Summary
Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücreleri gen fonksiyonunu incelemek ve hastalığa özgü mutasyonları modellemek için güçlü bir sistem sunar. İkinci alelde CRISPR-CAS9 aracılı indel oluşumu nedeniyle hassas heterozigot genetik modifikasyonların oluşturulması zordur. Burada, her iki şablon da yeniden kesme ve indel oluşumunu önlemek için sessiz mutasyonlar içerirken, yalnızca bir tanesinin istenen sıra değişikliğini ifade ettiği iki onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelinmesine yardımcı olacak bir protokol gösteriyoruz. Bu metodoloji, insan hastalığı ve biyoloji sinaması için isojenik kontrol ve mutant insan kök hücre hatları oluşturmak için DNA'nın gen düzenleme kodlama bölgeleri için en avantajlı yöntemdir. Buna ek olarak, transfeksiyon ve tarama metodolojilerinin optimizasyonu, gen düzenleme deneyinin işçiliğini ve maliyetini azaltmak için gerçekleştirilmiştir. Genel olarak, bu protokol yaygın insan pluripotent kök hücre modeli kullanan birçok genom düzenleme projeleri için geçerlidir.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan hastalığı yenileme kapasiteleri nedeniyle modelleme için değerli araçlar, farklı soy hücre tipleri oluşturmak için yeteneğini korurken1,2 ,3,4. Bu modeller gen fonksiyonunu sorgulama imkanını açar ve spesifik mutasyonların ve fenotiplerin çeşitli hastalıklarla nasıl ilişkili olduğunuanlarlar 5,6. Ancak, belirli bir değişiklik belirli bir fenotip bağlı nasıl anlamak için, eşleştirilmiş bir iyojenik kontrol ve mutant hücre hatları nın kullanımı çizgi değişkenlik7için kontrol etmek önemlidir7 ,8. Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs) ve çinko parmak nükleazları, birincil hücreler de dahil olmak üzere çeşitli genetik modellerde ekleme veya silme (indels) mutasyonları oluşturmak için kullanılmıştır; ama bu nükleazlar kullanmak için hantal olabilir ve pahalı9,10,11,12,13,14. Kümelenmiş düzenli olarak uzaylanmış kısa palindromik tekrarın (CRISPR)-CAS9 nükleazının keşfi, genomun hemen hemen her bölgesinde indel oluşumundaki verimlilik, kullanım kolaylığı ve maliyet15'teki azalma nedeniyle sahada devrim yarattı15 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19. yıl.
CRISPR-CAS9 tabanlı genom düzenleme teknolojisini kullanmanın zorluğu, ikinci alel20'deindel mutasyonu yaratmadan bir aleldeki spesifik mutasyonların oluşturulması veya düzeltilmesi olmuştur. Bu protokolün temel amacı, ikinci alelinin indel oluşumunu azaltmak için iki tek iplikli oligonükleotit (ssODN) onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelmektir. Her iki ssODN'ler, CAS9 nükleazının yeniden kesilmesini önlemek için sessiz mutasyonlar içerecek şekilde tasarlanmıştır, ancak sadece bir tanesi ilgi nin değişimini içerir. Bu yöntem, ikinci alelinin indel oluşumunu indüklemeden belirli bir heterozigot genetik modifikasyon oluşturma nın verimliliğini artırır. Bu protokolü kullanarak, altı bağımsız genomik lokasyonda yapılan gen düzenleme deneyleri, ikinci alelde indel oluşumu olmadan bir alelde istenilen genomik değişimin kesin olarak ortaya çıkarılabilmeyi ve ~%10 genel verimlilikle meydana geldiğini göstermektedir. Açıklanan protokol Maguire ve ark.21uyarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kılavuz RNA'nın (gRNA) tasarımı ve inşası
NOT: Her gRNA, 100 bp çift iplikçikli (ds) oligonükleotid(Şekil 1A-C)oluşturmak için annealed iki 60 baz çifti (bp) oligonükleotid oluşur. gRNA tasarımı, üretimi ve test kesme verimliliği için zaman çizelgesi yaklaşık 2 haftadır(Şekil 2).
