Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Riktad antikropp blockering av en dual-funktionell konjugat av antigen peptid och FC-III mimetika (DCAF)

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

Utveckling av en dual-funktionell konjugat av antigen peptid och FC-III mimetika (DCAF) är nytt för eliminering av skadliga antikroppar. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för syntes av DCAF1 molekyl, som selektivt kan blockera 4G2 antikropp för att eliminera antikroppsberoende förbättring effekt under Dengue virusinfektion.

Abstract

Eliminering av skadliga antikroppar mot organismer är en värdefull metod för ingripande av antikroppsrelaterade sjukdomar, såsom denguefeber och autoimmuna sjukdomar. Eftersom tusentals antikroppar med olika epitoper cirkulerar i blod, har ingen universell metod, med undantag för Dual-funktionell konjugat av antigen peptid och FC-III mimetika (DCAF), rapporterats att rikta specifika skadliga antikroppar. Utvecklingen av DCAF molekyler ger betydande bidrag till utvecklingen av riktad terapi, som visades för att eliminera antikroppsberoende Enhancement (ADE) effekt i en Dengue virus (DENV) infektion modell och att öka acetylkolin receptor aktivitet i en myasthenia gravis-modell. Här beskriver vi ett protokoll för syntes av en DCAF-molekyl (DCAF1), som selektivt kan blockera 4G2-antikroppar för att dämpa ADE-effekten under Denguevirusinfektion, och illustrera bindningen av DCAF1 till 4G2-antikroppar med en ELISA-analys. I vår metod, DCAF1 syntetiseras av konjugering av en hydrazin derivat av en FC-III peptid och en rekombinant uttryckt lång α-Helix med antigen sekvens genom inhemska kemisk ligering (NCL). Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt på DCAF1 samt andra DCAF molekyler för att rikta sina besläktat antikroppar.

Introduction

Antikroppar spelar viktiga roller i humorala immunsvaret för neutraliseringen av patogena bakterier och virus1. Emellertid, vissa antikroppar uppvisar skadliga effekter på organismer, såsom cross-reaktiva antikroppar i ade-effekten under denV-infektion och over-reaktiva antikroppar i myasthenia gravis, som är en autoimmuna sjukdomar2,3. ADE-effekten medieras av de tvär reaktiva antikropparna som gör att bryggan ansluter denV och FC-receptorn som visar cellerna4,5, medanmyasthenia gravis orsakas av de överdrivna antikropparna som angriper acetylkolinreceptorer mellan cell-cell korsningar i muskelvävnad6,7. Även om delvis effektiva metoder har utvecklats för att behandla dessa sjukdomar8,9, skulle otvivelaktigt direkt eliminering av dessa skadliga antikroppar göra framsteg för insatserna.

Nyligen har DCAF-molekyler, som har Dual-funktionella grupper, utvecklats för riktade antikroppar blockering10. DCAF är en lång peptid som består av 3 delar: 1) en antigen del som kan specifikt känna igen den besläktat antikroppen, 2) en FC-III eller FC-III-4c tagg för starkt bindning till FC regionen av antikroppen att hämma antingen FC-receptorn eller komplement komponent proteiner , 3) en lång α-spiralformade länkare som konjugatar dessa två funktionella grupper10. Den länkare del, designad från Moesin FERM domän, var optimerad av Rosseta programvara för att säkerställa antigen del och FC-III del i en DCAF molekyl kan binda till Fab och FC regioner av IgG samtidigt. Fyra DCAF molekyler har syntetiserats för att rikta 4 olika antikroppar, bland dem DCAF1 användes för att eliminera 4G2 antikropp, som är en cross-reaktiv antikropp under DENV infektion att bidra till ADE effekt; och DACF4 var avsedd för räddning av acetylkolinreceptorer genom att blockera mab35 antikropp i myasthenia gravis10.

