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Immunology and Infection

Blocage ciblé d'anticorps par un conjugaison bifonctionnel de peptide antigénique et de mimétrie fc-III (DCAF)

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

Le développement d'une conjugaison bifonctionnelle de peptide antigénique et de mimétique Fc-III (DCAF) est nouveau pour l'élimination des anticorps nocifs. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la synthèse de la molécule DCAF1, qui peut bloquer sélectivement l'anticorps 4G2 pour éliminer l'effet d'amélioration dépendant des anticorps pendant l'infection de virus de dengue.

Abstract

L'élimination des anticorps nocifs des organismes est une approche précieuse pour l'intervention de maladies associées aux anticorps, telles que la dengue hémorragique et les maladies auto-immunes. Puisque des milliers d'anticorps avec différentes épitopes circulent dans le sang, aucune méthode universelle, excepté la conjugaison dual-fonctionnelle du peptide antigénique et de la mimétique de Fc-III (DCAF), n'a été rapportée pour cibler les anticorps nocifs spécifiques. Le développement de molécules DCAF apporte une contribution significative aux progrès de la thérapie ciblée, qui ont été démontrés pour éliminer l'effet d'amélioration dépendante des anticorps (ADE) dans un modèle d'infection par le virus de la dengue (DENV) et pour stimuler l'acétylcholine l'activité des récepteurs dans un modèle de myasthénie gravis. Ici, nous décrivons un protocole pour la synthèse d'une molécule de DCAF (DCAF1), qui peut bloquer sélectivement l'anticorps 4G2 pour atténuer l'effet d'ADE pendant l'infection de virus de dengue, et illustrer la liaison de l'anticorps de DCAF1 à 4G2 par un test d'ELISA. Dans notre méthode, DCAF1 est synthétisé par la conjugaison d'un dérivé d'hydrazine d'un peptide fc-III et d'un recombinant exprimé longtemps -helix avec séquence antigénique par la ligature chimique indigène (NCL). Ce protocole a été appliqué avec succès à DCAF1 ainsi qu'à d'autres molécules d'ADFA pour cibler leurs anticorps cognate.

Introduction

Les anticorps jouent un rôle important dans la réponse immunitaire humoristique pour la neutralisation des bactéries pathogènes et des virus1. Cependant, certains anticorps présentent des effets nocifs sur les organismes, tels que les anticorps réactifs croisés dans l'effet ADE pendant l'infection à DENV et les anticorps surréactifs dans les gravis de myasthénie, qui est une maladie auto-immune2,3. L'effet ADE est médié par les anticorps réactifs qui font le pont pour relier les cellules de présentation de DENV et de récepteur fc4,5, tandis que la myasthénie gravis est causée par les anticorps excessifs qui attaquent les récepteurs de l'acétylcholine entre les jonctions cellule-cellule dans le tissu musculaire6,7. Bien que des approches partiellement efficaces aient été développées pour traiter ces maladies8,9, sans aucun doute l'élimination directe de ces anticorps nocifs ferait des progrès pour les interventions.

Récemment, des molécules de DCAF, qui ont des groupes dual-fonctionnels, ont été développées pour le blocage ciblé d'anticorps10. DCAF est un long peptide qui est composé de 3 parties: 1) une partie d'antigène qui peut reconnaître spécifiquement l'anticorps cognate, 2) une étiquette Fc-III ou Fc-III-4C pour fortement lier à la région Fc de l'anticorps pour inhiber soit les récepteurs Fc ou compléter les protéines composant , 3) un long lien hélicoïdal qui conjugue ces deux groupes fonctionnels10. La partie de liaison, conçue à partir du domaine Moesin FERM, a été optimisée par le logiciel Rosseta pour s'assurer que la partie antigène et la partie Fc-III d'une molécule DCAF peuvent se lier simultanément aux régions Fab et Fc d'IgG. Quatre molécules de DCAF ont été synthétisées pour cibler 4 anticorps différents, dont DCAF1 a été utilisé pour éliminer l'anticorps 4G2, qui est un anticorps réactif croisé pendant l'infection de DENV pour contribuer à l'effet ADE ; et DACF4 a été conçu pour le sauvetage des récepteurs de l'acétylcholine en bloquant l'anticorps mab35 dans myasthenia gravis10.