- Genom düzenlenecek DNA bölgesini seçin ve formata uygun 3-4 23 bp dizileri tanımlayın, 5'-G(N19)NGG-3'. Bu diziler ilgi alanının 20 bp içinde yer almalıdır.
NOT: Hedefleme duyu veya anti-sense iplikçik üzerinde yapılabilir. - CRISPOR (http://crispor.tefor.net) gibi bir kaynak kullanarak gRNA dizilerini genomik fazlalık ve hedef dışı olasılık açısından değerlendirin.
- Gösterildiği gibi iki 60-mer oligonükleotid içine 20 bp hedef dizisi (protospacer bitişik motif veya PAM hariç) dahil (dizileri 5'e 3' ve kırmızı ve yeşil şekil 1Cgösterildiği gibi ters tamamlar vardır).
- Sipariş iki 60 bp oligonükleotid satıcıdan tercih. Oligonükleotidler alındıktan sonra, ddH2O.'da 100 μM'lik son konsantrasyona kadar her birini yeniden askıya alın.
- Anneal iki oligonükleotid ve DNA polimeraz kullanarak 100 bp dsDNA parçası oluşturmak(Tablo Malzemeler). 5 μL 10 μM ileri oligonükleotid ve 5 μL 10 μM ters oligonükleotidbir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) şerit tüp ve inkübat 95 °C 5 dakika. Oda sıcaklığında 10 dakika için reaksiyon uçıkarın (RT).
- PCR'yi Tablo 1'deaçıklandığı şekilde ayarlayın. Tablo 2'debelirtilen parametreleri kullanarak bir termal çevrimcide PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
- PCR ürünlerini %1,5 (w/v) ethidium bromür (EtBr) agarose jelelektrofore edilip 40 dk. 100 bp bandı(Şekil 3A),led ışık kutusunda görselleştirilmiş, jilet kullanarak jelden arındırın ve jel kullanarak arındırın ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosu).
2. Tarama için PCR astar tasarımı
- Özel ilgi geninin 400-500 bp bölgesini yükseltmek için tasarlanmış ileri ve ters PCR astarları kullanarak düzenlenmiş DNA'nın taramasını gerçekleştirin(Tablo 2). Tarama PCR yaparken temiz bir amplicon onaylamak için herhangi bir kontrol iPSC hattından izole DNA kullanın.
- PCR ürünlerini 80-100 V'de 1 saat elektroforezi takip eden %1,5 (w/v) jel üzerinde görselleştirin.
NOT: Düzenlenmiş klonların dizilişi, tarama astarı setinin onaylanmasından sonra tasarlanmış iç içe bir astar kullanılarak gerçekleştirilir. Örnekler sıralama için ticari bir kaynağa gönderilir.
3. gRNA_klonlama vektör plazmidinin hazırlanması
- Klonlama vektörünü doğrusallaştırmak için 1,5 mL santrifüj tüp alın ve gRNA_klonlama vektörünün 1-5 g g g g g g g g g g g g g gg'sini ilave edin ve 4 μL AflII restriksiyon enzimi tamponu ve 1,5 μL AflII restriksiyon enzimi ekleyin. DDH2O.'nun 24 μL'lik reaksiyonu yukarı ve aşağı borular ile karıştırın. Gece boyunca 37 °C'de (O/N) kuluçkaya yatırın.
- Elektroforse 1 h ve tüketim bantları için 80-100 V bir% agarose jel üzerinde (beklenen bant boyutu ~ 3519 bp).
- Ayıklayın ve adım 1.6 gibi arındırın.
4. gRNA vektörünün montajı
- Reaksiyonlar ayarlayın ve Montaj kiti kullanarak DNA parçaları monte(Tablo Malzemeler) AflII sindirilmiş gRNA klonlama vektör100 bp jel saflaştırılmış eklemek için 1:5 oranları, Tablo 3açıklandığı gibi .