I den aktuella studien, tagen DCAF1 som exempel, visade vi protokollen för syntes av DCAF-molekylen och upptäckten av interaktionen mellan en DCAF och dess besläktat antikropp. Den DCAF1 är semi-syntetiseras av NCL-metoden11,12,13,14, som konjugatet hydrazin derivatan av en FC-III peptid och de uttryckta Linker-antigen delar tillsammans. NCL-metoden har betydande fördelar jämfört med helt kemisk syntes och helt rekombinant uttryck för DCAF1 syntes, eftersom båda dessa metoder leder till låg avkastning och höga kostnader. Den nuvarande metoden är inte bara det mest kostnadseffektiva sättet att få full längd DCAF, men också kan upprätthålla konformation av länkaren del liknande som sin ursprungliga form. Eftersom olika DCAF-molekyler har liknande sekvenser med undantag för antigendelarna, kan våra metoder för DCAF1 syntes och interaktions analysen mellan DCAF1 och 4g2-antikroppar appliceras på andra DCAF-molekyler för att målinriktat blockera deras besläktat-antikroppar också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kemisk syntes av hydrazinderivatet av en FC-III-peptid

  1. Konvertera 2-cl-(TRT)-cl harts till 2-cl-(TRT)-NHNH2 harts
    1. Väg 625 mg 2-cl-(TRT)-cl harts (0,25 mmol) till ett 25 mL peptid syntes kärl.
    2. Tillsätt 5 mL N, N-dimetylformamid (DMF) till kådan från fartygets ovansida, sätt tillbaka locket, skaka försiktigt kärlet i 15 s och Töm det sedan. Upprepa DMF-tvättning ytterligare två gånger.
    3. Tillsätt 5 mL diklormetan (DCM) till kärlet, sätt tillbaka locket, skaka försiktigt kärlet i 15 s och Töm det sedan. Upprepa DCM-tvättningen ytterligare två gånger.
    4. Upprepa steg 1.1.2 tre gånger.
    5. Använd 6 mL av 50% (VOL/VOL) DMF/DCM att svälla kådan i 30 min, och sedan dränera den.
    6. Överför 6 mL 5% (VOL/VOL) NH2NH2 i DMF till reaktionskärlet, skaka blandningen vid 120 rpm, 30 ° c i 30 min, och sedan dränera lösningen med vakuumpump.
      Anmärkning: Tillsätt 0,3 mL hydrazin hydrat till 5,7 mL DMF för att få 5% (VOL/VOL) NH2NH 2. Nyförbered NH2NH2 före användning.
      FÖRSIKTIGHET: hydrazin hydrat är ett farligt ämne och kan orsaka cancer. Använd en labbrock, handskar och en mask. Utföra experimenten i ett draghuv.
    7. Tillsätt 5 mL DMF till kärlet, skaka det försiktigt i 15 s och Töm det sedan.
    8. Upprepa steg 1.1.6 och sedan tvätta kådan genom att upprepa steg 1.1.2-1.1.4 för två gånger.
    9. Tillsätt 6 mL 5% (VOL/VOL) MeOH/DMF till kärlet, skaka den försiktigt i 10 minuter och Töm den sedan.
      Obs: detta steg är mycket viktigt att säkerställa att oreagerade platser på hartset är utjämnade.
    10. Tvätta hartset grundligt genom att upprepa stegen 1.1.2-1.1.4.
    11. Tillsätt 5 mL DCM till hartset, skaka den försiktigt i 15 s och sedan tömma den för att få 2-cl-(TRT)-NHNH2 harts.
      Obs: hartset blir gult eller ljusgrön när ersättningen är lyckad.
  2. Peptid förlängning
    1. Tillsätt 1 mmol av fmoc-Ala-OH (934 mg) och 0,95 mmol 1-[bis (dimethylamino) Methylene]-1H-1, 2, 3-triazolo-[4,5-b] specificiteten hexafluorofosfat 3-oxid (Hatu) (360 mg) i en 5 ml tub innehållande 3 ml DMF.
      Varning: exponering för HATU kan orsaka en allergisk reaktion. Använd en labbrock, handskar och en mask.
    2. Tillsätt 2 mmol N, N-diisopropylethylamin (DIEA) (0,36 mL) till den upplösta lösningen och Vortex i 0,5 – 1 min.
      Anmärkning: kritiskt steg: aktiveringen ska inte ta mer än 5 min, eftersom de aktiverade aminosyrorna Etenon från de mer aktiva O-formerna till de mindre aktiva N-formerna över tid.
