Summary
Denne protokol giver en metode til at lette genereringen af definerede heterozygot eller homozygot nukleotid ændringer ved hjælp af CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller.
Abstract
Humane pluripotente stamceller tilbyder et stærkt system til at studere genfunktion og modelspecifikke mutationer, der er relevante for sygdom. Dannelsen af præcise heterozygot genetiske modifikationer er udfordrende på grund af CRISPR-CAS9 medieret Indel dannelse i den anden alleler. Her demonstrerer vi en protokol for at hjælpe med at overvinde dette problem ved at bruge to reparations skabeloner, hvor kun én udtrykker den ønskede sekvens ændring, mens begge skabeloner indeholder tavse mutationer for at forhindre re-skæring og Indel dannelse. Denne metode er mest fordelagtig for genredigering kodning regioner af DNA til at generere isogene kontrol og mutant menneskelige stamceller linjer til at studere sygdomme hos mennesker og biologi. Derudover er optimering af transfektering og screeningmetoder blevet udført for at reducere arbejdskraft og omkostninger ved et genredigerings eksperiment. Samlet set denne protokol er almindeligt gældende for mange genomredigering projekter udnytte den menneskelige pluripotente stamcelle model.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) og inducerede pluripotente stamceller (ipscs) er værdifulde værktøjer til modellering af sygdomme hos mennesker på grund af deres evne til fornyelse, samtidig med at evnen til at generere celletyper af forskellige nedstamningens1,2 ,3,4. Disse modeller åbner mulighed for at afhøre gen funktion, og forstå, hvordan specifikke mutationer og fænotyper er relateret til forskellige sygdomme5,6. Men for at forstå, hvordan en specifik ændring er knyttet til en bestemt fænotype, er brugen af en parret isogene kontrol og mutant cellelinjer vigtigt at kontrollere for linje til linje variation7,8. Transskription aktivator-lignende Effector nucleaser (TALENs) og zink finger nucleaser er blevet brugt til at generere indsættelse eller sletning (indels) mutationer i forskellige genetiske modeller, herunder primære celler; men disse nukleaser kan være besværlige at bruge og dyre9,10,11,12,13,14. Opdagelsen af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske REPEAT (crispr)-CAS9 nuclease har revolutioneret feltet på grund af effektivitet i Indel dannelse i stort set alle områder af genomet, enkelhed i brug, og reduktion i omkostninger15 , 16 , 17 , 18 , 19.
En udfordring i at bruge CRISPR-CAS9 baseret genomredigerings teknologi har været generering eller korrektion af specifikke mutationer i en allel uden at skabe en indelmutation i den anden allel20. Det vigtigste mål med denne protokol er at overvinde denne udfordring ved at bruge to enkelt-strenget oligonucleotid (ssODN) reparations skabeloner til at reducere Indel dannelse i den anden allel. Begge ssODNs er designet til at indeholde tavse mutationer for at forhindre re-skæring af CAS9 nuclease, men kun én indeholder ændringen af interesse. Denne metode øger effektiviteten af at generere en specifik heterozygot genetisk modifikation uden inducerende Indel dannelse i den anden allel. Ved hjælp af denne protokol viser genredigerende eksperimenter på seks uafhængige genomiske steder den præcise indførelse af den ønskede genomiske ændring i en allel uden indels dannelse i den anden allel og forekommer med en samlet effektivitet på ~ 10%. Den beskrevne protokol er blevet tilpasset fra Maguire et al.21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design og konstruktion af guide RNA (gRNA)
Bemærk: hver gRNA består af 2 60 base pair (BP) oligonukleotider, der er udglødet til at generere en 100 BP dobbelt strandede (DS) oligonukleogentid (figur 1a-C). Tidslinjen for gRNA design, generation og testskæring effektivitet er ca 2 uger (figur 2).
- Vælg den DNA-region af interesse at være genomredigeret og identificere 3-4 23 BP sekvenser, der passer til formatet, 5 '-G (N19) NGG-3 '. Disse sekvenser skal placeres inden for 20 BP i den region af interesse.