- Reaksiyonu 50 °C'de 15 dk. DDH2O'da 1:3 oranında seyreltin ve üreticinin talimatlarına göre bakteri dönüşümü için 3 μL kullanın (Malzeme Tablosu). Kanamisin LB/agar plakalarında plaka hücreleri.
- GRNA başına 3-5 koloni seçin. Her koloniyi 4 mL LB'de aşılamak ve orbital sallayarak inkübatör de 37 °C'de O/N büyütün.
- Plazmid DNA'sını miniprep plazmid izolasyon kiti kullanarak arındırın ve başarılı klonlama sağlamak için aşağıdaki astarları kullanarak her gRNA'yı sıralayın: İleri: GTACAAAAAAGCAGGCTTAAAGG; Ters: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.
5. Test gRNA kesme verimliliği
- Daha önce açıklandığı gibi, 6 kuyulu bir plaka içinde ışınlanmış murine embriyonik fibroblastlar (MEFs) üzerinde Plaka hESCs21. Hücreler %70-80 birleşime ulaştığında, Tablo 4'teözetlenen transfeksiyon ana karışımını hazırlayın.
- 15 dk. RT'de pipetleme ve kuluçka ile karıştırın.
- 48 saat sonra sıralama için hasat hücreleri.
- 3 dk RT kuluçka ile MEF'leri enzimatik olarak(Malzeme Tablosu)çıkarın.
- Hücreleri 1x hESC orta ile durular (Tablo 5) ve hESC orta + 10 μM Y-27632 dihidroklorür içine kazıyın (Malzeme Tablosu).
- 3 dk için 300 x g pelet hücreleri ve hESC orta 0,5 mL resuspend + 10 μM Y-27632 dihidroklorür.
- 35 μm'lik hücre süzgeci kapağından 5 mL'lik bir tüpe süzün.
- Floresan aktif hücre sıralama (FACS), canlı hücreler üzerinde kapı ve yeşil floresan protein (GFP) pozitif hücreleri sıralamak kullanarak.
- 1:3 bazal membran matrisi(Malzeme Tablosu)ile kaplanmış ve HESC ortamda(Tablo 5)Y-27632 dihidroklorür içeren ışınlanmış MEF'lere doğrudan 10 cm2 tabak içine maksimum 1,5 x 104 sıralanmış hücre aktarın.
- Y-27632 dihidroklorür içermeyen hESC ortamını(Tablo 5)kullanarak günlük orta yıkın ve kolonilerin ~1 mm çapında olduğu 10-15 gün sonra klonları manuel olarak seçin.
- P200 pipet ve mikroskop kullanarak, tek bir klonu dikkatlice kazıyın ve hücreleri pipete çekin.
- Koloni ile birlikte hazırlanan ortamda 96 kuyu plakasında 3-4x'i yavaşça boruhaline vererek hücreleri dağıtın.
- Tarama için PCR şerit tüpleriçine dağıtın ve 5 dk. gRNA başına 20 koloni seçin 10.000 x g santrifüj ile hücreleri pelet.
6. Klon taraması
- Hücre peletlerini 20 μL proteinaz K tamponu(Tablo 5) (55 °C'de 1 saat ve 95 °C'de 10 dakika) ve girdap ta dinleyerek DNA'yı izole edin. 5 dk için 10.000 x g santrifüj ve supernatant toplamak.
- PcR (bölüm 2) taramasını, ilgi bölgesini ve proteinaz K sindiriminin 5°L'sini yükseltmek için tasarlanmış astarlar da dahil olmak üzere ana karışım içeren bir ana karışım kullanarak toplam 20 μL hacimde gerçekleştirin. Kontrol olarak düzenlenmiş olan hücre hattından izole edilmiş genomik DNA kullanın.
- 70-90 V'de 1 saat elektroforezi takip eden PCR ürünlerinin boyut değişikliklerini %2,5 (w/v) agarose jel(Şekil 3B,C)üzerinde değerlendirin. Herhangi bir boyut farkı dekolte göstergesidir.
