توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة لتسهيل توليد تغييرات النيوكليوتيدات المتجانسة أو المتجانسة المحددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى.
Abstract
توفر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى نظامًا قويًا لدراسة وظيفة الجينات ونمذجة الطفرات المحددة ذات الصلة بالمرض. إن توليد تعديلات جينية دقيقة غير متجانسة يشكل تحدياً بسبب تشكيل الإندل بوساطة كريسبر-كاس9 في الأليل الثاني. هنا، نقوم بإظهار بروتوكول للمساعدة في التغلب على هذه الصعوبة باستخدام اثنين من قوالب الإصلاح التي واحدة فقط يعبر عن تغيير التسلسل المطلوب، في حين أن كلا النموذجين تحتوي على طفرات صامتة لمنع إعادة قطع وتشكيل indel. هذه المنهجية هي الأكثر فائدة لتحرير الجينات مناطق الترميز من الحمض النووي لتوليد السيطرة المسببة للسرطان ومتحولة خطوط الخلايا الجذعية البشرية لدراسة الأمراض البشرية والبيولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحسين منهجيات التغوط والفحص إلى أقصى حد للحد من العمالة وتكلفة تجربة تحرير الجينات. وبشكل عام، ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع على العديد من مشاريع تحرير الجينوم التي تستخدم نموذج الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي أدوات قيمة لنمذجة الأمراض البشرية بسبب قدرتها على التجديد، مع الحفاظ على القدرة على توليد أنواع الخلايا من سلالات مختلفة1،2 ،3،4. هذه النماذج تفتح إمكانية استجواب وظيفة الجينات، وفهم كيف ترتبط الطفرات المحددة والأنماط الظاهرية بأمراض مختلفة5،6. ومع ذلك، لفهم كيفية ربط تغيير معين إلى النمط الظاهري معين، واستخدام التحكم isogenic المقترنة وخطوط الخلايا متحولة من المهم للسيطرة على خط لتقلب خط7،8. وقد استخدمت النوكلورات الشبيهة بالمنشطات والزنك لتوليد طفرات الإدراج أو الحذف (indels) في نماذج وراثية متنوعة، بما في ذلك الخلايا الأولية؛ ولكن هذه nucleases يمكن أن تكون مرهقة للاستخدام ومكلفة9،10،11،12،13،14. وقد أحدث اكتشاف تكرار قصير متباعد (CRISPR)-CAS9 nuclease متفاوتة في الميدان بسبب الكفاءة في تكوين الإندل في أي منطقة من الجينوم تقريبا، وبساطة الاستخدام، وخفض التكلفة15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19.
وكان التحدي في استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم القائم على CRISPR-CAS9 توليد أو تصحيح طفرات محددة في أليل واحد دون خلق طفرة indel في الأليل الثاني20. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو التغلب على هذا التحدي باستخدام اثنين من قوالب إصلاح oligonucleotide واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssODN) للحد من تشكيل الإندل في الأليل الثاني. تم تصميم كل من ssODNs لاحتواء الطفرات الصامتة لمنع إعادة قطع من قبل NUcLEASE CAS9، ولكن واحد فقط يحتوي على تغيير الفائدة. هذا الأسلوب يزيد من كفاءة توليد تعديل وراثي غير متجانسة دون تحفيز تشكيل indel في الأليل الثاني. باستخدام هذا البروتوكول، تظهر تجارب تحرير الجينات في ستة مواقع جينية مستقلة الإدخال الدقيق للتغيير الجيني المطلوب في الأليل واحد دون تشكيل الإندل في الأليل الثاني ويحدث مع كفاءة عامة من ~ 10٪. وقد تم تكييف البروتوكول الموصوف من ماغواير وآخرون21.
Protocol
1. تصميم وبناء دليل RNA (gRNA)
ملاحظة: يتكون كل gRNA من اثنين من 60 زوج قاعدة (BP) oligonucleotides التي يتم صلب لتوليد 100 نقطة أساس مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DS) oligonucleotide(الشكل 1A-C). الجدول الزمني لتصميم gRNA، وتوليد، واختبار كفاءة القطع هو ما يقرب من 2 أسابيع(الشكل 2).