Bemærk: målretning kan udføres på Sense-eller anti-sense-streng. - Evaluer grna-sekvenserne for genomisk-redundans og sandsynligheden for off-Target ved hjælp af en ressource som crispor (http://crispor.tefor.net).
- Indarbejde 20 BP Target sekvens (bortset fra protospacer tilstødende motiv eller Pam) i 2 60-Mer oligonukleotider som vist (sekvenser er 5 ' til 3 ' og rød og grøn er omvendte komplementer som vist i figur 1C).
- Bestil 2 60 BP oligonukleotider fra leverandør af valg. Når oligonukleotider er modtaget, resuspension hver til en endelig koncentration på 100 μM i Hedeselskabet2O. Lav en fungerende bestand af 10 μM.
- Anneal de to oligonukleotider og generere en 100 BP dsDNA fragment ved hjælp af DNA Polymerase (tabel over materialer). Der kombineres 5 μL 10 μM fremad oligonukleotid og 5 μL 10 μM omvendt oligonukleotid i en polymerasekæde reaktion (PCR) Strip tube og inkubatorer ved 95 °C i 5 min. Afkøl reaktionen i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Opsætning af PCR som beskrevet i tabel 1. Udfør PCR-forstærkning i en termisk variator ved hjælp af parametrene beskrevet i tabel 2.
- Visualiser PCR-produkterne på en 1,5% (w/v) ethidium bromid (EtBr) agrose gel elektrophoresed på 80-100 V for 40 min. punkt 100 BP-båndet (figur 3a), VISUALISERET på en LED-lyskæde, fra gelen ved hjælp af et barberblad og renser ved hjælp af en gel ekstraktions udstyr (tabel over materialer).
2. udformning af PCR-primere til screening
- Udfør screening af det redigerede DNA ved hjælp af fremad-og omvendte PCR-primere, der er specielt designet til at forstærke en 400-500 BP-region af det pågældende gen (tabel 2). Brug DNA isoleret fra enhver kontrol IPSC linje for at bekræfte en ren amplikonen, når du udfører screening PCR.
- Visualiser PCR-produkter på en 1,5% (w/v) gel efter elektroforese ved 80-100 V i 1 time.
Bemærk: sekvensering af redigerede kloner udføres ved hjælp af en indlejret primer, der er designet efter bekræftelse af screening primer sæt. Prøverne sendes til en kommerciel kilde til sekvensering.
3. fremstilling af gRNA_cloning vektor plasmid
- For at linearisere klonings vektoren skal du tage et 1,5 mL centrifugeglas og tilføje 1-5 μg DNA fra gRNA_cloning-vektoren sammen med 4 μL af aflII-begrænsnings enzym bufferen og 1,5 ΜL aflII-restriktions enzymet. Opbring reaktionen til 24 μL af ddH2O. Bland reaktionen ved pipettering op og ned. Inkuber ved 37 °C natten over (O/N).
- Elektrophorese på en 1% agopstået gel ved 80-100 V for 1 h og punktafgifts bånd (forventet bånd størrelse er ~ 3519 BP).
- Uddrag og rense som i trin 1,6.
4. montering af gRNA Vector
- Oprette reaktioner og samle DNA-fragmenter ved hjælp af monteringssæt (tabel over materialer) ved 1:5 ratio af aflII fordøjet grna kloning vektor til 100 BP gel renset INSERT, som beskrevet i tabel 3.
- Reaktionen inkubates ved 50 °C i 15 min. reaktionen 1:3 fortyndes i ddH2O, og brug 3 μl til bakteriel omdannelse efter producentens anvisninger (tabel over materialer). Plade celler på kanamycin LB/agar plader.
- Pick 3-5 kolonier per gRNA. Hver koloni inokuleres i 4 mL LB og vokser O/N ved 37 °C i en orbital ryste inkubator.
- Rense plasmid DNA ved hjælp af en miniprep plasmid isolation kit, og sekvens hver gRNA ved hjælp af følgende primere for at sikre en vellykket kloning: Forward: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Omvendt: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.
5. test gRNA skære effektivitet
- På bestrålede murine embryonale fibroblaster (MEFs) i en 6-brønd plade, som tidligere beskrevet21. Når cellerne når 70-80% sammenblanding, forberedes transfektering Master Mix, som er beskrevet i tabel 4.
