Summary
Denne protokollen gir en metode for å forenkle generering av definerte heterozygot eller homozygote nukleotid endringer ved hjelp av CRISPR-CAS9 i menneskelige Pluripotent stamceller.
Abstract
Humane Pluripotent stamceller tilbyr et kraftig system for å studere gen funksjon og modellspesifikke mutasjoner som er relevante for sykdommen. Generering av presise heterozygot genetiske modifikasjoner er utfordrende på grunn av CRISPR-CAS9 mediert indel formasjon i den andre allel. Her demonstrerer vi en protokoll for å bidra til å overkomme dette problemet ved å bruke to reparasjons maler der bare én uttrykker ønsket sekvens endring, mens begge malene inneholder stille mutasjoner for å forhindre ny skjæring og indel dannelse. Denne metodikken er mest fordelaktig for genredigering koding regioner av DNA for å generere isogenic kontroll og mutant menneskelig stilk cellen linjer for å studere menneskelig sykdom og biologi. I tillegg har optimalisering av transfeksjoner-og screening-metoder blitt utført for å redusere arbeidskraft og kostnader for et gen redigerings eksperiment. Samlet sett er denne protokollen allment aktuelt for mange Genova redigering prosjekter utnytte den menneskelige pluripotent stilk cellen modell.
Introduction
Human embryonale stamceller (hESCs) og indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) er verdifulle verktøy for modellering menneskelig sykdom på grunn av deres kapasitet for fornyelse, og samtidig opprettholde muligheten til å generere celletyper av forskjellige linjene1,2 ,3,4. Disse modellene åpner muligheten for å forhøre genet funksjon, og forstå hvordan spesifikke mutasjoner og fenotyper er knyttet til ulike sykdommer5,6. Men for å forstå hvordan en bestemt endring er knyttet til en bestemt fenotype, er bruken av en sammenkoblet isogenic kontroll og mutant cellelinjer viktig for å kontrollere for linje til linje variasjon7,8. Transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser (TALENs) og sink finger nukleaser har blitt brukt til å generere innsetting eller sletting (indeler) mutasjoner i ulike genetiske modeller, inkludert primær celler; men disse nukleaser kan være tungvint å bruke og dyre9,10,11,12,13,14. Oppdagelsen av gruppert regelmessig oppdelt kort palindromic gjenta (CRISPR)-CAS9 nuklease har revolusjonert feltet på grunn av effektivitet i indel formasjon i nesten hvilken som helst region av Genova, enkelhet i bruk, og reduksjon i kostnader15 , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19i denne.
En utfordring i å bruke CRISPR-CAS9 baserte Genova redigerings teknologi har vært generering eller korrigering av spesifikke mutasjoner i en allel uten å skape en indel mutasjon i den andre allel20. Hovedmålet med denne protokollen er å overvinne denne utfordringen ved å bruke to enkelt-strandet oligonukleotid (ssODN) reparasjon maler for å redusere indel formasjon i den andre allel. Begge ssODNs er designet for å inneholde tause mutasjoner for å hindre re-skjæring av CAS9 nuklease, men bare en inneholder endring av interesse. Denne metoden øker effektiviteten ved å generere en bestemt heterozygot genetisk modifisering uten å indusere indel formasjon i den andre allel. Ved hjelp av denne protokollen, genredigering eksperimenter i seks uavhengige genomisk steder demonstrere presis innføring av ønsket genomisk endring i en allel uten indel formasjon i andre allel og oppstår med en generell virkningsgrad på ~ 10%. Den beskrevne protokollen er tilpasset fra Maguire et al.21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design og bygging av guide RNA (gRNA)
Merk: hver gRNA består av 2 60 base pair (BP) oligonukleotider som er glødet til å generere en 100 BP dobbel strandet (DS) oligonukleotid (figur 1a-C). Tidslinjen for gRNA design, generasjon og testing kutte effektivitet er ca 2 uker (figur 2).
- Velg DNA-regionen av interesse for å være Genova redigert og identifisere 3-4 23 BP sekvenser som passer formatet, 5 '-G (N19) NGG-3 '. Disse sekvensene bør være plassert innenfor 20 BP av regionen av interesse.