- حدد منطقة الحمض النووي ذات الأهمية ليتم تحريرها الجينوم وتحديد 3-4 23 تسلسلbp التي تناسب الشكل، 5′-G(N 19)NGG-3′. وينبغي أن تكون هذه التسلسلات في حدود 20 نقطة أساس من المنطقة موضع الاهتمام.
ملاحظة: يمكن تنفيذ الاستهداف على المعنى أو حبلا المضادة للإحساس. - تقييم تسلسلات gRNA للتكرار الجيني والاحتمال خارج الهدف باستخدام مورد مثل CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- دمج التسلسل المستهدف 20 نقطة أساس (باستثناء عزر protospacer المجاورة أو PAM) في اثنين من 60-mer oligonucleotides كما هو مبين (تسلسل هي 5 ‘ إلى 3 ‘ والأحمر والأخضر هي تكمل ة عكسية كما هو مبين في الشكل 1C).
- طلب اثنين 60 نقطة أساس oligonucleotides من البائع من الاختيار. بمجرد تلقي oligonucleotides، إعادة تعليق كل إلى تركيز نهائي من 100 درجة مئوية في ddH2O. جعل مخزون العمل من 10 ميكرومتر.
- الأنيال اثنين oligonucleotides وتوليد 100 نقطة في الثانية dsDNA جزء باستخدام بوليميراز الحمض النووي(جدول المواد). الجمع بين 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر إلى الأمام oligonucleotide و 5 ميكرولتر من 10 μM عكس oligonucleotide في بوليميراز سلسلة رد فعل (PCR) شريط أنبوب وحضانة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إعداد PCR كما هو موضح في الجدول 1. إجراء تضخيم PCR في دورة حرارية باستخدام المعلمات المبينة في الجدول 2.
- تصور منتجات PCR على 1.5٪ (ث / الخامس) بروميد الإيثيديوم (EtBr) هلام أغاروز الكهربائي في 80-100 V لمدة 40 دقيقة المكوس الفرقة 100 bp(الشكل 3A)،تصور على مربع ضوء LED، من هلام باستخدام شفرة الحلاقة وتنقية باستخدام هلام استخراج عدة(جدول المواد).
2- تصميم المواد التمهيدية الخاصة بـ PCR للفحص
- إجراء فحص الحمض النووي المحرر باستخدام التمهيديات الأمامية والعكسية لـ PCR المصممة خصيصًا لتضخيم منطقة 400-500 bp من الجين موضع الاهتمام(الجدول 2). استخدم الحمض النووي المعزول عن أي خط تحكم iPSC لتأكيد وجود أمبليكون نظيف عند إجراء فحص PCR.
- تصور منتجات PCR على هلام 1.5٪ (ث / الخامس) بعد الكهربائي في 80-100 V لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: يتم تنفيذ تسلسل النسخ المحرر باستخدام التمهيدي المتداخلة التي تم تصميمها بعد تأكيد مجموعة التمهيدي الفرز. يتم إرسال العينات إلى مصدر تجاري للتسلسل.
3. إعداد gRNA_استنساخ ناقلات بلازميد
- لخطي متجه الاستنساخ، واتخاذ أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل وإضافة 1-5 ميكروغرام من الحمض النووي للمتجه gRNA_cloning جنبا إلى جنب مع 4 ميكرولتر من العازلة إنزيم تقييد AflII و 1.5 ميكرولتر من إنزيم تقييد AflII. إحضار رد الفعل إلى 24 درجة مئوية من ddH2O. مزيج رد الفعل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. حضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (O / N).
- الكهربائي على هلام أغاروز 1٪ في 80-100 V لمدة ساعة 1 والعصابات المكوس (حجم الفرقة المتوقع هو ~ 3519 نقطة في اليوم).
- استخراج وتنقية كما هو الحال في الخطوة 1.6.
4. الجمعية من ناقلات gRNA
- إعداد ردود الفعل وتجميع شظايا الحمض النووي باستخدام مجموعة التجميع(جدول المواد)في 1:5 نسب AflII هضم gRNA استنساخ ناقلات إلى 100 نقطة أساس هلام تنقية إدراج، كما هو موضح في الجدول 3.