- Bland ved pipettering og Inkuber ved rt i 15 min. Tilsæt dråbevis til cellerne og Inkuber ved 37 °c for 48 h (med en medie ændring efter 24 timer).
- Høst celler til sortering efter 48 h.
- Fjern MEFs enzymatisk (tabel over materialer) med en 3 min rt inkubation.
- Skyl cellerne 1x med hESC medium (tabel 5) og skrabe til hesc medium + 10 μM Y-27632 dihydrochlorid (tabel over materialer).
- Pellet celler ved 300 x g i 3 min og resuspension i 0,5 ml hesc medium + 10 μM Y-27632 dihydrochlorid.
- Filtret ind i et 5 mL rør gennem en 35 μm celle-Strainer hætte.
- Ved hjælp af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS), Gate på levende celler og sortere de grønne fluorescerende protein (GFP) positive celler.
- Højst 1,5 x 104 sorteres direkte i en 10 cm2 skål belagt med 1:3 kælder membran matrix (tabel over materialer) og bestrålede mef'er i hesc medium (tabel 5) indeholdende Y-27632 dihydrochlorid.
- Skift medium dagligt ved hjælp af hESC-mediet (tabel 5) uden Y-27632 dihydrochlorid og manuelt plukke kloner efter 10-15 dage, når kolonier er ~ 1 mm i diameter.
- Ved hjælp af en P200 pipette og mikroskop, skrabe forsigtigt en enkelt klon og trække celler ind i pipetten.
- Disperse cellerne ved forsigtigt pipettering 3-4X i en 96 brønd plade i mediet, der er udarbejdet med kolonien.
- Dispenserer i PCR-Strip rørene til screening og pellet cellerne ved centrifugering ved 10.000 x g i 5 min. pick 20 kolonier per grna.
6. klon screening
- Isoler DNA ved at inkube celle pellets i 20 μL proteinase K buffer (tabel 5) (1 t ved 55 °c og 10 min ved 95 °c) og vortex kraftigt. Centrifugeres ved 10.000 x g i 5 minutter og opsamles supernatanten.
- Udfør screening PCR (afsnit 2) i et samlet volumen på 20 μL ved hjælp af en masterblanding, herunder primere, der er konstrueret til at forstærke interesseområdet og 5 μL af proteinase K-Digest. Brug genomisk DNA isoleret fra cellen linje, der var gen redigeret som en kontrol.
- Evaluer størrelsesændringer af PCR-produkter efter 1 t elektroforese ved 70-90 V på en 2,5% (w/V) agrose gel (figur 3B, C). Enhver størrelsesforskel er tegn på kavalergang.
7. præcis genomredigering i pluripotente stamceller ved hjælp af enkelt streng oligo-DNA (ssODNs)
- Design 100 BP ssODNs centreret omkring den mest effektive gRNA sekvens fast besluttet på at have den bedste skære effektivitet.
- Undgå genspaltning af den rekombinerede ODN ved at introducere tavse mutationer i gRNA-sekvensen. En enkelt tavs mutation i PAM-sekvensen er tilstrækkelig, men hvis det ikke er muligt, vil 3-4 tavse mutationer virke.
Bemærk: for at lette screeningen af målrettede kloner er indførelsen af et Begrænsnings sted inden for ~ 20 BP af gRNA-sekvensen ideel. - Design en ODN med den ønskede base ændring (er) for at skabe mutationen af interesse og en ODN uden basis ændringen (s).
Bemærk: disse ændringer bør ikke være mere end ~ 20 BP fra den forudsagte CRISPR/CAS9 cut site, som rekombination dråber ud betydeligt på større afstande. - Bestil de to ssODNs fra leverandør af valg og resuspension i vand for at gøre 1 μg/μL bestande. Opbevar lagrene ved-20 °C.
8. opsætning af transfection
- For at transficere den ssodn og crispr-CAS9 Plasmids, plade målcellen linje i en 6-brønd skål på bestrålede mefs at nå 70-80% konfluency efter en O/N inkubation.