Dans la présente étude, prise DCAF1 comme exemple, nous avons montré les protocoles pour la synthèse de la molécule DCAF et la détection de l'interaction entre un DCAF et son anticorps cognate. Le DCAF1 est semi-synthétisé par nCL approche11,12,13,14, qui conjugue le dérivé de l'hydrazine d'un peptide Fc-III et les parties exprimées linker-antigène ensemble. L'approche NCL présente des avantages significatifs par rapport à la synthèse entièrement chimique et à l'expression entièrement recombinante pour la synthèse DCAF1, car ces deux méthodes entraînent un faible rendement et un coût élevé. L'approche actuelle est non seulement le moyen le plus rentable d'obtenir le DCAF pleine longueur, mais peut également maintenir la conformation de la partie de liaison semblable à sa forme indigène. Puisque différentes molécules de DCAF ont des séquences semblables excepté les parties d'antigène, nos méthodes pour la synthèse de DCAF1 et l'analyse d'interaction entre l'anticorps de DCAF1 et 4G2 peuvent être appliquées à d'autres molécules de DCAF pour bloquer de cible leurs anticorps de cognate aussi bien.

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Protocol

1. Synthèse chimique du dérivé de l'hydrazine d'un peptide Fc-III

  1. Conversion 2-Cl-(Trt)-Cl résine à 2-Cl-(Trt)-NHNH2 résine
    1. Peser 625 mg de résine de 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) dans un récipient de synthèse peptide de 25 ml.
    2. Ajouter 5 mL de N,N-dimethylformamide (DMF) à la résine du haut du navire, remettre le bouchon, secouer doucement le navire pendant 15 s, puis le vider. Répétez le lavage DMF pour deux fois de plus.
    3. Ajouter 5 ml de dichlorométhane (DCM) au récipient, remettre le bouchon, secouer doucement le récipient pendant 15 s, puis le égoutter. Répéter le lavage DCM pour deux fois de plus.
    4. Répétez l'étape 1.1.2 trois fois.
    5. Utilisez 6 ml de 50% (vol/vol) DMF/DCM pour gonfler la résine pendant 30 min, puis égouttez-la.
    6. Transférer 6 mL 5% (vol/vol) NH2NH2 dans le DMF au vaisseau de réaction, secouer le mélange à 120 tr/min, 30 oC pendant 30 min, puis égoutter la solution par pompe à vide.
      REMARQUE: Ajouter 0,3 ml d'hydrate d'hydrazine à 5,7 ml de DMF pour obtenir 5% (vol/vol) NH2NH2. Préparer fraîchement NH2NH2 avant utilisation.
      CAUTION: L'hydrate d'hydrazine est une substance dangereuse et peut causer le cancer. Portez une blouse de laboratoire, des gants et un masque. Effectuez les expériences dans une hotte de fumée.
    7. Ajouter 5 ml de DMF au récipient, le secouer doucement pendant 15 s, puis le égoutter.
    8. Répétez l'étape 1.1.6, puis lavez la résine en répétant les étapes 1.1.2-1.1.4 pendant deux fois.
    9. Ajouter 6 ml de 5 % (vol/vol) MeOH/DMF au récipient, le secouer doucement pendant 10 min, puis le égoutter.
      REMARQUE : Cette étape est très importante pour s'assurer que les sites non réagis sur la résine sont plafonnés.
    10. Lavez soigneusement la résine en répétant les étapes 1.1.2-1.1.4.
    11. Ajouter 5 mL de DCM à la résine, le secouer doucement pendant 15 s, puis le égoutter pour obtenir 2-Cl-(Trt)-NHNH2 résine.
      REMARQUE : La résine devient jaune ou vert clair lorsque la substitution est réussie.
  2. Élongation peptide
    1. Ajouter 1 mmol du Fmoc-Ala-OH (934 mg) et 0,95 mmol de 1-[bis(dimethylamino)méthylène]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] pyridinium hexafluorophosphate 3-oxyde (HATU) (360 mg) dans un tube de 5 ml contenant 3 mL de DMF.
      CAUTION: L'exposition à HATU peut provoquer une réaction allergique. Portez une blouse de laboratoire, des gants et un masque.
    2. Ajouter 2 mmol de N,N-diisopropylethylamine (DIEA) (0,36 ml) à la solution dissoute et vortex pendant 0,5 à 1 min.
      REMARQUE: Étape critique: L'activation ne doit pas prendre plus de 5 min, comme les acides aminés activés isomerize des o-formes plus actives aux formes N moins actives au fil du temps.