    3. Lägg till den aktiverade Fmoc-Ala-OH till reaktionskärlet som innehåller 2-cl-(TRT)-NHNH2 harts, beredd från steg 1,1. Skaka försiktigt vid 120 rpm, 30 ° c i 20 minuter i en skakapparat med konstant temperatur och töm sedan lösningen med vakuumpump.
    4. Tillsätt 5 mL DMF för att tvätta kådan, skaka den försiktigt i 15 s och Töm den sedan.
    5. Tillsätt 1 mmol av Fmoc-Ala-OH (934 mg) och 0,95 mmol 2-(6-klor-1H-benzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetramethylaminium hexafluorofosfat (HCTU) (390 mg) i en 5 mL tub innehållande 3 mL DMF.
      Varning: exponering för HCTU kan orsaka en allergisk reaktion. Använd en labbrock, handskar och en mask.
    6. Tillsätt 2 mmol DIEA (0,36 mL) till röret och virvel i 0,5 – 1 min för att lösa upp den.
    7. Lägg till den aktiverade Fmoc-Ala-OH till reaktionskärlet. Skaka försiktigt vid 120 rpm, 30 ° c i 40-60 min i en skakapparat med konstant temperatur och töm sedan lösningen med vakuumpump.
    8. Tvätta kådan genom att upprepa stegen 1.1.2-1.1.4.
    9. Tillsätt 4 mL 20% (VOL/VOL) piperidin i DMF till hartset, skaka den försiktigt i 5 minuter vid rumstemperatur och töm sedan lösningen.
      FÖRSIKTIGHET: pyridin är mycket brandfarlig och giftig. Utföra experimenten i ett draghuv.
    10. Tillsätt ytterligare 4 mL 20% (VOL/VOL) piperidin i DMF till hartset, skaka den försiktigt i 15 minuter vid rumstemperatur och töm sedan lösningen.
    11. Följ stegen 1.2.1-1.2.10 till par och DEPROTECT Fmoc-Ala-OH, Fmoc-THR-OH, Fmoc-CYS-OH, Fmoc-hans-OH och Fmoc-Ala-OH. Upprepa steg 1.2.5-1.2.10 till par och DEPROTECT Fmoc-TRP-OH, Fmoc-val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-GLU-OH, Fmoc-GLY-OH och Fmoc-ASP-OH.
    12. Upprepa steg 1.1.2-1.1.4 för att tvätta hartset grundligt.
    13. Upprepa steg 1.1.3 för att tvätta hartset och sedan dammsuga kådan i 5 min.
  3. Klyvning av hydrazin härledda FC-III rå peptid
    1. Tillsätt 12 mL cocktails trifluorättiksyra (TFA)/2, 2 ′-(etylenedioxy) diethanethiol (DODT)/triisopropylsilane (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) till hartset, och sedan använda en konstant-temperatur shaker att klyva peptiden från hartset vid 200 rpm, 37 ° c ca 2 h. filtrera blandningen i ett 50 mL centrifugertub.
    2. Tillsätt 1 mL cocktails i kådan för att tvätta den och samla upp filtratet i 50 mL centrifugertub. Upprepa två gånger.
    3. Koncentrera blandningen till 2 mL med en vaper lika rotor i ett draghuv, och tillsätt sedan 20 mL förfuktad dietyleter i röret för att fälla ut råa peptider.
      Anmärkning: den vattenfria etern bör förhandas till 0 ° c för att undvika våldsam värme frisättning, vilket kan orsaka biverkningar av den råa peptiden.
    4. Inkubera peptidnederbörden vid-20 ° c för 1-2 h.
    5. Centrifugera vid 5 000 x g, 4 ° c i 10 min och ta försiktigt bort lösningsmedlet från centrifugerröret.
    6. Tillsätt 20 mL förfuktad dietyleter i röret två gånger enligt stegen 1.3.3-1.3.5 för att tvätta nederbörden. Lufttorka peptidprodukten i ett urglas i ca 15 min. Förvara de torkade råa peptiderna vid 4 ° c för vidare analys.
  4. Rening av hydrazinderivaten av en FC-III peptid
    1. Använd högtrycksvätskekromatografi (HPLC)-systemet för att rena peptiden med en 30 minuters lutning eluering (0-1 min,5% B; 1-20 min, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) med en flödeshastighet på 1 mL/min.
      Obs: kolonnen är i 4,6 mm ID, 250 mm längd, packad med C-18 harts. Mobil fas A bestod av 0,1% TFA i vatten, och mobil fas B bestod av 100% acetonitril och 0,1% TFA.