Merk: målretting kan utføres på den forstand eller anti-Sense strand. - Evaluer gRNA-sekvensene for genomisk redundans og av-mål sannsynlighet ved hjelp av en ressurs som CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- Innlemme 20 BP målet sekvens (unntatt protospacer tilstøtende motiv eller PAM) i 2 60-mer oligonukleotider som vist (sekvenser er 5 ' til 3 ' og røde og grønne er omvendt utfyller som vist i figur 1C).
- Bestill 2 60 BP oligonukleotider fra leverandør av valg. Når oligonukleotider er mottatt, resuspend hver til en endelig konsentrasjon av 100 μM i ddH2O. Lag et arbeids lager på 10 μM.
- Anneal de to oligonukleotider og Generer en 100 BP dsDNA fragment ved hjelp av DNA-polymerase (tabell av materialer). Kombiner 5 μL av 10 μM fremover oligonukleotid og 5 μL av 10 μM revers oligonukleotid i en polymerase kjedere reaksjon (PCR) stripe rør og ruge ved 95 ° c i 5 min. Avkjøl reaksjonen i 10 minutter ved romtemperatur (RT).
- Sett opp PCR som beskrevet i tabell 1. Utfør PCR-forsterkning i en termisk cycler ved hjelp av parametrene som er skissert i tabell 2.
- Visualiser PCR-produkter på en 1,5% (w/v) etidiumbromid bromide (EtBr) agarose gel electrophoresed på 80-100 V for 40 min. avgiftsdirektoratet den 100 BP band (Figur 3a), visualisere på en LED-lys boks, fra gel ved hjelp av en barberhøvel blad og rense ved hjelp av en gel (tabell med materialer).
2. design av PCR-primere for screening
- Utfør screening av det redigerte DNA ved hjelp av fremover og omvendt PCR-primere som er spesielt utformet for å forsterke en 400-500 BP-region av genet av interesse (tabell 2). Bruk DNA isolert fra en hvilken som helst kontroll iPSC linje for å bekrefte en ren amplicon når du utfører screening PCR.
- Visualiser PCR-produkter på en 1,5% (w/v) gel etter elektroforese ved 80-100 V for 1 time.
Merk: sekvensering av redigerte kloner utføres ved hjelp av en nestet primer som er utformet etter bekreftelse av screening primer sett. Prøver sendes til en kommersiell kilde for sekvensering.
3. utarbeidelse av gRNA_cloning vektor plasmider
- For å linearize kloning, ta et 1,5 mL sentrifugerør og tilsett 1-5 mikrogram DNA i gRNA_cloning-vektoren sammen med 4 μL av en buffer for AFLII-enzymet og 1,5 ΜL av AFLII restriksjons enzym. Bring opp reaksjonen til 24 μL av ddH2O. Bland reaksjonen ved pipettering opp og ned. Ruge ved 37 ° c overnight (O/N).
- Electrophorese på en 1% agarose gel på 80-100 V for 1 t og avgiftsdirektoratet band (forventet bandet størrelse er ~ 3519 BP).
- Pakk ut og rens som i trinn 1,6.
4. montering av gRNA vektor
- Sette opp reaksjoner og sette sammen DNA-fragmenter ved hjelp av monteringssettet (tabell av materialer) på 1:5 prosenter av AFLII fordøyd gRNA kloning vektor til 100 BP gel renset sette inn, som beskrevet i tabell 3.
- Ruge reaksjonen ved 50 ° c i 15 min. fortynne reaksjonen 1:3 i ddH2O og bruk 3 μL for bakteriell transformasjon, i henhold til produsentens instruksjoner (tabell av materialer). Plate celler på kanamycin LB/agar plater.
- Plukk 3-5 kolonier per gRNA. Vaksinere hver koloni i 4 mL LB og vokse O/N ved 37 ° c i en orbital risting inkubator.
- Rens plasmider DNA ved hjelp av et miniprep plasmider isolasjons sett, og sekvenser hver gRNA ved hjelp av følgende primere for å sikre vellykket kloning: Forward: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Omvendt: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.