    3. Ajouter la résine Fmoc-Ala-OH activée au vaisseau de réaction contenant la résine 2-Cl-(Trt)-NHNH2, préparée à partir de l'étape 1.1. Agiter doucement à 120 tr/min, 30 oC pendant 20 min dans un shaker à température constante, puis égoutter la solution à la pompe à vide.
    4. Ajouter 5 ml de DMF pour laver la résine, la secouer doucement pendant 15 s, puis la égoutter.
    5. Ajouter 1 mmol du Fmoc-Ala-OH (934 mg) et 0,95 mmol de 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate (HCTU) (390 mg) dans un tube de 5 ml contenant 3 mL de DMF.
      CAUTION: L'exposition à HCTU peut provoquer une réaction allergique. Portez une blouse de laboratoire, des gants et un masque.
    6. Ajouter 2 mmol de DIEA (0,36 ml) dans le tube et le vortex pendant 0,5 à 1 min pour le dissoudre.
    7. Ajouter le Fmoc-Ala-OH activé au vaisseau de réaction. Agiter doucement à 120 tr/min, 30 oC pendant 40-60 min dans un shaker à température constante, puis égoutter la solution à l'aspirateur.
    8. Laver la résine en répétant les étapes 1.1.2-1.1.4.
    9. Ajouter 4 ml de 20% (vol/vol) de piperidine en DMF à la résine, agiter doucement pendant 5 min à température ambiante, puis égoutter la solution.
      CAUTION: La pyridine est très inflammable et toxique. Effectuez les expériences dans une hotte de fumée.
    10. Ajouter un autre 4 ml de 20% (vol/vol) de piperidine dans la résine, la secouer doucement pendant 15 min à température ambiante, puis égoutter la solution.
    11. Suivez les étapes 1.2.1-1.2.10 pour coupler et déprotéger les Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH et Fmoc-Ala-OH. Répéter les étapes 1.2.5-1.2.10 pour coupler et déprotéger les Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH et Fmoc-Asp-OH.
    12. Répétez les étapes 1.1.2-1.1.4 pour bien laver la résine.
    13. Répéter l'étape 1.1.3 pour laver la résine, puis sécher sous vide la résine pendant 5 min.
  3. Clivage du peptide brut Fc-III dérivé de l'hydrazine
    1. Ajouter 12 mL de cocktails acide trifluoroacetic (TFA)/2,2'-(ethylenedioxy)diethanethiol (DODT)/triisopropylsilane (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) à la résine, puis utiliser un shaker à température constante pour couper le peptide de la résine à 200 tr/min, 37 oC environ 2 h. Filtrer le mélange dans un tube de centrifugeuse de 50 ml.
    2. Ajouter 1 ml de cocktails dans la résine pour la laver et recueillir le filtrate dans le tube de centrifugeuse de 50 ml. Répétez deux fois.
    3. Concentrez le mélange à 2 ml par un rotor de vapoteur dans un capot de fumée, puis ajoutez 20 ml d'éther diéthyle prérefroidi dans le tube pour précipiter les peptides bruts.
      REMARQUE : L'éther anhydre doit être pré-refroidi à 0 oC pour éviter les rejets de chaleur violents, ce qui peut provoquer des réactions latérales du peptide brut.
    4. Incuber les précipitations peptidiques à -20 oC pendant 1-2 h.
    5. Centrifugeuse à 5 000 x g, 4 oC pendant 10 min et retirer soigneusement le solvant du tube de centrifugeuse.
    6. Ajouter 20 ml d'éther diéthyle prérefroidi dans le tube deux fois selon les étapes 1.3.3-1.3.5 pour laver les précipitations. Sécher à l'air le produit peptide dans un verre de montre pendant environ 15 min. Conserver les peptides bruts séchés à 4 oC pour une analyse plus approfondie.
  4. Purification du dérivé de l'hydrazine d'un peptide Fc-III
    1. Utilisez le système de chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour purifier le peptide par une élution de gradient de 30 min (0-1 min, 5% B; 1-20 min, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) à un débit de 1 ml/min.
      REMARQUE : La colonne est en ID de 4,6 mm, longueur de 250 mm, emballée avec de la résine C-18. La phase A mobile se composait de 0,1 % d'AFE dans l'eau, et la phase B mobile se composait de 100 % d'acétonitrile et de 0,1 % d'AGT.

