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Summary

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

Abstract

인간의 다능성 줄기 세포는 유전자 기능을 연구하고 질병과 관련된 특정 돌연변이를 모델링하는 강력한 시스템을 제공합니다. 정확한 이형 유전 적 변형의 생성은 CRISPR-CAS9가 두 번째 알레일에서 인델 형성을 매개했기 때문에 도전적입니다. 여기서는 두 템플릿 모두 재절단 및 인델 형성을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하는 반면, 하나의 복구 템플릿만 이 문제를 극복하는 데 도움이 되는 프로토콜을 시연합니다. 이 방법론은 인간 질병 및 생물학을 공부하기 위한 이원성 제어 및 돌연변이 인간 줄기 세포주를 생성하는 DNA의 유전자 편집 코딩 영역에 가장 유리하다. 또한 유전자 편집 실험의 인건비와 비용을 줄이기 위해 형질전환 및 스크리닝 방법론의 최적화가 수행되었습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포 모델을 활용하는 많은 게놈 편집 프로젝트에 널리 적용가능하다.

Introduction

인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 다른 혈통의 세포 유형을 생성하는 능력을 유지하면서 재생 능력으로 인해 인간 질병을 모델링하기위한 귀중한^{도구입니다1,2 ,3},^4. 이들 모델은 유전자 기능을 심문할 수 있는 가능성을 열어주며, 특정 돌연변이와 표현형이 다양한^질병과어떻게 관련되어 있는지 를 이해한다^5,6. 그러나, 특정 변경이 특정 표현형에 어떻게 연결되는지 이해하기 위하여, 쌍이성 등소제 학적 제어 및 돌연변이 세포주의 사용은 라인 대 라인 가변성^7,8에대한 제어에 중요하다. 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs) 및 아연 핑거 뉴클레아제는 1차 세포를 포함한 다양한 유전 모델에서 삽입 또는 결실(indels) 돌연변이를 생성하는데 사용되어 왔다; 그러나 이 뉴클레아제는 9,^{10,11,12,13,14를}사용하는 것이 번거로울 수 있습니다. 클러스터된 정기적인 간격짧은 palindromic 반복 (CRISPR)-CAS9 뉴클레아제의 발견은 게놈의 거의 모든 영역에서 인델 형성의 효율성, 사용의 단순성 및 비용 절감으로 인해 분야에 혁명을 일으켰습니다^{15 , 16세 , 17세 , 18세 , 19}.

CRISPR-CAS9 기반 게놈 편집 기술을 사용하는 데 있어 도전과제는 제2 대문자^20에서인델 돌연변이를 생성하지 않고 하나의 대문자에서 특정 돌연변이의 생성 또는 보정이었다. 이 프로토콜의 주요 목표는 두 개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ssODN) 수리 템플릿을 사용하여 제2 대문에서 의인 형성을 감소시킴으로써 이러한 과제를 극복하는 것이다. 두 ssODN은 CAS9 뉴클레아제에 의한 재절단을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하도록 설계되었지만, 오직 하나만이 관심의 변경을 포함하고 있다. 이 방법은 제2 대문예에서 인델 형성을 유도하지 않고 특정 이형 유전적 변형을 생성하는 효율을 증가시킨다. 이 프로토콜을 사용하여, 6개의 독립적인 게놈 위치에서의 유전자 편집 실험은 두 번째 알레르에서 인델 형성없이 하나의 대틀에서 원하는 게놈 변화의 정확한 도입을 입증하고 ~ 10%의 전반적인 효율로 발생한다. 기재된 프로토콜은 Maguire 외^21에서적응되었습니다.