2. protein uttryck och rening av Linker och antigen delar

  1. Plasmid konstruktion
    1. Syntetisera hela gensekvensen som kan uttrycka SUMO-Linker-antigen (se tabell över material).
    2. Skär 10 ng av PET-28a tom vektor och 50 ng av syntetiserade SUMO-Linker-antigen DNA-fragment med hjälp av NcoI och XhoI i en 37 ° c vattenbad för 3 h.
    3. Rena dubbel-enzym smält vektor och DNA-fragment av DNA gel Extraction Kit.
    4. Tillsätt 5 μL DNA-smält DNA-fragment, 5 μL smält vektor, 1 μL T4 DNA Ligase, 2 μL 10X ligasbuffert och 7 μL ddH2O till ett reaktionsrör, och inkubera sedan över natten vid 16 ° c.
    5. Blanda 10 μL av ligationsprodukten från steg 2.1.4 till 100 μL av kompetenta celler (DH5α) och Lägg den på ett isbad i 30 min. sätt de behöriga cellerna till en 42 ° c vattenbad för 90 s och snabbt överföra den till ett isbad i 2 min. Tillsätt 800 mL av LB flytande medium (utan antibiotika) till röret och skaka den vid 37 ° c, 180 RPM för 1 h. Täck de behöriga cellerna på en kanamycin LB-platta för att göra dem jämnt fördelade och placera plattan i en inkubator på 37 ° c över natten.
    6. Välj 5 enkla kolonier från plattan och odla bakterierna i 5 mL LB-medium i ett provrör med en skakapparat på 37 ° c.
    7. Extrahera plasmider från bakterierna som skördats från steg 2.1.6 med hjälp av plasmid Extraction Kit.
    8. Skicka plasmiderna för gensekvensering och välj den positiva kolonin som kan uttrycka SUMO-Linker-antigen fusionsprotein. Omvandla den positiva plasmid till BL21 (DE3) plysS kompetenta celler efter steg 2.1.5.
  2. Protein rening
    1. Välj en enda koloni av transformanter från steg 2.1.7 till 5 mL LB flytande medium innehållande kanamycin (50 μg/mL). Skaka kulturerna över natten vid 200 rpm, 37 ° c.
    2. Inokulera 1 L föruppvärmd lb-medium innehållande kanamycin (50 μg/ml) i en kolv med 5 ml av över natten kulturer, och växa vid 37 ° c med kraftig skakning, tills OD600 är 0,6.
    3. Tillsätt isopropylalkohol β-D-thiogalactoside (IPTG) i mediet till slutkoncentrationen 0,4 mM och skaka kolven vid 200 rpm över natten vid 20 ° c.
      Obs: låg temperatur för protein induktion är viktigt att undvika inkludering kropps bildning, så se till att temperaturen inte är mer än 22 ° c.
    4. Efter skörd av cellerna, tillsätt 50 mL lyseringsbuffert till cell pellets att Omsuspendera cellerna. Sonikera cellen celllysat två gånger för 5 min vid 200 W, ultraljud 3 s, intervall 3 s på is. Centrifugera den vid 15 000 x g i 30 min vid 4 ° c för att samla upp supernatanterna.