- Indstil transftionsreaktionen som beskrevet i tabel 6. Bland reaktionen ved pipettering og Inkubér i 15 minutter ved rt. Tilsæt den dråbevis-blanding af transfektering-reaktionsblandingen til cellerne.
- Efter 48 h, Forbered cellerne til celle sortering som beskrevet i afsnit 5,3.
- Pick kolonier ~ 10 dage efter plating enkeltceller ved hjælp af en 200 μL pipette. 100 μL af cellerne overføres til en brønd af en 24 eller 48 brønd plade, der tidligere er belagt med gelatine og bestrålede Mef'er i hESC-medium med Y-27632-dihydrochlorid. Brug de resterende 100 μL til DNA-isolering som beskrevet i punkt 6.
9. kontrol af mutationer i enkelt kolonier
- For at kontrollere for vellykket integration af ssodn, tage 5 μl DNA isoleret fra hver koloni til at udføre PCR ved hjælp af screening primere designet i punkt 2. Rense PCR produkter (tabel over materialer) og forberede begrænsningen enzym fordøjelsen ved hjælp af den unikke enzym site oprettet i ssodn.
Bemærk: denne nedbrydning omfatter også restriktionsenzym bufferen og producentens anbefalede koncentration af restriktions enzymet i et volumen på 40 μL. - Bland reaktionen ved pipettering og Inkuber ved producentens anbefalede temperatur til 1-3 h.
- Visualiser de Ford øjede PCR-produkter på en 1,5% (w/v) EtBr agopstået gel elektrophoresed ved 80-100 V for 40 min. Hvis der er sket en vellykket integration af ssODN, sekvens specifikke mutationer ved hjælp af en indlejret primer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation af gRNAs og screening for indels
Hver gRNA vil blive klonet ind i en plasmid vektor og udtrykkes ved hjælp af U6 promotoren. AflII -begrænsnings enzymet bruges til at linearisere plasmid (addgene #41824) og er placeret efter U6-arrangøren. 100 BP-båndet genereret efter Udglødning af 2 60 BP oligonukleotider er klonet ind i grna Expression vektor ved hjælp af DNA-samlingen. Når grna plasmider genereres, de er transficeret i hESCs eller ipscs sammen med en crisps-CAS9 gfp plasmid (addgene #44719). Gfp +-cellerne sorteres efter 2 dage for at berige for transficeret celler og forgyldt (Se afsnit 5). Efter 10-14 dage plukkes enkelt cellet kolonier og bruges til at isolere DNA til skærmen for Indel dannelse genereret for hver gRNA. En PCR-forstærkning med primere, der spænder over gRNA-stedet, bruges til at visualisere Indel-dannelse ved hjælp af en 2,5% (w/v) agopstået gel med EtBr, elektrophoresed ved 70-90 V i 1 time.
Generation af 100 BP ssODN til at introducere specifikke mutationer
To ssodn oligonukleotider er designet rundt om grna med den mest effektive skæring. Hver gRNA er 100 BP og indeholder tavse mutationer, fortrinsvis ved PAM-sekvensen, for at undgå re-skæring (figur 4a). En tavs mutation i PAM-sekvensen kan generere et unikt begrænsnings websted, som hjælper med at screene for vellykket integration i en eller to alleler (figur 4b).
ssODN rekombinering resultater
Ved hjælp af denne protokol vises hyppigheden af målrettede hændelser for seks forskellige gener ved hjælp af de to ssODN-fremgangsmåde i figur 5. Ved at undersøge genommodificering på grna-stedet i begge alleler blev der forventet forskellige udfald, herunder rekombination af dværg (WT) ssodn, den mutante ssodn og Indel-dannelse. De kloner, hvor kun en allel havde gennemgået en rekombination, det mest almindelige resultat var Indel dannelse i den anden allel (10-42%). De kloner, der havde integrationen af ssODNs i begge alleler førte til tre forskellige resultater: 1) integration af WT ssODN i både alleler (0-8%), 2) integration af mutant ssODN i både alleler (0-25%), og 3) integration af både WT og mutant ssODN WT (8-21%).