Protocol

1. 가이드 RNA (gRNA)의 설계 및 건설 참고: 각 gRNA는 100 bp 이중 연선(ds) 올리고뉴클레오티드(그림1A-C)를생성하기 위해 어닐링되는 2개의 60염기쌍(bp) 올리고뉴클레오티드로 구성된다. gRNA 설계, 생성 및 테스트 절단 효율에 대한 타임라인은 약 2주입니다(그림2). 유전체 편집할 관심 있는 DNA 영역을 선택하고 형식에 맞는 3-4 23 bp서열을 식별, 5′-G(N 19)NGG-3′. 이러한 서열은 관심 영역의 20 bp 내에 위치해야 합니다.참고: 타겟팅은 감지 또는 안티센스 가닥에서 수행할 수 있습니다. CRISPOR(http://crispor.tefor.net)와 같은 자원을 사용하여 게놈 중복 성 및 오프 타겟 확률에 대한 gRNA 서열을 평가합니다. 도시된 바와 같이 20bp 표적 서열(프로토스페이서 인접 모티프 또는 PAM 제외)을 2개의 60-mer 올리고뉴클레오티드(서열은 5′ ~ 3’이고 적색 및 녹색은 도 1C에도시된 바와 같이 역보수)에 통합한다. 선택의 공급 업체에서 두 60 bp 올리고 뉴클레오티드를 주문합니다. 올리고뉴클레오티드가 수신되면, ddH2O. 10 μM의 작동 스톡을 만들어 100 μM의 최종 농도로 각각 재중단한다. 두 올리고뉴클레오티드를 어닐레에 DNA 폴리머라제(표자료)를이용하여 100 bp dsDNA 단편을 생성한다. 5 μL의 10 μM 포워드 올리고뉴클레오티드 및 10 μM의 역 올리고뉴클레오티드를 중합효소 연쇄 반응(PCR) 스트립 튜브에 결합하고 95°C에서 5분간 배양합니다. 표 1에설명된 대로 PCR을 설정합니다. 표 2에 설명된 매개 변수를 사용하여 열 주기에서 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 제품을 1.5% (w/v) 에티듐 브로마이드(EtBr) 아가로즈 젤을 80-100V에서 40분 동안 40분 동안 전기화시켰다. 추출 키트(재료 표). 2. 스크리닝을 위한 PCR 프라이머 설계 관심 있는 유전자의 400-500 bp 영역을 증폭하도록 특별히 설계된 전진 및 역방향 PCR 프라이머를 사용하여 편집된 DNA의 스크리닝을 수행한다(표2). 임의의 대조군 iPSC 라인에서 분리된 DNA를 사용하여 스크리닝 PCR을 수행할 때 깨끗한 앰플리콘을 확인한다. 1시간 동안 80-100V에서 전기영동을 한 후 1.5%(w/v) 젤로 PCR 제품을 시각화합니다.참고: 편집된 클론의 시퀀싱은 스크리닝 프라이머 세트의 확인 후 설계된 중첩 프라이머를 사용하여 수행됩니다. 시퀀싱을 위해 시료를 상용 소스로 보냄. 3. gRNA_복제 벡터 플라스미드의 준비 복제 벡터를 선형화하려면 1.5 mL 원심분리기 튜브를 취하고 AflII 제한 효소 완충제의 4 μL과 함께 gRNA_클로닝 벡터의 DNA 1-5 μg를 추가하고 AflII 제한 효소의 1.5 μL을 추가합니다. ddH2O. 24 μL의 반응을 불러오십시오. 밤새 37 °C에서 배양하십시오 (O / N). 전기포어는 80-100 V에서 80-100 V에서 1 시간 및 소비세 대역에 대한 1% 아가로즈 겔에 (예상 밴드 크기는 ~ 3519 bp이다). 1.6단계에서와 같이 추출및 정제한다. 4. gRNA 벡터의 조립 표 3에기재된 바와 같이 AflII 소화gRNA 클로닝 벡터의 1:5 비율로 1:5 비율로 반응을 설정하고 DNA 단편을 조립한다. 50°C에서 15분 동안 배양하여 ddH2O에서 반응을 1:3 희석하고 제조자의 지시에 따라 세균 변환을 위해 3 μL을사용한다(재료 표). 카나마이신 LB/한천 플레이트의 플레이트 셀. gRNA당 3-5개의 콜로니를 선택합니다. 각 콜로니를 LB 4 mL로 접종하고 궤도 흔들림 인큐베이터에서 37°C에서 O/N을 성장시다. 미니프렙 플라스미드 절연 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정화하고, 성공적인 복제를 보장하기 위해 다음 프라이머를 사용하여 각 gRNA를 서열화한다: 앞으로: GTACAAAAAAAAAAAAAAAGCAGGTTAAGGAAGGAAGG; 역: TGCCAACTTTGTACAAAGCT. 5. 테스트 gRNA 절단 효율 앞서 설명한바와같이 6웰 플레이트에서 조사된 뮤린 배아 섬유아세포(MEFs)에 대한 플레이트 hESCs. 세포가 70-80% 동률에 도달하면 표 4에설명된 형질감염 마스터 믹스를 준비합니다. 파이펫팅하고 RT에서 15 분 동안 배양하여 혼합하십시오. 세포에 드롭 와이즈를 추가하고 37 °C에서 48 시간 동안 배양하십시오 (24 시간 후 미디어 변경). 48 시간 후에 분류하기위한 수확 세포. 3분 RT 인큐베이션으로 MEF를 효소적으로 제거합니다(재료표). hESC배지로세포를 1x 헹구고 hESC 배지 + 10 μM Y-27632 다수소염화물(재료 표)로긁어냅니다. 펠릿 세포는 300 x g에서 3 분 동안 hESC 배지 + 10 μM Y-27632 디하이드로 클로라이드의 0.5 mL에서 재중단. 35 μm 셀 스트레이너 캡을 통해 5 mL 튜브로 필터링합니다. 