      Obs: lyseringsbufferten består av 50 mM NaH2Po4, 300 mm NaCl, 10 mm Imidazol. Justera pH-värdet till 8,0 med hjälp av NaOH.
    5. Tillsätt 2 mL av 50% ni-NTA Sephorase, jämställas med lyseringsbuffert, till de renade supernatanterna och blanda försiktigt genom att skaka (200 rpm på en roterande skakapparat) vid 4 ° c i 1 h.
    6. Ladda lysate och ni-NTA blandningen i en kolumn med botten utlopp utjämnade, och ta bort bottenlocket och kassera kolonnen genomflöde.
    7. Tvätta tre gånger med 6 mL tvättbuffert, och sedan eluera det riktade proteinet 3 gånger med 1,5 mL elueringbuffert. Samla eluatet i ett rör.
      Anmärkning: tvättbufferten består av 50 mM NaH2Po4, 300 mm NaCl, 30 mm Imidazol. Justera pH-värdet till 8,0 med hjälp av NaOH. Elutionsbufferten består av 50 mM NaH2Po4, 300 mm NaCl, 250 mm Imidazol. Justera pH-värdet till 8,0 med hjälp av NaOH.
    8. Sätt eluatet i en dialys påse i 1 L 50 mM PBS vid 4 ° c för att avsalta proteinet. Ersätt ny fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 3 gånger.
  3. Klyvning av SUMO taggen
    1. Tillsätt 2 mL liten ubiquitin-liknande modifierare (SUMO) märkt protein vid koncentrationen 1 mg/mL, 1 mL SUMO-proteas (se tabell över material), 1 ml 10X Sumoproteasbuffert och 6 ml DDH2O för att bereda reaktions lösningen.
      Observera: SUMO tag proteinkoncentration är ca 1 mg/mL. Överdriven koncentrationer efter enzym nedbrytning kan orsaka koagulering av proteinet.
    2. Inkubera blandningen i 12-16 h vid 4 ° c.
    3. Centrifugera blandningen vid 15 000 x g i 10 min vid 4 ° c och kassera aggregaten. Tillsätt 0,5 mL av den 50% ni-NTA-slurry, som jämställas med 50 mM PBS, till de 10 mL godkända supernatanterna och blanda försiktigt genom att skaka (200 rpm på en roterande skakapparat) vid 4 ° c i 60 min.
    4. Ladda lysate och ni-NTA blandningen i en kolumn med botten utlopp utjämnat. Ta bort den undre locket och sedan spara flödet genom att en 15 mL Centrifugera röret.
      Obs: Histagged SUMO protein är bindande för kolonnen. Den Linker-antigen del, som börjar med CYS för NCL reaktion, är i flödet genom.
    5. Centrifugera flödet genom vid 15 000 x g i 10 min vid 4 ° c och kassera aggregaten. Rena Linker-antigendelen med HPLC med en 25 minuters lutning eluering (0-1 min,5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) med en flödeshastighet på 1 mL/min.
      Obs: kolonnen är i 4,6 mm ID, 250 mm längd, packad med C-18 harts. Mobil fas A bestod av 0,1% TFA i vatten, och mobil fas B bestod av 100% acetonitril och 0,1% TFA.
    6. Samla den renade produkten från HPLC, och sedan frysa-torka över natten för att få Linker-antigen produkten.