7. Tek iplikçikli oligo DNA (ssODNs) kullanılarak pluripotent kök hücrelerde hassas genom düzenleme
- Tasarım 100 bp ssODNs en verimli gRNA dizisi etrafında en iyi kesme verimliliğine sahip olduğu belirlenen merkezli.
- GRNA dizisinde sessiz mutasyonlar oluşturarak yeniden birleştirilmiş ODN'nin yeniden bölünmesini önleyin. PAM dizisinde tek bir sessiz mutasyon yeterlidir, ancak mümkün değilse 3-4 sessiz mutasyon işe yarayacaktır.
NOT: Hedeflenen klonların taranmasını kolaylaştırmak için, gRNA dizisinin ~20 bp içinde bir kısıtlama alanının tanıtılması idealdir. - Faiz mutasyonu ve baz değişimi(ler) olmadan bir ODN oluşturmak için istenilen baz değişimi(ler) ile bir ODN tasarlayın.
NOT: Bu değişiklikler, tahmin edilen CRISPR/CAS9 kesme alanından ~20 bp'den fazla olmamalıdır, çünkü rekombinasyon daha uzak mesafelerde önemli ölçüde düşer. - İki ssODN'yi satıcıdan sipariş edin ve 1 μg/μL hisse senedi yapmak için suda yeniden askıya alın. Stokları -20 °C'de saklayın.
8. Transfection kurulumu
- SsODN ve CRISPR-CAS9 plazmidlerini nakletmek için, hedef hücre hattını, O/N kuluçkadan sonra %70-80'lik bir araya gelmek için ışınlanmış MEF'ler üzerinde 6 kuyulu bir tabakta plakalayın.
- Tablo 6'daaçıklandığı gibi transfeksiyon reaksiyonu ayarlayın. REAKSIYONu pipetleme ile karıştırın ve 15 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon reaksiyonu karışımını damla yla hücrelere ekleyin.
- 48 saat sonra, bölüm 5.3'te açıklandığı gibi hücreleri hücre sıralamasıiçin hazırlayın.
- 200 μL pipet kullanarak tek hücreleri kaplamaktan yaklaşık 10 gün sonra kolonileri seçin. 100 μL'lik hücreyi daha önce jelatin ve Radyasyonlu MEF'ler hESC ortamda Y-27632 dihidroklorür ile kaplanmış 24 veya 48 kuyu plakalı bir kuyuya aktarın. Bölüm 6'da açıklandığı gibi DNA izolasyonu için kalan 100 μL'yi kullanın.
9. Tek kolonilerdeki mutasyonların kontrol edilmesi
- ssODN'nin başarılı entegrasyonunu kontrol etmek için, bölüm 2'de tasarlanan tarama astarlarını kullanarak PCR'yi gerçekleştirmek için her koloniden izole edilmiş 5 μL DNA alın. PCR ürünlerini(Malzeme Tablosu)arındırın ve ssODN'de oluşturulan benzersiz enzim bölgesini kullanarak restriksiyon enzim sindirimini hazırlayın.
NOT: Bu sindirim aynı zamanda restriksiyon enzimtamponve 40 μL bir hacimde restriksiyon enzimüreticinin önerilen konsantrasyon içerir. - 1-3 saat boyunca üreticinin tavsiye edilen sıcaklıkta pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonu karıştırın.