2. Expression et purification protéinées des pièces de liaison et d'antigène

  1. Construction Plasmid
    1. Synthétiser toute la séquence génétique qui peut exprimer SUMO-linker-antigène (voir Tableau des matériaux).
    2. Couper 10 ng de PET-28a vecteur vide et 50 ng du fragment d'ADN sumogène-antigène synthétisé SUMO-linker en utilisant NcoI et XhoI dans un bain d'eau de 37 oC pendant 3 h.
    3. Purifier le vecteur digéré en double enzyme et le fragment d'ADN par DNA Gel Extraction Kit.
    4. Ajouter 5 ll de fragment d'ADN digéré d'ADN, 5 l de vecteur digéré, 1 l de ligase d'ADN T4, 2 l de tampon de ligase 10x et 7 oL de ddH2O à un tube de réaction, puis l'incuber pendant la nuit à 16 oC.
    5. Mélanger 10 l du produit de ligature de l'étape 2.1.4 à 100 'L de cellules compétentes (DH5) et le mettre sur un bain de glace pendant 30 min. Mettez les cellules compétentes dans un bain d'eau de 42 oC pendant 90 s et transférez-le rapidement dans un bain de glace pendant 2 min. Ajouter 800 ml de Lb liquide moyen (sans antibiotiques) au tube et le secouer à 37 oC, 180 tr/min pour 1 h. Enduire les cellules compétentes sur une plaque de Kanamycin LB pour les faire également réparties, et mettre la plaque dans un incubateur de 37 oC pendant la nuit.
    6. Choisissez 5 colonies simples de la plaque et la culture des bactéries dans 5 ml de lb-moyen dans un tube à essai à l'aide d'un shaker de 37 oC.
    7. Extraire les plasmides des bactéries récoltées à partir de l'étape 2.1.6 en utilisant Plasmid Extraction Kit.
    8. Envoyez les plasmides pour le séquençage des gènes et choisissez la colonie positive qui peut exprimer la protéine de fusion SUMO-linker-antigène. Transformez le plasmide positif en cellules compétentes BL21(DE3)plysS après l'étape 2.1.5.
  2. Purification des protéines
    1. Choisissez une seule colonie de transformateurs de l'étape 2.1.7 à 5 ml de milieu liquide LB contenant de la kanamycine (50 g/mL). Secouez les cultures pendant la nuit à 200 tr/min, 37 oC.
    2. Inoculer 1 L de milieu LB préréchauffé contenant de la kanamycine (50 g/mL) dans un flacon avec 5 ml de cultures nocturnes, et se développer à 37 oC avec des secousses vigoureuses, jusqu'à ce que l'OD600 soit de 0,6.
    3. Ajouter l'isopropyl MD-D-thiogalactoside (IPTG) dans le milieu jusqu'à la concentration finale de 0,4 mM, et secouer le flacon à 200 tr/min pendant la nuit à 20 oC.
      REMARQUE : Il est important d'éviter la formation d'un corps à basse température pour l'induction des protéines, alors assurez-vous que la température ne dépassera pas 22 oC.
    4. Après la récolte des cellules, ajouter 50 ml de tampon de lyse aux granulés cellulaires pour resuspendre les cellules. Sonicate la cellule lysates deux fois pendant 5 min à 200 W, ultrason s 3 s, intervalle 3 s sur glace. Centrifugez-le à 15 000 x g pendant 30 min à 4 oC pour recueillir les supernatants.