5. test gRNA kutte effektivitet
- Plate hESCs på bestrålt murine embryonale fibroblaster (MEFs) i en 6-brønn plate, som tidligere beskrevet21. Når cellene når 70-80% confluency, klargjør du den transfeksjoner mal blandingen som er skissert i Tabell 4.
- Bland med pipettering og ruge ved RT i 15 min. Legg dråpevis til cellene og ruge ved 37 ° c for 48 h (med en medie endring etter 24 h).
- Høste celler for sortering etter 48 h.
- Fjern MEFs enzymatisk (tabell av materialer) med en 3 min RT inkubasjons.
- Skyll cellene 1x med hESC medium (tabell 5) og skrap inn hESC medium + 10 μM Y-27632 dihydrochloride (tabell av materialer).
- Pellet celler ved 300 x g i 3 min og resuspend i 0,5 ml hESC medium + 10 μM Y-27632 dihydrochloride.
- Filtrer inn i et 5 mL rør gjennom en 35 μm celle-sil cap.
- Bruke fluorescens aktivert celle sortering (FACS), gate på levende celler og sortere det grønne fluorescerende proteinet (GFP) positive celler.
- Overfør maksimalt 1,5 x 104 sorterte celler direkte inn i en 10 cm2 parabol belagt med 1:3 kjeller membran matrise (tabell av materialer) og bestrålt MEFs i hESC medium (tabell 5) inneholder Y-27632 dihydrochloride.
- Endre middels daglig ved hjelp av hESC medium (tabell 5) uten Y-27632 dihydrochloride og manuelt plukke kloner etter 10-15 dager, når koloniene er ~ 1 mm i diameter.
- Ved hjelp av en P200 pipette og mikroskop, forsiktig skrape en enkelt klone og trekke celler inn i pipette.
- Spre cellene ved forsiktig pipettering 3-4X i en 96 brønn plate i mediet trukket opp med kolonien.
- Dispensere inn PCR-rør for screening og pellets cellene ved sentrifugering ved 10 000 x g i 5 min. plukke 20 kolonier per gRNA.
6. klone screening
- Isoler DNA ved å incubating celle pellets i 20 μL av proteinase K buffer (tabell 5) (1 h ved 55 ° c og 10 min ved 95 ° c) og Vortex kraftig. Sentrifuger på 10 000 x g i 5 min og samle supernatanten.
- Utfør screening PCR (del 2) i et samlet volum på 20 μL ved hjelp av en Master Mix inkludert primere utformet for å forsterke regionen av interesse og 5 μL av proteinase K Digest. Bruk genomisk DNA isolert fra cellelinjen som ble genet redigert som en kontroll.
- Evaluer størrelses endringer av PCR-produkter etter 1 h elektroforese ved 70-90 V på 2,5% (w/V) agarose gel (Figur 3B, C). Enhver størrelse forskjell er tegn på kløft.
7. presis Genova redigering i Pluripotent stamceller ved hjelp av enkelt tråd oligo DNA (ssODNs)
- Design 100 BP ssODNs sentrert rundt den mest effektive gRNA sekvensen bestemt på å ha den beste kutte effektivitet.
- Forhindre ny kløft av saman ODN ved å innføre stille mutasjoner i gRNA sekvensen. En enkelt stille mutasjon i PAM sekvensen er tilstrekkelig, men hvis ikke mulig, 3-4 tause mutasjoner vil fungere.
Merk: for å lette screening av målrettede kloner, innføring av en restriksjon området innen ~ 20 BP av gRNA sekvensen er ideelt. - Design en ODN med ønsket base endring (er) for å opprette en mutasjon av interesse og en ODN uten grunn endringen (e).
Merk: disse endringene bør ikke være mer enn ~ 20 BP fra spådde CRISPR/CAS9 kuttet området, som rekombinasjon faller av betraktelig på større avstander. - Bestill de to ssODNs fra leverandør av valg og resuspend i vann for å lage 1 μg/μL aksjer. Lagre aksjer ved-20 ° c.
8. transfeksjoner oppsett
- For å transfect ssODN og CRISPR-CAS9 plasmider, plate mål cellelinjen i en 6-godt parabolen på bestrålt MEFs å nå 70-80% confluency etter en O/N inkubasjons.