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 사용하여, 살아있는 세포에 대한 게이트및 녹색 형광 단백질(GFP) 양성 세포를 정렬한다. 최대 1.5 x 104 개의 분류 된 세포를 1:3 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표)로코팅 한 10cm2 접시에 직접 옮기고 Y-27632 디하이드로 염화물을 함유 한 hESC 배지(표 5)에조사 된 MEF를 조사합니다. Y-27632 디하이드로클로라이드없이 hESC 배지(표 5)를사용하여 매일 배지를 변경하고 콜로니가 직경이 ~ 1mm인 경우 10-15 일 후에 수동으로 클론을 선택합니다. P200 파이펫과 현미경을 사용하여 조심스럽게 단일 클론을 긁어 내고 피펫에 세포를 그립니다. 콜로니와 함께 그려진 배지에서 96 웰 플레이트에서 3-4x를 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분산시. 5 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 스크리닝하고 펠릿을 위해 PCR 스트립 튜브에 분배하십시오. 6. 복제 스크리닝 단백질화 K 완충액의 20 μL에서 세포 펠릿을 배양하여 DNA를 분리(표 55°C에서 1 시간 및 95 °C에서 10 분) 및 와류를 힘차게. 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 수집하고 상류를 수집합니다. 단백질분해제 K 다이제스트의 관심 영역 및 5 μL을 증폭하도록 설계된 프라이머를 포함하는 마스터 믹스를 사용하여 총 부피 20 μL에서 스크리닝 PCR(섹션 2)을 수행한다. 유전자가 대조군으로서 편집된 세포주로부터 분리된 게놈 DNA를 사용한다. 2.5% (w/v) 아가로즈 겔(그림 3B,C)에70-90 V에서 1 시간 전기 영동 다음 PCR 제품의 크기 변화를 평가합니다. 크기 차이는 분열을 나타냅니다. 7. 단일 가닥 올리고 DNA (ssODN)를 사용하여 다능성 줄기 세포에서 정확한 게놈 편집 설계 100 bp ssODN은 최고의 절단 효율을 가지는 것으로 결정된 가장 효율적인 gRNA 서열을 중심으로 합니다. gRNA 서열에 침묵하는 돌연변이를 도입하여 재결합된 ODN의 재절단을 방지한다. PAM 서열에서 단일 무음 돌연변이는 충분하지만 가능하지 않은 경우 3-4 개의 자동 돌연변이가 작동합니다.참고: 표적 클론의 스크리닝을 용이하게 하기 위해, gRNA 서열의 ~20 bp 이내의 제한 부위의 도입이 이상적이다. 원하는 염기 변경으로 하나의 ODN을 설계하여 베이스 변경 없이 관심 있는 돌연변이와 하나의 ODN을 생성합니다.참고: 이러한 변경 사항은 더 먼 거리에서 재조합이 상당히 떨어지기 때문에 예측된 CRISPR/CAS9 절단 사이트에서 ~20bp 를 넘지 않아야 합니다. 2개의 ssODN을 선택한 공급업체에서 주문하고 물에 다시 일시 중단하여 1 μg/μL 스톡을 만듭니다. -20 °C에서 주식을 저장합니다. 8. 형질 감염 설정 ssODN 및 CRISPR-CAS9 플라스미드를 트랜스펙트하기 위해, O/N 인큐베이션 후 70-80% 수렴에 도달하기 위해 조사된 MEF에 6웰 접시에 표적 세포줄을 플레이트한다. 표 6에기재된 바와 같이 형질감염 반응을 설정한다. 파이펫팅에 의해 반응을 혼합하고 RT에서 15 분 동안 배양. 형질전환 반응 혼합물을 세포에 드롭 와이즈를 추가합니다. 48시간 후, 섹션 5.3에 기재된 바와 같이 세포 정렬을 위한 세포를 준비한다. 200 μL 파이펫을 사용하여 단일 세포를 도금 한 후 ~ 10 일 동안 식민지를 선택하십시오. 100 μL의 세포를 이전에 젤라틴으로 코팅한 24 또는 48 웰 플레이트 중 하나에 전달하고 Y-27632 디하이드로클로라이드로 hESC 배지에 조사된 MEF를 조사하였다. 섹션 6에 기재된 바와 같이 DNA 격리를 위해 나머지 100 μL을 사용한다. 9. 단일 식민지에서 돌연변이 확인 ssODN의 성공적인 통합을 확인하려면, 섹션 2에서 설계된 스크리닝 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하기 위해 각 콜로니로부터 분리된 DNA의 5 μL을 취하십시오. PCR제품(재료표)을정화하고 ssODN에서 생성된 독특한 효소 부위를 이용하여 제한 효소 소화를 준비한다.참고: 이 소화에는 제한 효소 완충제와 제조업체가 권장하는 제한 효소 농도가 40 μL의 양으로 포함되어 있습니다. 파이펫팅하여 반응을 혼합하고 제조업체의 권장 온도에서 1-3 시간 동안 배양하십시오. 소화된 PCR 제품을 1.5% (vv) EtBr 아가로즈 젤에 80-100V에서 40분 동안 전기로 가다. ssODN의 성공적인 통합이 발생한 경우, 중첩된 프라이머를 사용하여 특정 돌연변이를 시퀀스한다.