      REMARQUE: Le tampon de lyse est composé de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole. Ajustez la valeur du pH à 8,0 en utilisant NaOH.
    5. Ajouter 2 ml de la Sephorase Ni-NTA à 50 %, liblibée par tampon de lyse, aux supernatants défrichés et mélanger délicatement en secouant (200 tr/min sur un shaker rotatif) à 4 oC pendant 1 h.
    6. Chargez le lysate et le mélange Ni-NTA dans une colonne avec la prise inférieure plafonnée, et retirez le bouchon inférieur et jetez la colonne flow-through.
    7. Laver trois fois avec 6 ml de tampon de lavage, puis élifier la protéine ciblée 3 fois avec 1,5 ml de tampon d'élution. Recueillir l'éluate dans un tube.
      REMARQUE : Le tampon de lavage est composé de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole. Ajustez la valeur du pH à 8,0 en utilisant NaOH. Le tampon d'élution est composé de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole. Ajustez la valeur du pH à 8,0 en utilisant NaOH.
    8. Mettre l'éluate dans un sac de dialyse dans 1 L de 50 mM DE PBS à 4 oC pour dessaler la protéine. Remplacer le nouveau phosphate tamponné salin (PBS) pour 3 fois.
  3. Clivage de l'étiquette SUMO
    1. Ajouter 2 mL de protéine étiquetée Small Ubiquitin-Like Modin (SUMO) à la concentration de 1 mg/mL, 1 ml de sumO Protéase (voir Tableau des matériaux),1 ml de 10x SUMO Protease Buffer et 6 mL de ddH2O pour préparer la solution de réaction.
      REMARQUE : La concentration en protéines de l'étiquette SUMO est d'environ 1 mg/ml. Des concentrations excessives après la digestion enzymatique peuvent causer la coagulation de la protéine.
    2. Incuber le mélange de 12 à 16 h à 4 oC.
    3. Centrifuger le mélange à 15 000 x g pendant 10 min à 4 oC et jeter les agrégats. Ajouter 0,5 ml de la boue Ni-NTA de 50 %, liblibée par 50 mM de PBS, aux supernatants défrichés de 10 ml et mélanger délicatement en secouant (200 tr/min sur un shaker rotatif) à 4 oC pendant 60 min.
    4. Chargez le lysate et le mélange Ni-NTA dans une colonne avec la prise inférieure plafonnée. Retirez le bouchon inférieur, puis enregistrez le flux dans un tube de centrifugeuse de 15 ml.
      REMARQUE : La protéine HIStagged SUMO se lie sur la colonne. La partie linker-antigène, qui commence avec Cys pour la réaction NCL, est dans le flux à travers.
    5. Centrifuger le flux à travers à 15 000 x g pendant 10 min à 4 oC et jeter les agrégats. Purifier la partie linker-antigène à l'aide de HPLC par une élution de gradient de 25 min (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) à un débit de 1 mL/min.
      REMARQUE : La colonne est en ID de 4,6 mm, longueur de 250 mm, emballée avec de la résine C-18. La phase A mobile se composait de 0,1 % d'AFE dans l'eau, et la phase B mobile se composait de 100 % d'acétonitrile et de 0,1 % d'AGT.
    6. Recueillir le produit purifié du HPLC, puis lyophiliser pendant la nuit pour obtenir le produit linker-antigène.