- Sett opp transfeksjoner reaksjonen som beskrevet i tabell 6. Bland reaksjonen ved pipettering og ruge i 15 min ved RT. Tilsett transfeksjoner reaksjonsblandingen dråpevis til cellene.
- Etter 48 h, klargjør cellene for celle sortering som beskrevet i seksjon 5,3.
- Plukk kolonier ~ 10 dager etter plating enkeltceller ved hjelp av en 200 μL pipette. Overføring 100 μL av celler til en brønn av en 24 eller 48 brønn plate tidligere belagt med gelatin og bestrålt MEFs i hESC medium med Y-27632 dihydrochloride. Bruk de resterende 100 μL for DNA-isolasjon som beskrevet i avsnitt 6.
9. kontroll av mutasjoner i enkelt kolonier
- For å se etter vellykket integrering av ssODN, ta 5 μL av DNA isolert fra hver koloni for å utføre PCR ved hjelp av screening primere utformet i del 2. Rense PCR-produkter (tabell av materialer) og forberede restriksjonen enzymet fordøyelsen ved hjelp av det unike enzymet området opprettet i ssODN.
Merk: denne fordøyelsen inkluderer også Begrensnings enzym bufferen og produsentens anbefalte konsentrasjon av Begrensnings enzym i et volum på 40 μL. - Bland reaksjonen ved pipettering og ruge ved produsentens anbefalte temperatur for 1-3 h.
- Visualisere fordøyd PCR produkter på en 1,5% (w/v) EtBr agarose gel electrophoresed på 80-100 V for 40 min. Hvis vellykket integrering av ssODN har oppstått, sekvensen spesifikke mutasjoner ved hjelp av en nestet primer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av gRNAs og screening for indeler
Hver gRNA vil bli klonet i en plasmider vektor og uttrykt ved hjelp av U6 promoter. AFLII restriksjon enzymet brukes til å linearize plasmider (addgene #41824) og er plassert etter U6 arrangøren. Det 100 BP bånd utviklet etter annealing det 2 60 BP oligos er klon inn i gRNA gjengivelsen vektor benytter det DNA samlingen. Når gRNA plasmider er generert, er de transfekterte i hESCs eller iPSCs sammen med en POTETGULL-CAS9 GFP plasmider (addgene #44719). GFP +-cellene sorteres etter 2 dager for å berike transfekterte celler og belagte (se pkt. 5). Etter 10-14 dager, er enkelt celle avledede kolonier plukket og brukt til å isolere DNA til skjerm for indel dannelse generert for hver gRNA. En PCR forsterkning med primere som spenner over gRNA nettstedet brukes til å visualisere indel formasjon ved hjelp av en 2,5% (w/v) agarose gel med EtBr, electrophoresed ved 70-90 V for 1 t.
Generering av 100 BP ssODN å innføre spesifikke mutasjoner
To ssODN oligos er designet rundt gRNA med den mest effektive skjæring. Hver gRNA er 100 BP og inneholder tause mutasjoner, fortrinnsvis på PAM sekvensen, for å unngå re-skjæring (figur 4a). En stille mutasjon i PAM sekvensen kan generere en unik begrensning området, noe som bidrar til skjermen for vellykket integrering i en eller to alleler (figur 4b).
ssODN rekombinasjon utfall
Ved hjelp av denne protokollen, hyppigheten av målretting hendelser for seks forskjellige gener som bruker de to ssODN tilnærmingen er vist i figur 5. Ved å undersøke genomisk modifikasjon på gRNA området i begge alleler, var ulike utfall forventet inkludert rekombinasjon av wildtype (WT) ssODN, mutant ssODN og indel formasjon. De kloner der bare én allel hadde gjennomgått rekombinasjon, det vanligste utfallet var indel formasjon i den andre allel (10-42%). De kloner som hadde integrering av ssODNs i begge alleler, førte til tre forskjellige utfall: 1) integrering av WT ssODN i begge alleler (0-8%), 2) integrering av mutant ssODN i både alleler (0-25%) og 3) integrering av både WT og mutant ssODN WT (8-21%).