3. montering av DCAF1 av inhemska kemisk ligering

  1. Konjugating FC-III peptid och Linker-antigen del tillsammans
    1. Väg 1,8 mg (1 μmol) av hydrazin derivat av en FC-III peptid i en 2 mL EP-rör och tillsätt 0,8 mL 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2Po4 (pH 3,0) lösning för att lösa upp det genom vortexing.
      Anmärkning: 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2Po4 (pH 3,0) lösning bereds genom att justera pH-värdet med HCL eller NaOH.
      FÖRSIKTIGHET: NaOH och HCl är starkt frätande. Använd en labbrock, handskar och en mask.
    2. Efter centrifugering röret vid 7 200 x g för 1 min vid rumstemperatur, sätta röret i ett isSalt bad och använda magnetisk omrörning för att agitera lösningen för 15 min försiktigt.
    3. Tillsätt 40 μL av 0,5 M NaNO2 till lösningen för att oxidera hydrazingruppen. Skaka försiktigt lösningen i ytterligare 15 minuter i issaltbadet.
    4. Väg och tillsätt 11 mg renad Linker-antigen del beredd från steg 2,3 och 13,6 mg 4-merkaptofenylättiksyra (MPAA) i reaktionsröret i is-saltbadet, rör om i 5 min, och sedan justera pH-värdet till 6,8-7,0 vid rumstemperatur med 6 M NaOH.
      Anmärkning: att justera pH-värdet till neutral är det kritiska steget för att initiera ligeringsreaktionen.
    5. Efter 12 h, tillsätt 0,4 mL 0,1 M tris (2-carboxyethyl) fosforhydroklorid (TCEP) neutral lösning (pH 7,0) till Reaktionssystemet och rör om 20 min för att avsluta reaktionen.
      Anmärkning: 0,1 M TCEP neutral lösning (pH 7,0) bereds genom att lösa TCEP i 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2Po4 (pH 3,0) lösning, och använda NaOH att justera pH-värdet till 7,0.
    6. Centrifugera röret vid 15 000 x g i 10 min, analysera och rena ligationsprodukten med HPLC med en 26 min lutning eluering (0-1 min,5% b; 1-21 min, 45% b; 21-22 min, 85% b; 22-26 min, 85% b) med en flödeshastighet på 1 ml/min. Den förväntade avkastningen för ligeringreaktionen är över 50%.
      Obs: kolonnen är i 4,6 mm ID, 250 mm längd, packad med C-18 harts. Mobil fas A bestod av 0,1% TFA i vatten, och mobil fas B bestod av 100% acetonitril och 0,1% TFA.
  2. Desulfurization av konjugaten
    1. Lös konjugaten (3,4 mg, 0,3 μmol) beredd från steg 3.1.6 i 50 μL av 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2Po4 (pH 7,0) lösning.
    2. Tillsätt 50 μL av 1 M TCEP, 10 μL tBuSH och 5 μL 0,1 M VA-044 lösning till ovanstående blandning.
      Anmärkning: 0,1 M VA-044 lösning bereds genom upplösning 9,7 mg VA-044 pulver till 0,3 mL 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2Po4 (pH 7,0) lösning. Den VA-044 lösning bör förberedas nyligen före användning, som VA-044 är lätt oxideras genom exponering för luft.
    3. Justera den slutliga pH-värdet i lösningen till 6,9 och hålla solutiomat 37 ° c under omrörning för ca 5 h.
    4. Centrifugera röret vid 15 000 x g i 10 min och ta bort det olösliga ämnet. Analysera och rena ligationsprodukten med HPLC med en 26 min lutning eluering (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) med en flödeshastighet på 1 mL/min. Den förväntade avkastningen för avsvavling reaktionen är ca 40%.
      Obs: kolonnen är i 4,6 mm ID, 250 mm längd, packad med C-18 harts. Mobil fas A bestod av 0,1% TFA i vatten, och mobil fas B bestod av 100% acetonitril och 0,1% TFA.
  3. Borttagning av ACM för att få slutprodukten DCAF1
    1. Lös upp peptiden (1,35 mg, 0,11 μmol) som bereds från steg 3.2.4 i 200 μL av 32 mM AgOAc, och rör sedan reaktionsblandningen vid rumstemperatur i 4 timmar.
    2. Tillsätt 3 μL 1M Ditiothreitol (DTT) i 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2Po4 (pH 7,0) lösning för att omvandla silver thiolates på peptid till fria tioler.
    3. Efter våldsamt omrörning under 1 min, Centrifugera röret vid 15 000 x g i 10 min för att kassera det olösliga ämnet. Analysera och rena slutprodukten med HPLC med en 26 min lutning eluering (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) med en flödeshastighet på 1 mL/min. Den förväntade avkastningen för ACM deprotection reaktionen är ca 30%.
      Obs: kolonnen är i 4,6 mm ID, 250 mm längd, packad med C-18 harts. Mobil fas A bestod av 0,1% TFA i vatten, och mobil fas B bestod av 100% acetonitril och 0,1% TFA.
    4. Efter HPLC-rening, frys-torka slutprodukten över natten, och lös upp pulvret i PBS (50 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 8,0). Centrifugera röret vid 15 000 x g i 10 min vid 4 ° c och kassera pelleten.
    5. Justera koncentrationerna av slutprodukten (från steg 3,4) och Linker-antigen del (från steg 2.3.6) till 10 μM, registrera cirkulär dichroism (CD) Spectra från 260 till 195 nm av dessa två produkter med hjälp av en CD-spektrometer vid 25 ° c med 1 mm Stig längd.
      Obs: CD-spektra används för att demonstrera hur mycket α spiralformade strukturen i slutprodukten är lika lika som den i rekombinant uttryckt.

