 中修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.脱硫反应后产品的色谱图和质量谱。
下图显示了纯化产物（A） 的 LC 轮廓，从质量谱 （B） 中计算，该产品的去量分子量为 11195.0。此图已从参考图 S2 中修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6.DCAF1分子的色谱图、质量谱和CD光谱。
下图显示了纯化 DCAF1（A）的 LC 轮廓，该分子的离氧分子量从质量谱（B）计算为 11053.0，最终产物的 CD 光谱（实线）和链接器-抗原部分 （破折号线）在FCAF1。此图已由参考文献 10（图 2）修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7.DCAF1分子的ELISA测定。
（A） 三明治ELISA测定的工作流程.第一个抗GST抗体涂在井板上。然后，GST融合抗原肽孵育。然后加入不同浓度的DCAF1、抗原或Fc-III的4G2抗体进行色度分析。（B） 抗原、Fc-III 和 DCAF1 的 ELSIA 结果表明使用不同配体浓度的 4G2 结合抑制作用。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此处的协议描述了使用 NCL 方法对 DCAF1 的半合成和检测，如图1所示。简单地说，DCAF1的两个片段分别进行了化学合成和重组表达;然后，对全长DCAF1分子进行组装、改性、纯化。对于氢化物衍生的Fc-III片段合成，使用低容量2-Cl树脂非常重要，因为高容量对氢化物的生成有负面影响，并导致产品产量低。链接器和抗原部分用SUMO标记表示有两个原因：第一，SUMO标记可以增强融合蛋白的溶解度;其次，SUMO蛋白酶是一种经构象认可的蛋白酶，它允许释放的产品从Cys残留物开始，用于进一步的结扎反应。在蛋白质表达和纯化中最关键的步骤之一是SUMO蛋白酶裂解。SUMO标记融合蛋白的浓度应调整到适当的范围。浓度过高或浓度过低会导致蛋白质聚集或消化后进一步纯化困难。该协议的另一个关键步骤是在NCL反应期间调整pH值，该值基于在中性缓冲液中应发生的二醇-酯交换。对反应缓冲液中pH值的精细控制有助于提高结扎效率。
该协议适用于具有不同抗原序列的其他DCAF分子的合成，因为不同DCAF分子的序列非常相似，抗原部分通常对DCAF的整个结构和性质贡献不大。例如，我们使用该协议合成另外三个DCAF分子，以瞄准它们的共生抗体。其中，DCAF4被设计为阻断mAb35抗体，它可以中和乙酰胆碱受体，并在大鼠模型中引起肌无力性。我们使用DCAF4来减少大鼠的临床症状，用mAb35诱导的肌无力性，并通过抑制补充组分蛋白来拯救乙酰胆碱受体。
我们技术的应用受到以下几个因素的限制：首先，采用当前方法合成的DCAF分子的产量较低（通常不到10%）由于多个净化步骤;第二，具有构象决定子的抗体难以被DCAF靶向;第三，与传统的小化合物药物相比，DCAF在生物体中可能引起额外的免疫反应。我们预计，将该协议应用于其他抗体引起的病理条件将有助于合成更多的DCAF分子，有针对性地消除有害的抗体。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了清华大学-盖茨基金会的支持（没有。OPP1021992），国家自然科学基金（第21502103号、21877068号、041301475号）和《国家重点研究发展计划》（No 2017YFA0505103）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
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