3. Assemblage de DCAF1 par ligature chimique indigène

  1. Conjuguant fc-III peptide et linker-antigène partie ensemble
    1. Peser 1,8 mg (1 'mol) de dérivé de l'hydrazine d'un peptide Fc-III dans un tube EP de 2 ml et ajouter 0,8 ml de 6 M GnHCl dans 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) solution pour le dissoudre par vortex.
      REMARQUE : 6 M GnHCl en 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) solution est préparée en ajustant la valeur du pH avec HCl ou NaOH.
      CAUTION: NaOH et HCl sont très corrosifs. Portez une blouse de laboratoire, des gants et un masque.
    2. Après avoir centrifué le tube à 7 200 x g pendant 1 min à température ambiante, mettre le tube dans un bain de sel de glace et utiliser l'agitation magnétique pour agiter la solution pendant 15 min doucement.
    3. Ajouter 40 OL de 0,5 M NaNO2 à la solution pour oxyder le groupe d'hydrazine. Agiter doucement la solution pour un autre 15 min dans le bain de sel de glace.
    4. Peser et ajouter 11 mg de pièce purifiée linker-antigène préparée à partir de l'étape 2.3 et 13.6 mg d'acide 4-mercaptophenylacetic (MPAA) dans le tube de réaction dans le bain de glace-sel, remuer pendant 5 min, puis ajuster la valeur de pH à 6.8-7.0 à température ambiante avec 6 M NaOH.
      REMARQUE : L'ajustement de la valeur du pH au neutre est l'étape critique pour initier la réaction de ligature.
    5. Après 12 h, ajouter 0,4 ml de 0,1 M tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorure (TCEP) solution neutre (pH 7,0) au système de réaction et remuer pendant 20 min pour mettre fin à la réaction.
      REMARQUE : la solution neutre TCEP de 0,1 M (pH 7,0) est préparée en dissolvant le TCEP en 6 M GnHCl dans la solution 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) et en utilisant NaOH pour ajuster la valeur du pH à 7,0.
    6. Centrifuger le tube à 15 000 x g pendant 10 min, puis analyser et purifier le produit de ligature avec HPLC par une élution de gradient de 26 min (0-1 min, 5% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) à un débit de 1 mL/min. Le rendement attendu pour la réaction de ligature est de plus de 50%.
      REMARQUE : La colonne est en ID de 4,6 mm, longueur de 250 mm, emballée avec de la résine C-18. La phase A mobile se composait de 0,1 % d'AFE dans l'eau, et la phase B mobile se composait de 100 % d'acétonitrile et de 0,1 % d'AGT.
  2. Désulfuration de la conjugaison
    1. Dissoudre le conjugué (3,4 mg, 0,3 'mol) préparé à partir de l'étape 3.1.6 dans 50 'L de 6 M GnHCl dans 0.2 M NaH2PO4 (pH 7.0) solution.
    2. Ajouter 50 OL de 1 M TCEP, 10 oL de tBuSH et 5 l de solution VA-044 de 0,1 M VA-044 au mélange ci-dessus.
      REMARQUE : la solution VA-044 de 0,1 M est préparée en dissolvant 9,7 mg de poudre VA-044 en 0,3 ml de 6 M GnHCl dans la solution 0,2 M NaH2PO4 (pH 7,0). La solution VA-044 doit être préparée fraîchement avant utilisation, car VA-044 est facilement oxydée par l'exposition à l'air.
    3. Ajuster le pH final de la solution à 6,9 et garder le solutiomat à 37 oC en remuant pendant environ 5 h.
    4. Centrifuger le tube à 15 000 x g pendant 10 min et enlever la substance insoluble. Analyser et purifier le produit de ligature avec HPLC par une élution de gradient de 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) à un débit de 1 ml/min. Le rendement attendu pour la réaction de désulfuration est d'environ 40%.
      REMARQUE : La colonne est en ID de 4,6 mm, longueur de 250 mm, emballée avec de la résine C-18. La phase A mobile se composait de 0,1 % d'AFE dans l'eau, et la phase B mobile se composait de 100 % d'acétonitrile et de 0,1 % d'AGT.
  3. Enlèvement de l'Acm pour obtenir le produit final DCAF1
    1. Dissoudre le peptide (1,35 mg, 0,11 'mol) préparé à partir de l'étape 3.2.4 dans 200 'L de 32 mM AgOAc, puis remuer le mélange de réaction à température ambiante pendant 4 h.
    2. Ajouter 3 'L de 1M Dithiothreitol (TNT) en 6 M GnHCl en 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) solution pour convertir les thiolates d'argent sur peptide en thiols libres.
    3. Après avoir violemment remué pendant 1 min, centrifuger le tube à 15 000 x g pendant 10 min pour jeter la substance insoluble. Analyser et purifier le produit final avec HPLC par une élution de gradient de 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) à un débit de 1 ml/min. Le rendement attendu pour la réaction de déprotection Acm est d'environ 30%.
      REMARQUE : La colonne est en ID de 4,6 mm, longueur de 250 mm, emballée avec de la résine C-18. La phase A mobile se composait de 0,1 % d'AFE dans l'eau, et la phase B mobile se composait de 100 % d'acétonitrile et de 0,1 % d'AGT.
    4. Après la purification du HPLC, séchez le produit final pendant la nuit et dissoutez la poudre dans pbS (50 mN NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8,0). Centrifuger le tube à 15 000 x g pendant 10 min à 4 oC et jeter la pastille.
    5. Ajuster les concentrations du produit final (à partir de l'étape 3.4) et de la partie antigène-lien (de l'étape 2.3.6) à 10 M, enregistrez les spectres circulaires de dichroism (CD) de 260 à 195 nm de ces deux produits à l'aide d'un spectromètre CD à 25 oC avec une longueur de trajectoire de 1 mm.
      REMARQUE : Les spectres de CD sont utilisés pour démontrer la quantité de structure hélicoïdale dans le produit final est aussi semblable que celle dans le recombinant exprimé.