- احتضان رد الفعل عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. خلايا لوحة على لوحات كانامايسين LB / أجار.
- اختيار 3-5 مستعمرات لكل gRNA. تلقيح كل مستعمرة في 4 مل من رطل وتنمو O / N في 37 درجة مئوية في حاضنة الهز المداري.
- تنقية الحمض النووي بلازميد باستخدام مجموعة عزل بلازميد miniprep، وتسلسل كل gRNA باستخدام التمهيديات التالية لضمان الاستنساخ الناجح: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG. عكس: TGCCAACTTTGTACAAAGAGCT.
5. اختبار gRNA كفاءة القطع
- لوحة hESCs على الخلايا الليفية الجنينية المُشَعَدّة (MEFs) في لوحة ذات 6 آبار، كما سبق وصفهابـ 21. عندما تصل الخلايا إلى 70-80٪ من الوفرة، قم بإعداد المزيج الرئيسي للتغوط في التغوطالموضح في الجدول 4 .
- مزيج عن طريق الأنابيب والحضانة في RT لمدة 15 دقيقة.
- خلايا الحصاد للفرز بعد 48 ساعة.
- إزالة MEFs الأنزيمية(جدول المواد)مع حضانة RT 3 دقائق.
- شطف الخلايا 1X مع hESC المتوسطة(الجدول 5)وكشط في hESC المتوسطة + 10 درجة مئوية Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد(جدول المواد).
- خلايا بيليه في 300 × ز لمدة 3 دقائق وإعادة تعليق في 0.5 مل من hESC المتوسطة + 10 درجة مئوية Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد.
- قم بالتصفية في أنبوب بـ 5 مل من خلال غطاء مصفاة الخلايا بـ 35 ميكرومتر.
- باستخدام الفلورة تنشيط فرز الخلايا (FACS)، بوابة على الخلايا الحية وفرز البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الخلايا الإيجابية.
- نقل ما لا يزيد عن 1.5 × 104 خلايا مرتبة مباشرة إلى طبق 10 سم2 المغلفة مع 1:3 مصفوفة غشاء الطابق السفلي(جدول المواد)وMEFs المشعة في hESC المتوسطة(الجدول 5)التي تحتوي على Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد.
- تغيير المتوسطة يوميا باستخدام المتوسطة hESC(الجدول 5)دون Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد واختيار يدويا استنساخ بعد 10-15 يوما، عندما تكون المستعمرات ~ 1 ملم في القطر.
- باستخدام ماصة P200 والمجهر، كشط بعناية استنساخ واحد ورسم الخلايا في ماصة.
- تفريق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف 3-4X في لوحة بئر 96 في المتوسط وضعت مع المستعمرة.
- الاستغناء عن أنابيب قطاع PCR لفحص وبيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق.
6. استنساخ الفرز
- عزل الحمض النووي عن طريق احتضان الكريات الخلية في 20 ميكرولتر من بروتيناس K العازلة(الجدول 5)(1 ساعة في 55 درجة مئوية و 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية) ودوامة بقوة. الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق وجمع supernatant.
- إجراء فحص PCR (القسم 2) في حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر باستخدام مزيج رئيسي بما في ذلك التمهيديات المصممة لتضخيم المنطقة ذات الاهتمام و 5 ميكرولتر من خلاصة proteinase K. استخدام الحمض النووي الجينومي المعزول من خط الخلية الذي تم تحرير الجينات كعنصر تحكم.
- تقييم التغيرات في حجم منتجات PCR بعد 1 ساعة الكهربائي في 70-90 V على هلام أغاروز 2.5٪ (ث / الخامس)(الشكل 3B، C). أي فرق في الحجم يدل على الانقسام.
7- تحرير الجينوم الدقيق في الخلايا الجذعية المتعددة القوى باستخدام الحمض النووي القلة الوحيد الذي لامع (ssODNs)
- تصميم 100 نقطة أساس ssODNs تتمحور حول تسلسل gRNA الأكثر كفاءة تحديد أن يكون أفضل كفاءة القطع.
- منع إعادة انشقاق ODN المعاد دمجها عن طريق إدخال الطفرات الصامتة في تسلسل gRNA. طفرة صامتة واحدة في تسلسل PAM كافية، ولكن إذا لم يكن ذلك ممكنا، سوف 3-4 الطفرات الصامتة تعمل.