- Sindirilmiş PCR ürünlerini %1,5 (w/v) EtBr agarose jel elektroforeli 80-100 V'da 40 dakika boyunca görselleştirin. SSODN'nin başarılı entegrasyonu gerçekleşmişse, iç içe olmuş bir astar kullanarak diziye özgü mutasyonlar meydana geldi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GRNA'ların üretimi ve indels için tarama
Her gRNA bir plazmid vektör içine klonlanmış olacak ve U6 organizatörü kullanılarak ifade edilecektir. AflII restriksiyon enzimi plazmidi doğrusallaştırmak için kullanılır (addgene #41824) ve U6 organizatöründen sonra bulunur. İki 60 bp oligonun karıştırıldıktan sonra oluşturulan 100 bp bandı, DNA montajı kullanılarak gRNA ekspresyon vektörüne klonlanır. GRNA plazmidleri oluşturulduktan sonra CRISPS-CAS9 GFP plazmidi (addgene #44719) ile birlikte hESC'lere veya iPSC'lere dönüştürülür. GFP+ hücreleri transfected hücreler için zenginleştirmek için 2 gün sonra sıralanır ve kaplanır (bölüm 5'e bakınız). 10-14 gün sonra, tek hücreli türetilmiş koloniler seçilir ve her gRNA için oluşturulan indel oluşumunu taramak için DNA'yı izole etmek için kullanılır. GRNA bölgesini kaplayan astarlı PCR amplifikasyonu, EtBr ile %2,5 (w/v) agarose jel kullanarak indel oluşumunu görselleştirmek için kullanılır, 70-90 V'da 1 saat elektrofore edilmiştir.
Belirli mutasyonları tanıtmak için 100 bp ssODN üretimi
İki ssODN oligos en verimli kesim ile gRNA etrafında tasarlanmıştır. Her gRNA 100 bp'dir ve yeniden kesilmesini önlemek için tercihen PAM dizisinde sessiz mutasyonlar içerir(Şekil 4A). PAM dizisindesessiz bir mutasyon benzersiz bir kısıtlama sitesi oluşturabilir, bu da bir veya iki alelin başarılı bir şekilde entegrasyonunun taranmasına yardımcı olur(Şekil 4B).
ssODN rekombinasyon sonuçları
Bu protokol kullanılarak, iki ssODN yaklaşımını kullanarak altı farklı genin hedefleme olaylarının sıklığı Şekil 5'tegösterilmiştir. Her iki alelde de gRNA yerinde genomik modifikasyon inceleninerek wildtype (WT) ssODN, mutant ssODN ve indel oluşumunun rekombinasyonu dahil olmak üzere farklı sonuçlar beklenmektedir. Sadece bir alelin rekombinasyondan geçtiği klonlar, en sık karşılaşılan sonuç ikinci alelde indel oluşumu (%10-42) idi. Her iki alel de ssODNs entegrasyonu vardı klonlar üç farklı sonuçlara yol açtı: 1) wt ssODN entegrasyonu her iki alel (%0-8), 2) mutant ssODN entegrasyonu (0-25%), ve 3) hem WT ve mutant ssODN WT entegrasyonu (%8-21).
Şekil 1: GRNA üretimine genel bakış. (A) İlgi alanında, 20 bp'den fazla olmayan GG ile biten dört gRNA tasarla. (B) 23 bp'nin her gRNA'sının 3' sonunda bir PAM ngg dizisi vardır. (C) 60 bp astar, gRNA omurga plazmidini tamamlayan 40 bp'lik bir dizi ve PAM dizisi olmayan 20 bp gRNA dizisinden oluşur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GRNA üretimi ve klon taraması için protokol zaman çizelgesi. gRNA üretimi ve tarama klonları için zaman çizelgesi gösterilir. GRNA ekspresyonu plazmidlerinin tasarlanması ve klonlanması yaklaşık bir hafta sürer. İnsan PSC'lerine transfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra GFP+ hücreleri seyreltme sınırlayıcı olarak sıralanır ve kaplanır. Koloniler 7-10 gün arasında görünür olmalı ve yaklaşık 20 gün, klonlar tarama, genişleme ve sıra onayı için seçilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: kesme verimliliği için gRNA testi. (A) gRNA yapımında 100 bp'lik bant %1,5 agarose jelden çıkarılır. (B) Hücre transfeksiyonu sonrasında gRNA kesiminin doğrulanması %2,5 agarose jel kullanılarak görselleştirilir. 180 bp PCR ürünü, kesilmemiş bir kontrolün ve farklı klonların bant kaymaları için indel oluşumunu gösteren analiz edildiği indel oluşumunu kontrol etmek için kullanılır. (C) Farklı gRNA'lar farklı kesme verimliliklerine sahip olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İki sODN kullanarak mutasyonların üretimi ve taranması. (A) Crispr-CAS9'un düzenlenmiş alellerin yeniden kesilmesini önlemek için PAM dizisi G'den A'ya sessiz mutasyon kullanılarak değiştirilebilir. Bu değişiklik tarama için kullanılabilecek benzersiz bir EcoRI kısıtlama sitesi ekler. Bu sessiz mutasyona ek olarak, mutant ssODN istenilen baz değişimini içerir. (B) EcoRI restriksiyon enzim sindirimi kullanılarak oligonükleotid rekombinasyonunun taranması üç olası sonuç doğurabilir: ~650 bp'de bir WT bandı tarafından temsil edilmeyen kesim yok, bir alelde rekombinasyon 650 bp ve iki adet kesilmemiş bant ile temsil edilir sadece küçük bantlar tarafından temsil edilen her iki alel içine küçük bantlar veya ekleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ssODN entegrasyon verimliliği ve sonuçları. İki ssODN yaklaşımının entegrasyon etkinliği ve sonuçları altı farklı gen analiz edilerek belirlendi. Eğer sadece bir ssODN entegre edilmişse, indel oluşumu genellikle diğer alele saptandı. İki ssODN entegre edilmişse, gösterildiği gibi üç olası sonuç tespit edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Hacim (3L) |
| dNTPs (10 mM) | 0.4 |
| Takspolimeraz | 0.2 |
| PCR arabelleği | 4.0 |
| Anneli oligolar (10 μM) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
Tablo 1: gRNA klonlama PCR koşulları.
| PCR programı | |
| Adım 1 | 30 s için 98 °C |
| Adım 2 | 10 s için 98 °C |
| Adım 3 | 20 s için 55 °C |
| Adım 4 | 30 s için 72 °C |
| Adım 5 | 30 döngü için adımları 2−4'ün tekrarla |
| Adım 6 | 5 dk için 72 °C |
| Adım 7 | 4 °C'de tutun |
Tablo 2: PCR bisiklet parametreleri.
| Reaktif | Hacim (3L) |
| AflII kullanarak doğrusallaştırılmış gRNA vektörü (yani, 50 ng/μL) | 1.0 |
| 100 bp DNA (yani, 250 ng/μL) | 1.0 |
| Ana karışım 2x | 10.0 |
| ddH2O | s.s. için 20 |
Tablo 3: gRNA montaj reaksiyon koşulları.
| Reaktif | Tutar |
| DMEM/F12 | 50.0 μL |
| pCas9_GFP vektörü (addgene plazmid 44719) | 0,5 g |
| gRNA plazmid | 0,5 g |
| lipid transfeksiyon reaktifi | 3.0 μL |
Tablo 4: Hücre transfeksiyonu ana karışımı.
| hESC orta | |
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| DMEM/F12 | |
| Nakavt serum replasmanı (KDR) | %15 (v/v) |
| Esansiyel olmayan amino asitler | 100 μM |
| Sodyum pirüuvat | 1 mM |
| Glutamine | 2 mM |
| β-mercaptoethanol | 0,1 mM |
| bFGF insan (temel fibroblast büyüme faktörü) | 10 ng/mL |
| 10x Proteinaz K tampon | |
| Tris.HCl pH:7.4 | 50 mM |
| Amonyum sülfat pH: 9.3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| Tween 20 | %0,1 (v/v) |
| Proteinaz K | 100 μg/mL |
Tablo 5: Hücre kültürü orta ve proteinaz K sindirim tampon.
