توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة لتسهيل توليد تغييرات النيوكليوتيدات المتجانسة أو المتجانسة المحددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى.
Abstract
توفر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى نظامًا قويًا لدراسة وظيفة الجينات ونمذجة الطفرات المحددة ذات الصلة بالمرض. إن توليد تعديلات جينية دقيقة غير متجانسة يشكل تحدياً بسبب تشكيل الإندل بوساطة كريسبر-كاس9 في الأليل الثاني. هنا، نقوم بإظهار بروتوكول للمساعدة في التغلب على هذه الصعوبة باستخدام اثنين من قوالب الإصلاح التي واحدة فقط يعبر عن تغيير التسلسل المطلوب، في حين أن كلا النموذجين تحتوي على طفرات صامتة لمنع إعادة قطع وتشكيل indel. هذه المنهجية هي الأكثر فائدة لتحرير الجينات مناطق الترميز من الحمض النووي لتوليد السيطرة المسببة للسرطان ومتحولة خطوط الخلايا الجذعية البشرية لدراسة الأمراض البشرية والبيولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحسين منهجيات التغوط والفحص إلى أقصى حد للحد من العمالة وتكلفة تجربة تحرير الجينات. وبشكل عام، ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع على العديد من مشاريع تحرير الجينوم التي تستخدم نموذج الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي أدوات قيمة لنمذجة الأمراض البشرية بسبب قدرتها على التجديد، مع الحفاظ على القدرة على توليد أنواع الخلايا من سلالات مختلفة1،2 ،3،4. هذه النماذج تفتح إمكانية استجواب وظيفة الجينات، وفهم كيف ترتبط الطفرات المحددة والأنماط الظاهرية بأمراض مختلفة5،6. ومع ذلك، لفهم كيفية ربط تغيير معين إلى النمط الظاهري معين، واستخدام التحكم isogenic المقترنة وخطوط الخلايا متحولة من المهم للسيطرة على خط لتقلب خط7،8. وقد استخدمت النوكلورات الشبيهة بالمنشطات والزنك لتوليد طفرات الإدراج أو الحذف (indels) في نماذج وراثية متنوعة، بما في ذلك الخلايا الأولية؛ ولكن هذه nucleases يمكن أن تكون مرهقة للاستخدام ومكلفة9،10،11،12،13،14. وقد أحدث اكتشاف تكرار قصير متباعد (CRISPR)-CAS9 nuclease متفاوتة في الميدان بسبب الكفاءة في تكوين الإندل في أي منطقة من الجينوم تقريبا، وبساطة الاستخدام، وخفض التكلفة15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19.
وكان التحدي في استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم القائم على CRISPR-CAS9 توليد أو تصحيح طفرات محددة في أليل واحد دون خلق طفرة indel في الأليل الثاني20. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو التغلب على هذا التحدي باستخدام اثنين من قوالب إصلاح oligonucleotide واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssODN) للحد من تشكيل الإندل في الأليل الثاني. تم تصميم كل من ssODNs لاحتواء الطفرات الصامتة لمنع إعادة قطع من قبل NUcLEASE CAS9، ولكن واحد فقط يحتوي على تغيير الفائدة. هذا الأسلوب يزيد من كفاءة توليد تعديل وراثي غير متجانسة دون تحفيز تشكيل indel في الأليل الثاني. باستخدام هذا البروتوكول، تظهر تجارب تحرير الجينات في ستة مواقع جينية مستقلة الإدخال الدقيق للتغيير الجيني المطلوب في الأليل واحد دون تشكيل الإندل في الأليل الثاني ويحدث مع كفاءة عامة من ~ 10٪. وقد تم تكييف البروتوكول الموصوف من ماغواير وآخرون21.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، يظهر استخدام CRISPR-CAS9 جنبا إلى جنب مع اثنين من قوالب إصلاح ssODN لتوليد تغييرات محددة في الجينوم غير المتجانس أو المتجانس في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى. وقد أدى هذا الأسلوب إلى نجاح توليد خطوط الخلايا المسببة للسرطان التي تعبر عن التغيرات الجينية غير المتجانسة بك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI)، والمعاهد الوطنية للصحة من خلال المنح U01HL099656 (P.G. وD.L.F.) وU01HL134696 (P.G. و D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