Figur 1: oversikt over gRNA-generering. (A) i regionen av interesse, design fire gRNAs ending i GG som ikke er mer enn 20 BP fra hverandre. (B) hver gRNA av 23 BP har en Pam SEKVENS av NGG på 3 ' end. (C) 60 BP primere består av en 40 BP sekvens komplementær til gRNA ryggraden plasmider og 20 BP gRNA SEKVENSEN uten Pam sekvensen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: protokoll tidslinje for gRNA generasjon og klone screening. Tidslinjen for gRNA generasjon og screening kloner vises. Det tar cirka én uke å utforme og klone gRNA Expression plasmider. Ca 48 timer etter transfeksjoner i humant PSCer, GFP + celler er sortert og belagt på å begrense fortynning. Koloniene skal være synlige mellom 7-10 dager og omtrent dag 20, kan kloner bli plukket for screening, ekspansjon, og sekvens bekreftelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: gRNA test for å kutte effektiviteten. (A) for gRNA Construction, en 100 BP bandet er excised fra en 1,5% agarose gel. (B) følgende celle transfeksjoner, validering av gRNA skjæring er visualisere ved hjelp av en 2,5% agarose gel. En 180 BP PCR produkt brukes til å kontrollere for indel formasjon der en Uncut kontroll og ulike kloner er analysert for bandet Skift indikasjon på indel formasjon. (C) forskjellige gRNAs kan ha ulik skjære effektivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: generering og screening av mutasjoner med to ssODNs. (A) for å unngå CRISPR-CAS9 re-skjæring av den redigerte alleler, kan Pam sekvensen endres ved hjelp av en G til en stille mutasjon. Denne endringen legger til en unik EcoRI restriksjon område som kan brukes for screening. I tillegg til denne tause mutasjonen, inneholder mutant ssODN den ønskede grunn endringen. (B) screening for oligonukleotid rekombinasjon bruker EcoRI begrensning enzym fordøyelsen kan resultere i tre mulige utfall: ingen skjæring representert ved en WT band på ~ 650 BP, rekombinasjon i en allel representert ved en Uncut band av 650 BP og to mindre band eller innsetting i begge alleler representert med bare mindre band. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ssODN integrasjons effektivitet og utfall. Integrasjons effektivitet og utfall av de to ssODN-tilnærmingen ble bestemt ved å analysere seks forskjellige gener. Hvis bare én ssODN integrert, indel formasjon ble vanligvis oppdaget i den andre allel. Hvis to ssODNs-er integrert, ble det oppdaget tre mulige utfall, som vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Volum (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 0,4 |
| Taq polymerase | 0,2 |
| PCR-buffer | 4,0 |
| Glødet oligos (10 μM) | 10,0 |
| ddH2O | 5,4 |
Tabell 1: gRNA kloning PCR-forhold.
| PCR-programmet | |
| Trinn 1 | 98 ° c i 30 s |
| Trinn 2 | 98 ° c i 10 s |
| Trinn 3 | 55 ° c i 20 s |
| Trinn 4 | 72 ° c i 30 s |
| Trinn 5 | Gjenta trinn 2 − 4 for 30 sykluser |
| Trinn 6 | 72 ° c i 5 min |
| Trinn 7 | Hold ved 4 ° c |
Tabell 2: PCR sykkel parametre.
| Reagens | Volum (μL) |
| linearized gRNA vektor med AflII (dvs. 50 ng/μL) | 1,0 |
| 100 BP DNA (dvs. 250 ng/μL) | 1,0 |
| Master Mix 2x | 10,0 |
| ddH2O | QS til 20 |
Tabell 3: gRNA for monterings reaksjoner.
| Reagens | Beløpet |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| pCas9_GFP vektor (addgene plasmider 44719) | 0,5 μg |
| gRNA plasmider | 0,5 μg |
| lipid transfeksjoner reagens | 3,0 μL |
Tabell 4: Cell transfeksjoner Master blanding.