4. detektion av produkter med masspektrometri

  1. Separera produkten från varje kemisk reaktion med en 60 min lutning eluering(0-8 min, 2% B; 8-10 min,5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) med en flödeshastighet på 0,300 μL/min med en Nano-HPLC-system som är direkt sammanstött med högupplöst masspektrometer.
    Anmärkning: den analytiska kolumnen är i 75 μm ID, 150 mm längd, packad med C-18 harts. Mobil fas A bestod av 0,1% myrsyra i vatten, och mobil fas B bestod av 100% acetonitril och 0,1% myrsyra.
  2. Använd masspektrometern i full skanningsläge och Ställ in m/z-intervallet på 300-2000 och upplösning vid 60 000.
  3. Öppna massan Spectra data och hitta topparna av produkten i varje steg för att bekräfta den kemiska reaktionen är framgångsrikt förformade.

5. ELISA-analys av interaktionen mellan DCAF1-och 4G2-antikroppar

  1. Täck en 96-brunn mikrotiterplatta med 1 pmol anti-GST antikropp (se tabell över material) i 100 μl beläggning buffert/brunn, täta plattan och inkubera den vid 4 ° c över natten i en shaker.
  2. Blockera varje brunn med 200 μL 1% BSA i PBS, försegla plattan och inkubera den vid rumstemperatur i 1 h i en shaker.
  3. Tvätta varje brunn 4 gånger med hjälp av PBS med 0,05% Tween 20.
  4. Tillsätt GST-smält antigen proteinet (0,05 pmol i 100 μL blockerande lösning) till brunnarna, försegla plattan och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
    Anmärkning: GST-smält antigen protein uttrycks i bakterier och renas genom GSH Sepharose.
  5. Upprepa steg 5,3 för att tvätta plattan.
  6. Tillsätt 1 pmol 4G2-antikropp eller 1 pmol 4G2-antikropp plus övriga ligander: antigen, FC-III eller DCAF1 i serie mängder (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol och 1000 pmol) i 100 μL blockerande lösning/brunn, försegla plattan och inkubera 2 h vid rumstemperatur i en shaker
  7. Upprepa steg 5,3 för att tvätta plattan.
  8. Lägg till anti-Mouse IgG, HRP-bunden antikropp (1:20000 spädning) i 100 μL blockerande lösning/brunn, försegla plattan och inkubera 30 min vid rumstemperatur i en shaker.
  9. Tvätta varje brunn 6 gånger med hjälp av PBS med 0,05% Tween 20.
  10. Blanda TMB reagens A och B 1:1 i volym omedelbart före användning, tillsätt 100 μL/brunn, och inkubera sedan 30 min vid rumstemperatur i mörker.
  11. Tillsätt 100 μL/brunn stopplösning och Använd en Plattläsare för att mäta OD450 -värdena för varje brunn inom 30 min.

6. ELISA-analys av interaktionen mellan FC-III-och IgG-molekylen

  1. Täck en 96-väl mikrotiterplatta med 1 pmol anti-CA-antikropp (se tabell över material) i 100 μl beläggningsbuffert/brunn, försegla plattan och inkubera den vid 4 ° c över natten i en shaker.
  2. Upprepa steg från 5,2 till 5,3.
  3. Tillsätt FC-III-eller FC-III-4C-smält proteinet (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 och 1 pmol i 100 μL blockerande lösning) till brunnarna, försegla plattan och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
    Anmärkning: FC-III eller FC-III-4C smält CA protein uttrycks i bakterier och renas genom ni-NTA.
  4. Upprepa stegen från 5,7 till 5,11 och kontrollera resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flödesschemat för syntes rutten genom ursprunglig kemisk ligering i den här artikeln visas i figur 1. Figurerna 2-6 visar kromatogrammen (a) och Mass spektra (B) av kemiskt syntetiserade Hydrazinderivat av en FC-III-peptid, rekombinant uttryckt länkare och antigen del, den renade produkten från NCL-reaktionen, den renade produkt från desulfuriseringsreaktion och den renade slutprodukten DCAF1, respektive. Kromatogrammen visar de renar av alla produkter är över 90%, medan massan spektra anger molekylvikt av produkten efter varje reaktion. De deconvolutionella molekylära vikter visas också i diagram 3-6, som återspeglar den exakta molekylvikten för varje produkt. Figur 7 visar principen för Elisa-analys (a) och resultaten av antigen peptid, FC-III och DCAF1 kompetitivt hämmande 4G2 antikroppsbindning. Både antigen peptid och DCAF1 signifikant block 4G2 bindning, medan FC-III peptid påverkar inte antigen-antikroppsinteraktion.