ملاحظة: لتسهيل فحص الحيوانات المستنسخة المستهدفة، يعتبر إدخال موقع تقييد ضمن حوالي 20 نقطة أساس من تسلسل gRNA مثاليًا. - تصميم ODN واحد مع التغيير الأساسي المطلوب (ق) لخلق طفرة من الفائدة وODN واحد دون التغيير الأساسي (ق).
ملاحظة: يجب ألا تزيد هذه التغييرات عن حوالي 20 نقطة أساس من موقع القطع المتوقع CRISPR/CAS9، حيث تنخفض إعادة التركيب بشكل كبير على مسافات أكبر. - طلب ssODNs اثنين من البائع من اختيار وإعادة تعليق في الماء لجعل 1 ميكروغرام / ميكرولتر الأسهم. تخزين الأسهم في -20 درجة مئوية.
8. إعداد التغوط
- لنقل ssODN وplasmids CRISPR-CAS9، لوحة خط الخلية المستهدفة في طبق 6 جيدا على MEFs المشع ة للوصول إلى 70-80٪ من الملاءمة بعد حضانة O / N.
- إعداد رد فعل الانفّاطي كما هو موضح في الجدول 6. خلط رد الفعل عن طريق الأنابيب والحضانة لمدة 15 دقيقة في RT. إضافة خليط رد فعل الانفتيف إسقاط إلى الخلايا.
- بعد 48 ساعة، قم بإعداد الخلايا لفرز الخلايا كما هو موضح في القسم 5.3.
- اختيار المستعمرات ~ 10 أيام بعد طلاء خلايا واحدة باستخدام ماصة 200 درجة مئوية. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى بئر واحد من 24 أو 48 لوحة جيدا المغلفة سابقا مع الجيلاتين وMEFs المشع في hESC المتوسطة مع Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد. استخدم الـ 100 ميكرولتر المتبقية لعزل الحمض النووي كما هو موضح في القسم 6.
9. التحقق من وجود طفرات في مستعمرات واحدة
- للتحقق من التكامل الناجح للssODN، خذ 5 ميكرولتر من الحمض النووي المعزول من كل مستعمرة لإجراء PCR باستخدام التمهيديات الفحص المصممة في القسم 2. تنقية منتجات PCR(جدول المواد)وإعداد هضم الإنزيم المقيد باستخدام موقع الإنزيم الفريد الذي تم إنشاؤه في ssODN.
ملاحظة: يتضمن هذا الهضم أيضًا حاجز إنزيم التقييد والتركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة لإنزيم تقييد في حجم 40 ميكرولتر. - مزيج رد الفعل عن طريق الأنابيب والحضانة في درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لمدة 1-3 ساعة.
- تصور منتجات PCR المهضومة على 1.5٪ (ث / ف) EtBr agarose هلام الكهربائي في 80-100 V لمدة 40 دقيقة. إذا حدث التكامل الناجح للssODN، تسلسل طفرات محددة باستخدام التمهيدي متداخلة.
Representative Results
توليد الـ RNAs وفحص الإندلات
سيتم استنساخ كل gRNA في متجه بلازميد ويعبر عنها باستخدام المروج U6. يتم استخدام إنزيم تقييد AflII لخطي بلازميد (#41824) ويقع بعد المروج U6. يتم استنساخ الفرقة 100 نقطة أساس التي تم إنشاؤها بعد صلب اثنين 60 نقطة أساس oligos في ناقلات التعبير gRNA باستخد?…
Discussion
في هذا البروتوكول، يظهر استخدام CRISPR-CAS9 جنبا إلى جنب مع اثنين من قوالب إصلاح ssODN لتوليد تغييرات محددة في الجينوم غير المتجانس أو المتجانس في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى. وقد أدى هذا الأسلوب إلى نجاح توليد خطوط الخلايا المسببة للسرطان التي تعبر عن التغيرات الجينية غير المتجانسة بك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI)، والمعاهد الوطنية للصحة من خلال المنح U01HL099656 (P.G. وD.L.F.) وU01HL134696 (P.G. و D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