Figur 1: oversigt over gRNA generation. (A) i den region af interesse, design fire grnas slutter i gg, der ikke er mere end 20 BP fra hinanden. (B) hver grna på 23 BP har en Pam sekvens af NGG ved 3 ' ende. C) 60 BP-primere består af en 40 BP-sekvens, der supplerer grna backbone plasmid og 20 BP grna-SEKVENSEN uden Pam-sekvensen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: protokol tidslinje for gRNA generation og klon screening. Tidslinjen for gRNA generation og screening kloner vises. Designe og kloning grna Expression plasmider tager cirka en uge. Ca. 48 timer efter transfektering i humane kvikskranker er gfp +-celler sorteret og belagt til begrænsning af fortynding. Kolonier skal være synlige mellem 7-10 dage og på ca. dag 20, kloner kan plukkes til screening, ekspansion og sekvensbekræftelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: gRNA-test til skære effektivitet. A) forgrna Construction er et 100 BP-bånd fjernet fra en 1,5% agopstået gel. (B) efter celle transfection, validering af grna skæring visualiseret ved hjælp af en 2,5% agopstået gel. Et 180 BP PCR-produkt bruges til at kontrollere Indel dannelse, hvor en ubeskåret kontrol og forskellige kloner analyseres for bånd Skift, der indikerer Indel dannelse. (C) forskellige grnas kan have forskellige skære effektivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: generering og screening af mutationer ved hjælp af to ssODNs. (A) for at undgå CRISPR-CAS9 re-skæring af de redigerede alleler, kan Pam sekvens ændres ved hjælp af en G til en tavs mutation. Denne ændring tilføjer et unikt EcoRI-begrænsnings websted, der kan bruges til screening. Ud over denne tavse mutation indeholder mutant ssODN den ønskede base ændring. B) screening for oligonukleotidrekombination ved hjælp af EcoRI-begrænsnings enzym fordøjelsen kan resultere i tre mulige udfald: ingen skæring repræsenteret ved et WT-bånd ved ~ 650 BP, rekombination i en allel repræsenteret ved et ubeskåret bånd på 650 BP og to mindre bånd eller indsættelse i begge alleler repræsenteret af kun mindre bands. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: effektiv integration af ssODN og resultater. Integrations effektivitet og resultater af de to ssODN tilgang blev bestemt ved at analysere seks forskellige gener. Hvis kun en ssODN integreret, Indel dannelse blev normalt detekteret i den anden allel. Hvis to ssODNs integreret, tre mulige udfald blev opdaget, som vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Volumen (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 0,4 |
| Taq polymerase | 0,2 |
| PCR-buffer | 4,0 |
| Annealed oligonukleotider (10 μM) | 10,0 |
| ddH2O | 5,4 |
Tabel 1: gRNA kloning PCR betingelser.
| PCR-program | |
| Trin 1 | 98 °C i 30 s |
| Trin 2 | 98 °C i 10 s |
| Trin 3 | 55 °C i 20 s |
| Trin 4 | 72 °C i 30 s |
| Trin 5 | Gentag trin 2 − 4 for 30 cyklusser |
| Trin 6 | 72 °C i 5 min |
| Trin 7 | Hold ved 4 °C |
Tabel 2: parametre for PCR-cykling.
| Reagens | Volumen (μL) |
| lineariseret gRNA-vektor, som anvender AflII (dvs. 50 ng/μL) | 1,0 |
| 100 BP DNA (dvs., 250 ng/μL) | 1,0 |
| Master Mix 2x | 10,0 |
| ddH2O | q.s. til 20 |
Tabel 3: gRNA-monterings reaktionsbetingelser.
| Reagens | Beløb |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| pCas9_GFP Vector (addgene plasmid 44719) | 0,5 μg |
| gRNA plasmid | 0,5 μg |
| lipid transfektering reagens | 3,0 μL |
Tabel 4: celle transfektering masterblanding.