| hESC medium | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| DMEM/F12 | |
| Skifte av knockout-serum (KDR) | 15% (v/v) |
| Unødvendige aminosyrer | 100 μM |
| Natrium pyruvat | 1 mM med |
| Glutamin | 2 mM med |
| β-mercaptoethanol | 0,1 mM |
| bFGF menneskelige (grunnleggende Fibroblast vekstfaktor) | 10 ng/mL |
| 10x proteinase K buffer | |
| Tris. HCl pH: 7.4 | 50 mM |
| Ammonium sulfat pH: 9,3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| Mellom 20 | 0,1% (v/v) |
| Proteinase K | 100 μg/mL |
Tabell 5: cellekultur medium og proteinase K fordøyelsen buffer.
| Reagens | Beløpet |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| pCas9_GFP vektor (addgene plasmider 44719) | 0,5 μg |
| gRNA plasmider | 0,5 μg |
| ssODN (0,5 mikrogram av hver ssODN) | 1,0 μg |
| lipid transfeksjoner reagens | 3,0 μL |
Tabell 6: ssODN celle transfeksjoner Master blanding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, bruk av CRISPR-CAS9 sammen med to ssODN reparasjon maler for å generere spesifikke heterozygot eller homozygote Genova endringer er demonstrert i humant Pluripotent stamceller. Denne metoden resulterte i en vellykket generasjon av isogenic cellelinjer uttrykker heterozygot genomisk endringer med en virkningsgrad nær 10%. Denne protokollen er optimalisert for både menneskelige ESCs og iPSCs vokst på bestrålt MEFs som støtter cellevekst og overlevelse etter dyrking celler ved lav tetthet etter celle sortering. Celle død kan minimeres ved å opprettholde celler med 10 ng/mL bFGF og Y-27632 dihydrochloride. Det er mulig at denne protokollen kan tilpasses til mater frie kultur systemer, men ytterligere optimalisering kan være nødvendig.
Transfeksjoner effektivitet kan være variabel fra cellelinje til cellelinje, men bruken av 3 μg av DNA og 3 μL av en lipid transfeksjoner reagens generelt ga de beste resultatene fra mellom 0,5-2% transfeksjoner effektivitet. Men hvis transfeksjoner effektivitet er lavere, kan optimalisering av mengden av DNA og lipid reagens utføres. Andre transfeksjoner reagenser kan også testes av undersøkeren.
Effektiviteten av indel generasjon vil variere med ulike gRNAs og kan bli påvirket av genomisk plassering. Innenfor de aller fleste tilfeller, hvis fire gRNAs er utformet, minst én og mange ganger 2 til 3, vil arbeide effektivt. I tillegg, før testing av gRNAs, er optimalisering av PCR-strategien for å visualisere indeler med et rent enkelt bånds DNA-produkt viktig. For screening ssODN baserte Genova redigering, er det best å legge til en restriksjon enzym området når innføre en stille mutasjon (s), men hvis ikke er mulig, sletting av en restriksjon enzym området kan brukes også. I tillegg homologi rettet reparasjon krever aktivt sykling celler slik at celle tettheten av kulturer før transfeksjoner er avgjørende for å øke hyppigheten av kloner reparert ved hjelp av innført ssODN mal.
Noen av begrensningene i denne protokollen er knyttet til plasseringen i Genova som skal redigeres. Når koding regioner er endret, ssODN bærer tause mutasjoner hindre Cas9 fra å kutte den redigerte området og den tause mutasjoner ikke endre protein produktet. Men redigering i regulatoriske eller ikke-koding regioner som bruker denne metodikken blir vanskeligere som tause mutasjoner er ikke mulig. Hvis basen som skal redigeres, er en del av en PAM-sekvens, kan dette gjøres med hell, men bare homozygote endringer kan genereres effektivt.
Protokollen som er beskrevet her er nyttig for å generere eller korrigere heterozygot koding mutasjoner uten tilsetning av utilsiktede indeler i andre allel. Denne protokollen vil lette bruken av menneskelige PSCer å studere et bredt spekter av emner fra utviklingsmessige biologi til modellering av genetiske sykdommer. Bruk av isogenic linjer er avgjørende for å definere funksjoner av en gitt koding mutasjon uten forvirrende effekter på grunn av ulik genetisk bakgrunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av finansiering fra National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health gjennom tilskudd U01HL099656 (P.G. and D.L.F.) og U01HL134696 (P.G. and D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