4. Détection des produits par spectrométrie de masse

  1. Séparer le produit de chaque réaction chimique par une élution de gradient de 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) à un débit de 0,300 'L/min avec un système nano-HPLC qui est directement interfété avec le spectromètre de masse haute résolution.
    REMARQUE : La colonne analytique est en 75 m DI, longueur de 150 mm, emballée avec de la résine C-18. La phase A mobile se composait de 0,1 % d'acide formique dans l'eau, et la phase B mobile se composait de 100 % d'acétonitrile et de 0,1 % d'acide formique.
  2. Utilisez le spectromètre de masse en mode full-scan et fixez la plage m/z à 300-2 000 et la résolution à 60 000.
  3. Ouvrez les données des spectres de masse et trouvez les pics du produit à chaque étape pour confirmer que la réaction chimique est préformée avec succès.

5. ELISA d'étude de l'interaction entre les anticorps DCAF1 et 4G2

  1. Enrober une plaque de microtiter de 96 puits d'un anticorps anti-GST à 1 pmol (voir Tableau des matériaux)dans 100 ll de tampon/puits de revêtement, sceller la plaque et l'incuber à 4 oC pendant la nuit sur un shaker.
  2. Bloquer chaque puits avec 200 OL de 1 % de BSA en PBS, sceller la plaque et l'incuber à température ambiante pendant 1 h sur un shaker.
  3. Lavez chaque puits 4 fois en utilisant PBS avec 0,05% Tween 20.
  4. Ajouter la protéine antigène fondue par la TPS (0,05 pmol dans 100 l de solution de blocage) aux puits, sceller la plaque et couver pendant 2 h à température ambiante.
    REMARQUE : La protéine antigène tpsisée est exprimée en bactéries et purifiée par GSH Sepharose.
  5. Répétez l'étape 5.3 pour laver la plaque.
  6. Ajouter 1 pmol 4G2 anticorps ou 1 pmol 4G2 anticorps plus les autres ligands: antigène, Fc-III ou DCAF1 à des quantités de série (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol et 1000 pmol) dans 100 'L de solution de blocage / puits, sceller la plaque et couver 2 h à température ambiante sur un shaker.
  7. Répétez l'étape 5.3 pour laver la plaque.
  8. Ajouter l'IgG antisouris, anticorps relié sHRP (1:20 000 dilution) dans 100 l de solution de blocage/puits, sceller la plaque et couver 30 min à température ambiante sur un shaker.
  9. Lavez chaque puits 6 fois en utilisant PBS avec 0,05% Tween 20.
  10. Mélanger le réactif A et B 1:1 de TMB immédiatement avant l'utilisation, ajouter 100 l/puits, puis couver 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
  11. Ajoutez une solution d'arrêt de 100 l/puits et utilisez un lecteur de plaque pour mesurer les valeurs OD450 pour chaque puits à moins de 30 min.

6. ELISA d'étude de l'interaction entre fc-III et la molécule IgG

  1. Enrober une plaque de microtiter de 96 puits d'un anticorps anti-CA de pmol (voir Tableau des matériaux)dans 100 l'un de tampon/puits de revêtement, sceller la plaque et l'incuber à 4 oC pendant la nuit sur un shaker.
  2. Répétez les étapes de 5,2 à 5,3.
  3. Ajouter la protéine CA fusionnée Fc-III ou Fc-III-4C (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 et 1 pmol dans 100 l de solution de blocage) aux puits, sceller la plaque et incuber pendant 2 h à température ambiante.
    REMARQUE : La protéine CA fusionnée fc-III ou Fc-III-4C est exprimée en bactéries et purifiée par Ni-NTA.
  4. Répétez les étapes de 5.7 à 5.11 et vérifiez les résultats.

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Representative Results

Le diagramme de flux pour la voie de synthèse par ligature chimique indigène dans cet article est montré dans la figure 1. Les figures 2-6 montrent les chromatogrammes (A) et les spectres de masse (B) de dérivés chimiques d'hydrazine synthétisée d'un peptide Fc-III, lien recombinant exprimé et partie antigène, le produit purifié de la réaction NCL, le purifié produit de la réaction de désulfuration et du produit final purifié DCAF1, respectivement. Les chromatogrammes montrent que les purifies de tous les produits sont de plus de 90%, tandis que les spectres de masse indiquent le poids moléculaire du produit après chaque réaction. Les poids moléculaires décavolutionnels sont également indiqués dans les figures 3-6, qui reflètent le poids moléculaire précis de chaque produit. La figure 7 montre le principe de l'analyse ELISA (A) et les résultats du peptide antigène, du Fc-III et du DCAF1 inhibant la fixation des anticorps 4G2. Le peptide d'antigène et Le DCAF1 bloquent de manière significative la liaison 4G2, tandis que le peptide fc-III n'affecte pas l'interaction antigène-anticorps.