| hESC medium | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| DMEM/F12 | |
| Udskærings serum udskiftning (KDR) | 15% (v/v) |
| Ikke-essentielle aminosyrer | 100 μM |
| Natriumpyruvat | 1 mM |
| Glutamin | 2 mM |
| β-mercaptoethanol | 0,1 mM |
| bFGF Human (grundlæggende fibroblast vækstfaktor) | 10 ng/mL |
| 10x proteinase K buffer | |
| Tris. HCl pH: 7.4 | 50 mM |
| Ammonium sulfat pH: 9,3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| Tween 20 | 0,1% (v/v) |
| Proteinase K | 100 μg/mL |
Tabel 5: cellekulturmedium og proteinase K fordøjelses buffer.
| Reagens | Beløb |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| pCas9_GFP Vector (addgene plasmid 44719) | 0,5 μg |
| gRNA plasmid | 0,5 μg |
| ssODN (0,5 μg af hver ssODN) | 1,0 μg |
| lipid transfektering reagens | 3,0 μL |
Tabel 6: ssodn Cell transfektering masterblanding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, brugen af CRISPR-CAS9 sammen med to ssODN reparation skabeloner til at generere specifikke heterozygot eller homozygot genom ændringer er påvist i humane pluripotente stamceller. Denne metode resulterede i en vellykket generation af isogene cellelinjer, som udtrykker heterozygot genomiske forandringer med en virkningsgrad tæt på 10%. Denne protokol er blevet optimeret til både humane Esc'er og iPSCs dyrket på bestrålede Mef'er, som understøtter cellevækst og overlevelse efter dyrkning af celler ved lav densitet efter celle sortering. Celledød kan minimeres ved at vedligeholde celler med 10 ng/mL bFGF og Y-27632 dihydrochlorid. Det er muligt, at denne protokol kan tilpasses til feeder-frie kultur systemer, men yderligere optimering kan være nødvendig.
Transfektering effektivitet kan være variabel fra cellelinje til cellelinje, men brugen af 3 μg DNA og 3 μl af en lipid transfektering reagens generelt gav de bedste resultater af mellem 0.5-2% transfektering effektivitet. Men hvis transfektering effektivitet er lavere, optimering af mængden af DNA og lipid reagens kan udføres. Andre transfektering reagenser kan også testes af investigator.
Effektiviteten af Indel generation vil variere med forskellige gRNAs og kan påvirkes af genomisk placering. I langt de fleste tilfælde, hvis fire gRNAs er designet, mindst én og mange gange 2 til 3, vil arbejde effektivt. Derudover er optimering af PCR-strategien for at visualisere indels med et rent enkelt bånds DNA-produkt vigtigt, før du tester gRNAs. Til screening af ssODN baseret genomredigering er det bedst at tilføje et Begrænsnings enzym websted, når der introduceres en tavs mutation (er), men hvis det ikke er muligt, kan der også bruges sletning af et Begrænsnings enzym websted. Derudover kræver homologi rettet reparation aktivt cykel celler, så celletætheden af kulturer forud for transfektering er afgørende for at øge hyppigheden af kloner repareret ved hjælp af den introducerede ssodn skabelon.
Nogle af begrænsningerne i denne protokol er relateret til positionen i genomet, der vil blive redigeret. Når kodning regioner er modificeret, ssODN transporterer tavse mutationer forhindre Cas9 fra re-skæring det redigerede websted og de tavse mutationer ikke ændrer protein produktet. Men redigering i lovgivningsmæssige eller ikke-kodning regioner ved hjælp af denne metode bliver vanskeligere som tavse mutationer er ikke muligt. Hvis den base, der skal redigeres, er en del af en PAM-sekvens, kan dette gøres med succes, men kun homozygot ændringer kan genereres effektivt.
Den protokol, der er beskrevet her, er nyttig til at generere eller korrigere heterozygot kodnings mutationer uden tilsætning af utilsigtede indeler i den anden allel. Denne protokol vil lette brugen af menneskelige kvikskranker til at studere en bred vifte af emner fra udviklingsmæssige biologi til modellering af genetiske sygdomme. Brugen af isogene linjer er afgørende for at definere funktioner af en given kodning mutation uden forstyrrende virkninger på grund af forskellige genetiske baggrunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af midler fra National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), nationale institutter for sundhed gennem Grants U01HL099656 (P.G. og D.L.F.) og U01HL134696 (P.G. og D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