Representative Results

인델에 대한 gRNA 생성 및 스크리닝 각 gRNA는 플라스미드 벡터로 복제되고 U6 프로모터를 사용하여 발현될 것이다. AflII 제한 효소는 플라스미드(addgene #41824)를 선형화하는 데 사용되며 U6 프로모터 의 후에 위치한다. 2개의 60 bp 올리고를 어닐링한 후에 생성된 100 bp 대역은 DNA 조립체를 사용하여 gRNA 발현 벡터내로 복제된다. gRNA 플라스미드가 생성되면, 그들은…

Discussion

이 프로토콜에서, CRISPR-CAS9를 2개의 ssODN 수리 템플릿과 함께 사용하여 특정 이형이능 또는 동형접합체 게놈 변화를 생성하는 것은 인간 다능성 줄기 세포에서 입증된다. 이 방법은 10%에 가까운 효율로 이형게놈 변화를 발현하는 이소제세포주를 성공적으로 생성시켰다. 이 프로토콜은 세포 선별 후 저밀도에서 세포를 배양한 후 세포 성장과 생존을 지원하는 조사된 MEF에서 성장한 인간 ESCs 및 iPSCs …

Materials

5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Corning	352235
6-well polystyrene tissue culture dishes	Corning	353046
AflII restriction endonuclease	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit	Macherey-Nagel	740609
Gibson Assembly Kit	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector	Addgene	44719
PCR strip tubes	USA Scientific	1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells	Takara	636763
SOC medium	New England Biolabs	B9020S
TrypLE Express Enzyme	ThermoFisher	12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)	Tocris	1254