Figure 1
Figur 1. Arbetsflödet av den infödda kemiska ligationsmetoden för semisyntesen av DCAF1 molekylen.
Först, hydrazin derivatan av en FC-III peptid erhålls genom fast fas peptid syntes. Sedan sumotaggen smält länkare och antigen del uttrycks och renas från bakterier, följt av SUMO tag klyvning. Efter NCL reaktion av de två fragmenten, genomgår produkten avsvavling och ta bort ACM grupper att bli DCAF1 molekyl. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Kromatogrammet och Mass spektrumet av hydrazinderivaten av en FC-III-peptid.
Denna siffra visar att LC-profilen för den renade peptiden (a) och mono-isotoptoppen vid m/z 915,92 matchade den dupel laddade peptiden (B). Denna siffra har modifierats från referens 10, figur 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Kromatogrammet och Mass spektrumet av länkaren och antigen delen.
Denna siffra visar LC-profilen för det renade fragmentet (a) och den deconvolutionella molekylvikten för detta fragment beräknas som 9429,0 från Mass spektrumet (B). Denna siffra har modifierats från referens 10, figur S2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Kromatogrammet och Mass spektrumet av konjugeringsmedlet med NCL-reaktion.
Denna siffra visar LC-profilen övervakning av ligeringsprodukten vid 0 h (topp), 12 h (mitten) och den renade peptiden (botten) (a) och den deconvolutionella molekylvikten för denna produkt beräknas som 11227,0 från Mass spektrumet (B). Denna siffra har modifierats från referens 10, figur S2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Kromatogrammet och massspektrat av produkten efter utsvavning reaktion.
Denna siffra visar LC-profilen för den renade produkten (a) och den deconvolutionella molekylvikten för denna produkt beräknas som 11195,0 från Mass spektrumet (B). Denna siffra har modifierats från referens 10, figur S2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Kromatogrammet, Mass spektrum och CD-spektra av DCAF1 molekylen.
Denna siffra visar LC-profilen för den renade DCAF1 (a), den deconvolutionella molekylvikten för denna molekyl beräknad som 11053,0 från Mass spektrumet (B) och CD-spektrat för slutprodukten (heldragen linje) och Linker-antigen delen ( streck linjen) i FCAF1. Denna siffra har modifierats från referens 10, figur 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. ELISA-analys av DCAF1 molekyl.
A) arbetsflödet för Sandwich Elisa-analysen. Den första anti-GST-antikroppen är belagd på en väl plåt. Sedan inkuberas GST-smält antigen peptid. Då 4G2 antikropp med olika koncentrationer av DCAF1, antigen eller FC-III tillsätts för kolorimetrisk analys. B) Elsia-resultaten av antigen, FC-III och DCAF1 som visar hämning av 4G2-bindning med hjälp av olika ligand-koncentrationer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskriver här semisyntesen och detektion av DCAF1 med hjälp av NCL-metoden, som visas i figur 1. Kortfattat, de två fragment av DCAF1 är kemisk syntetiseras och recombinantly uttryckt, respektive; då är den fulla längden DCAF1 molekylen monterad, modifierad och renad. För hydrazin härledda FC-III fragment syntes, med låg kapacitet 2-cl harts är ganska viktigt, eftersom hög kapacitet har en negativ effekt för hydrazin generation och leder till låg avkastning av produkten. Den länkare och antigen del uttrycks med SUMO tagg av två skäl: för det första kan SUMO tagg öka lösligheten av fusions proteiner; för det andra är SUMO proteashämmare en konformation erkända proteas, som gör att frisläppt produkt att börja med CYS rester för ytterligare ligering reaktionen. En av de mest kritiska stegen i proteinuttryck och rening är SUMO proteashämmare klyvning. Koncentrationen av SUMO tag-smält protein bör justeras till rätt intervall. En för hög eller för låg koncentration skulle leda till protein aggregering eller svårighet för ytterligare rening efter matsmältningen. Ett annat kritiskt steg i detta protokoll är att justera pH-värdet under NCL reaktion, som är baserad på thiol-Ester utbyte som bör ske i neutral buffert. Fin kontroll av pH-värdet i reaktionsbufferten är till hjälp för att förbättra ligationseffektiviteten.

Detta protokoll är lämpligt för syntes av andra DCAF molekyler med olika antigen sekvenser, eftersom sekvenser av olika DCAF molekyler är ganska lika och antigen delen bidrar vanligtvis lite till hela strukturen och arten av DCAF. Till exempel använde vi detta protokoll för att syntetisera ytterligare tre DCAF molekyler för att rikta sina besläktat antikroppar. Bland dem, DCAF4 var utformad för att blockera mAb35 antikropp, som kan neutralisera acetylkolin receptor och orsaka myasthenia gravis i en råtta modell. Vi använde DCAF4 för att minska de kliniska symtomen hos råtta med mAb35-inducerad myasthenia gravis, och rädda acetylkolin receptor genom att hämma komplement komponent proteiner.

Tillämpningen av vår teknik är begränsad av flera faktorer: för det första är avkastningen av DCAF molekylen syntetiseras av den nuvarande metoden låg (vanligtvis mindre än 10%) på grund av flera reningssteg; för det andra är antikroppar med överensstämande bestämningsfaktorer svåra att rikta mot DCAF. tredje, DCAF kan inducera extra immunsvar i organismer jämfört med traditionella små sammansatta läkemedel. Vi ser att tillämpningen av detta protokoll till andra antikroppar-inducerad sjukdomstillstånd kommer att bidra till att syntetisera mer DCAF molekyler till riktade eliminera skadliga antikroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av Tsinghua University-Gates Foundation (No. OPP1021992), Kinas National Natural Science Foundation (nr 21502103, 21877068 och 041301475), och Kinas nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogram (nr 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Tags

Retraktion DCAF riktad terapi antikropp ursprunglig kemisk ligering solid fas peptid syntes proteinuttryck och rening ELISA
Riktad antikropp blockering av en dual-funktionell konjugat av antigen peptid och FC-III mimetika (DCAF)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter