인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성
Summary
이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.
Abstract
인간의 다능성 줄기 세포는 유전자 기능을 연구하고 질병과 관련된 특정 돌연변이를 모델링하는 강력한 시스템을 제공합니다. 정확한 이형 유전 적 변형의 생성은 CRISPR-CAS9가 두 번째 알레일에서 인델 형성을 매개했기 때문에 도전적입니다. 여기서는 두 템플릿 모두 재절단 및 인델 형성을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하는 반면, 하나의 복구 템플릿만 이 문제를 극복하는 데 도움이 되는 프로토콜을 시연합니다. 이 방법론은 인간 질병 및 생물학을 공부하기 위한 이원성 제어 및 돌연변이 인간 줄기 세포주를 생성하는 DNA의 유전자 편집 코딩 영역에 가장 유리하다. 또한 유전자 편집 실험의 인건비와 비용을 줄이기 위해 형질전환 및 스크리닝 방법론의 최적화가 수행되었습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포 모델을 활용하는 많은 게놈 편집 프로젝트에 널리 적용가능하다.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 다른 혈통의 세포 유형을 생성하는 능력을 유지하면서 재생 능력으로 인해 인간 질병을 모델링하기위한 귀중한도구입니다1,2 ,3,4. 이들 모델은 유전자 기능을 심문할 수 있는 가능성을 열어주며, 특정 돌연변이와 표현형이 다양한질병과어떻게 관련되어 있는지 를 이해한다5,6. 그러나, 특정 변경이 특정 표현형에 어떻게 연결되는지 이해하기 위하여, 쌍이성 등소제 학적 제어 및 돌연변이 세포주의 사용은 라인 대 라인 가변성7,8에대한 제어에 중요하다. 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs) 및 아연 핑거 뉴클레아제는 1차 세포를 포함한 다양한 유전 모델에서 삽입 또는 결실(indels) 돌연변이를 생성하는데 사용되어 왔다; 그러나 이 뉴클레아제는 9,10,11,12,13,14를사용하는 것이 번거로울 수 있습니다. 클러스터된 정기적인 간격짧은 palindromic 반복 (CRISPR)-CAS9 뉴클레아제의 발견은 게놈의 거의 모든 영역에서 인델 형성의 효율성, 사용의 단순성 및 비용 절감으로 인해 분야에 혁명을 일으켰습니다15 , 16세 , 17세 , 18세 , 19.
CRISPR-CAS9 기반 게놈 편집 기술을 사용하는 데 있어 도전과제는 제2 대문자20에서인델 돌연변이를 생성하지 않고 하나의 대문자에서 특정 돌연변이의 생성 또는 보정이었다. 이 프로토콜의 주요 목표는 두 개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ssODN) 수리 템플릿을 사용하여 제2 대문에서 의인 형성을 감소시킴으로써 이러한 과제를 극복하는 것이다. 두 ssODN은 CAS9 뉴클레아제에 의한 재절단을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하도록 설계되었지만, 오직 하나만이 관심의 변경을 포함하고 있다. 이 방법은 제2 대문예에서 인델 형성을 유도하지 않고 특정 이형 유전적 변형을 생성하는 효율을 증가시킨다. 이 프로토콜을 사용하여, 6개의 독립적인 게놈 위치에서의 유전자 편집 실험은 두 번째 알레르에서 인델 형성없이 하나의 대틀에서 원하는 게놈 변화의 정확한 도입을 입증하고 ~ 10%의 전반적인 효율로 발생한다. 기재된 프로토콜은 Maguire 외21에서적응되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, CRISPR-CAS9를 2개의 ssODN 수리 템플릿과 함께 사용하여 특정 이형이능 또는 동형접합체 게놈 변화를 생성하는 것은 인간 다능성 줄기 세포에서 입증된다. 이 방법은 10%에 가까운 효율로 이형게놈 변화를 발현하는 이소제세포주를 성공적으로 생성시켰다. 이 프로토콜은 세포 선별 후 저밀도에서 세포를 배양한 후 세포 성장과 생존을 지원하는 조사된 MEF에서 성장한 인간 ESCs 및 iPSCs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI), 보조금 U01HL099656 (P.G. 및 D.L.F.) 및 U01HL134696 (P.G. 및 D.L.F.)를 통해 건강의 국립 연구소에서 자금지원되었다.
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