Figure 1
Figure 1. Le flux de travail de la méthode de ligature chimique indigène pour la semi-synthèse de la molécule DCAF1.
Tout d'abord, le dérivé de l'hydrazine d'un peptide Fc-III est obtenu par synthèse de peptide de phase solide. Ensuite, le lien et la partie antigène fusionnés par l'étiquette SUMO sont exprimés et purifiés à partir de bactéries, suivis du clivage de l'étiquette SUMO. Après la réaction nCL des deux fragments, le produit subit la désulfurisation et l'élimination des groupes Acm pour devenir la molécule DCAF1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Le chromatogramme et le spectre de masse du dérivé d'hydrazine d'un peptide de Fc-III.
Cette figure montre que le profil LC du peptide purifié (A) et le pic mono-isotope à m/z 915,92 correspondaient au peptide chargé par duple (B). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 10, figure 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. Le chromatogramme et le spectre de masse du linker et de la partie antigène.
Cette figure montre le profil LC du fragment purifié (A) et le poids moléculaire déconvolutionnel de ce fragment est calculé comme 9429.0 du spectre de masse (B). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 10, figure S2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. Le chromatogramme et le spectre de masse du produit de conjugaison par réaction de NCL.
Cette figure montre le profil LC surveillant le produit de ligature à 0 h (en haut), 12 h (au milieu) et le peptide purifié (en bas) (A) et le poids moléculaire décavolutionnel de ce produit est calculé comme 11227.0 à partir du spectre de masse (B). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 10, figure S2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5. Le chromatogramme et le spectre de masse du produit après réaction de désulfuration.
Ce chiffre montre le profil LC du produit purifié (A) et le poids moléculaire déconvolutionnel de ce produit est calculé comme 11195.0 du spectre de masse (B). Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 10, figure S2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6. Le chromatogramme, le spectre de masse et les spectres de CD de la molécule DCAF1.
Cette figure montre le profil LC du DCAF1 purifié (A), le poids moléculaire décontaurionne de cette molécule calculé comme 11053.0 du spectre de masse (B) et les spectres De CD du produit final (ligne solide) et la partie linker-antigène ( dash) en FCAF1. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 10, figure 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7. ELISA d'une molécule DCAF1.
(A) Le flux de travail du sandwich ELISA. Le premier anticorps anti-TPS est enduit sur une plaque de puits. Ensuite, le peptide antigène à la TPS est incubé. Ensuite, l'anticorps 4G2 avec différentes concentrations de DCAF1, d'antigène ou de Fc-III est ajouté pour l'analyse colorimétrique. (B) Les résultats ELSIA de l'antigène, Fc-III et DCAF1 démontrant des effets d'inhibition de la liaison 4G2 en utilisant différentes concentrations de ligand. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole décrit ici la semi-synthèse et la détection de DCAF1 en utilisant l'approche NCL, qui est montrée dans la figure 1. En bref, les deux fragments de DCAF1 sont synthétisés chimiquement et recombinantement exprimés, respectivement ; ensuite, la molécule DCAF1 pleine longueur est assemblée, modifiée et purifiée. Pour la synthèse de fragments de Fc-III dérivée de l'hydrazine, l'utilisation de résine 2-Cl de faible capacité est très importante, car la capacité élevée a un effet négatif pour la production d'hydrazine et conduit à un faible rendement du produit. La partie de liaison et d'antigène sont exprimées avec l'étiquette SUMO pour deux raisons : premièrement, l'étiquette sumO peut augmenter la solubilité des protéines de fusion ; deuxièmement, sumO protease est une protéase reconnue par la conformation, qui permet au produit libéré de commencer avec des résidus de Cys pour la réaction de ligature. L'une des étapes les plus critiques dans l'expression et la purification des protéines est le clivage de protéase SUMO. La concentration de protéines fusionnées par le TAG SUMO doit être ajustée à la plage appropriée. Une concentration trop élevée ou trop faible entraînerait une agrégation de protéines ou des difficultés pour la purification ultérieure après la digestion. Une autre étape critique de ce protocole est d'ajuster la valeur du pH pendant la réaction NCL, qui est basée sur l'échange thiol-ester qui devrait se produire dans le tampon neutre. Le contrôle fin de la valeur de pH dans le tampon de réaction est utile pour améliorer l'efficacité de ligature.

Ce protocole convient à la synthèse d'autres molécules DCAF avec différentes séquences d'antigènes, parce que les séquences de différentes molécules DCAF sont assez similaires et la partie antigène contribue généralement peu à l'ensemble de la structure et la nature de DCAF. Par exemple, nous avons utilisé ce protocole pour synthétiser trois autres molécules de DCAF pour cibler leurs anticorps cognate. Parmi eux, DCAF4 a été conçu pour bloquer l'anticorps mAb35, qui peut neutraliser le récepteur de l'acétylcholine et causer des gravis de myasthénie dans un modèle de rat. Nous avons utilisé DCAF4 pour réduire les symptômes cliniques chez le rat avec des gravis de myasthénieinduite par mAb35, et sauver le récepteur d'acétylcholine en inhibant les protéines de composant de complément.

L'application de notre technique est limitée par plusieurs facteurs : premièrement, le rendement de la molécule DCAF synthétisée par l'approche actuelle est faible (généralement inférieur à 10%) en raison des étapes de purification multiples; deuxièmement, les anticorps ayant des déterminants conformationnels sont difficiles à cibler par le DCAF; troisièmement, le DCAF peut induire une réponse immunitaire supplémentaire chez les organismes par rapport aux petits composés traditionnels. Nous envisageons que l'application de ce protocole à d'autres conditions pathologiques induites par les anticorps aidera à synthétiser plus de molécules DCAF pour éliminer les anticorps nocifs ciblés.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation Tsinghua University-Gates (non. OPP1021992), la National Natural Science Foundation of China (no. 21502103, 21877068 et 041301475), et le National Key Research and Development Program of China (no. 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Rétraction Numéro 151 DCAF thérapie ciblée anticorps ligature chimique indigène synthèse de peptide de phase solide expression et purification de protéine ELISA
Blocage ciblé d'anticorps par un conjugaison bifonctionnel de peptide antigénique et de mimétrie fc-III (DCAF)
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Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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