| Reaktif | Tutar |
| DMEM/F12 | 50.0 μL |
| pCas9_GFP vektörü (addgene plazmid 44719) | 0,5 g |
| gRNA plazmid | 0,5 g |
| ssODN (her ssODN 0.5 g g) | 1.0 μg |
| lipid transfeksiyon reaktifi | 3.0 μL |
Tablo 6: ssODN hücre transfeksiyonana karışımı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, CRISPR-CAS9'un iki ssODN onarım şablonu ile birlikte belirli heterozigot veya homozigot genom değişiklikleri oluşturmak için kullanılması insan pluripotent kök hücrelerinde gösterilmiştir. Bu yöntem, heterozigot genomik değişiklikleri %10'a yakın bir verimlilikle ifade eden izojenik hücre hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesiyle sonuçlandı. Bu protokol, hücre ayrıştırma sonrası düşük yoğunlukta hücre kültürlerinden sonra hücre büyümesini ve sağkalımlarını destekleyen ışınlanmış MEF'lerde yetiştirilen insan ESC'leri ve iPSC'leri için optimize edilmiştir. Hücre ölümü 10 ng/mL bFGF ve Y-27632 dihidroklorür içeren hücrelerin bakımı ile en aza indirilebilir. Bu protokolün besleyici ücretsiz kültür sistemlerine uyarlanmış olması mümkündür, ancak daha fazla optimizasyon gerekebilir.
Transfeksiyon verimliliği hücre hattından hücre hattına değişken olabilir, ancak 3 μg DNA ve 3 μL lipid transfeksiyon reaktifinin kullanımı genellikle %0,5-2 transfeksiyon verimliliğinin en iyi sonuçlarını vermiştir. Ancak transfeksiyon verimi düşükse DNA ve lipid reaktifi miktarının optimizasyonu yapılabilir. Diğer transfeksiyon reaktifleri de araştırmacı tarafından test edilebilir.
Indel neslinin etkinliği farklı gRNA'lar ile değişir ve genomik konumdan etkilenebilir. Vakaların büyük çoğunluğunda, dört gRNA tasarlanırsa, en az bir ve çoğu kez 2-3, verimli bir şekilde çalışacaktır. Ayrıca, gRNA'ları test edilmeden önce, temiz tek bantDNA ürünü ile indels görselleştirmek için PCR stratejisinin optimizasyonu önemlidir. Tarama ssODN tabanlı genom düzenleme için, sessiz bir mutasyon (lar) tanıtırken bir restriksiyon enzim sitesi eklemek en iyisidir, ancak mümkün değilse, bir restriksiyon enzim bölgesinin silinmesi de kullanılabilir. Buna ek olarak, homoloji yönelimli onarım aktif olarak hücreleri bisiklete gerektirir, böylece transfeksiyon öncesi kültürlerin hücre yoğunluğu tanıtılan ssODN şablonu kullanılarak onarılan klonların sıklığını artırmak için önemlidir.
Bu protokolün bazı sınırlamaları düzenlenecek genomdaki konumla ilgilidir. Kodlama bölgeleri değiştirildiğinde, sessiz mutasyonlar taşıyan SSODN, Cas9'un düzenlenmiş alanı yeniden kesmesini engeller ve sessiz mutasyonlar protein ürünlerini değiştirmez. Ancak, bu metodolojiyi kullanarak düzenleyici veya kodlamayan bölgelerde düzenleme, sessiz mutasyonlar mümkün olmadığı için daha da zorlaşır. Düzenlenecek taban PAM dizisinin bir parçasıysa, bu başarıyla yapılabilir, ancak yalnızca homozigot değişiklikler verimli bir şekilde oluşturulabilir.
Burada açıklanan protokol, ikinci alelde istenmeyen indeller eklenmeden heterozigot kodlama mutasyonları oluşturmak veya düzeltmek için yararlıdır. Bu protokol, insan PsC'lerinin gelişimbiyolojisinden genetik hastalıkların modelini modellemesine kadar çok çeşitli konuları incelemek için kullanımını kolaylaştıracaktır. İzojenik çizgilerin kullanımı, farklı genetik arka planlar nedeniyle şaşırtıcı etkileri olmadan belirli bir kodlama mutasyonunun işlevlerini tanımlamak için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, U01HL099656 (P.G. ve D.L.F.) ve U01HL134696 (P.G. ve D.L.F.) hibeleri yoluyla Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI), Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden fon la desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
