Summary

Isolação do globo ocular intacto para obter o tecido integral da superfície da ocular para a examinação histológica e immunohistochemistry

Published: October 20, 2019
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Summary

Este protocolo descreve um método para o isolamento do globo ocular do rato com pálpebra, superfície ocular, segmentos anterior e posterior em posição relativamente intacta.

Abstract

A superfície ocular (OS) consiste em uma folha epitelial com três partes conectadas: conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar e epitélio corneano. O rompimento do ósmio conduziria ao keratitis, à conjuntivite ou aos ambos (Keratoconjunctivitis). Em modelos animais experimentais com certas modificações genéticas ou operações artificiais, é útil examinar todas as partes da folha epitelial do so para avaliar as alterações patogenéticas relativas de cada parte em paralelo. Entretanto, a dissecção do tecido do ósmio como um todo sem distorção ou dano foi desafiando, primeiramente devido à suavidade e à magreza do ósmio afixada às pálpebras e ao globo ocular fisicamente separados contudo móveis. Adicionalmente, o soquete profundo do olho dado forma pelos ossos duros do crânio/orbital é ocupado inteiramente pelo globo ocular que sae do espaço limitado para dissecções operando-se. Em conseqüência, a dissecção direta do globo ocular com OS tecidos associados do ósmio do lado facial conduziria frequentemente aos danos do tecido, especial a conjuntiva palpebral e bulbar. Neste protocolo, nós descrevemos um método para remover o crânio e os ossos orbitais sequencialmente de uma cabeça de rato cortada pelo, deixando as pálpebras, a superfície da ocular, a lente e o retina completamente em uma parte. A integridade da folha do sistema operacional foi bem preservada e pode ser examinada por histologia ou imunocoloração em uma única seção.

Introduction

A superfície da ocular consiste em uma folha contínua do epitélio regionalizada que inclui a conjuntiva palpebral, a conjuntiva bulbar e a córnea1. Muitas estruturas glandulares estão associadas ao epitélio da superfície ocular e, juntas, geram uma camada de película lacrimal protegendo a superfície da córnea da secagem e das invasões ambientais2. O rompimento do ósmio conduziria ao keratitis, à conjuntivite ou aos ambos (Keratoconjunctivitis). Tanto os fatores genéticos quanto os irritantes ambientais ou suas interações contribuem para alterações patológicas do sistema operacional3,4. Assim, uma variedade de modelos animais geneticamente modificados e fisicamente ou quimicamente induzida têm sido usados para estudar os processos de doença do sistema operacional humano.

A estrutura e a função do ósmio do rato são similares àquela dos seres humanos em muitas maneiras. Os componentes da película do rasgo secretado pelas glândulas da ocular são igualmente similares entre ratos e seres humanos. Uma riqueza de estudos foi conduzida usando modelos do rato para elucidar mecanismos de doenças humanas do ósmio5,6,7. Em muitas ocasiões, é fundamental analisar global em vez de mudanças moleculares locais do sistema operacional para obter informações abrangentes o mesmo tratamento experimental. Portanto, a preparação da amostra com boa integridade é necessária para garantir que cada parte do sistema operacional seja analisada simultaneamente.

O ósmio do rato associa firmemente com o globo ocular que foi encaixado no soquete/órbita do olho (um copo ósseo feito de diversos ossos diferentes do crânio) e conecta-lhe com os tecidos conexivos finos. Existem enormes desafios para dissecação da superfície ocular inteira sem danificar a conjuntiva palpebral ou bulbar. Estes desafios descem de: (i) o OS é macio e fino e afixado às pálpebras e ao globo ocular fisicamente separados contudo móveis, conseqüentemente vulneráveis para a distorção e os danos; e (II) o espaço limitado entre os ossos orbitais e o globo ocular restringem as operações de dissecção. Os desafios são muito maiores para o rato adulto. No rato embrionário, a ossificação orbital do osso não é completa e os tecidos circunvizinhos são frouxos relativos8. A cabeça pode ser removida e cortada e, em seguida, submetida diretamente à fixação de paraformaldeído (PFA) e incorporação9. Pelo contraste, os ossos orbitais pós-natal e adultos do rato são totalmente ossificados com os tecidos circunvizinhos grossos, fazendo a penetração dos fixadores menos eficientes. Além disso, os ossos orbitais/crânio são duros e quebradiços, facilmente quebrados quando seccionando-os nos compostos de incorporação macios tais como a parafina. Os pedaços quebrados de ossos, por unanimidade, rasgar os tecidos próximos, resultando em morfologia do tecido inferior.

Muitos estudos publicados mostraram frequentemente a superfície parcial da ocular, que pode ser suficiente para suas finalidades particulares da pesquisa10,11. Uma examinação bruta das literaturas encontrou somente poucos estudos que mostram a superfície intacta inteira da ocular que está sendo demonstrada sem descrição detalhada de protocolos12,13da dissecção. Neste protocolo, nós detalhamos um método da dissecção para obter a superfície pós-natal integral da ocular, em que os ossos orbitais e do crânio foram removidos ordenadamente, deixando a superfície intocada da ocular junto com o globo ocular e as pálpebras, minimizando os danos físicos. Nós examinamos mais a histologia do ósmio e executámos immunohistochemistry usando as seções do tecido preparadas com este protocolo.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo o uso de camundongos foram aprovados pelo Comitê de cuidado e uso de animais, centro Oftalmico de Zhongshan, e aderiram à declaração de ARVO para o uso de animais em pesquisa Oftaltrônica e visão. 1. dissecção do globo ocular com superfície ocular intacta e pálpebras Dissecar a cabeça. Eutanizar dia pós-natal 10 (P10) e P28 camundongos (veja a tabela de materiais para cepas de mouse) por luxação cervical, corte …

Representative Results

Os principais ossos do crânio vistos a partir de diferentes perspectivas foram ilustrados na Figura 1A-E, com cores que denitavam diferentes ossos. Utilizamos animais de quatro semanas de idade para demonstração dos processos de dissecção. Depois das etapas de dissecção 1.1.1-1.1.3 e de uma pré-fixação curta (etapa 1.1.4), o globo ocular com os ossos faciais associados é demonstrado na Figura 1…

Discussion

Um lembrete crítico para a preparação do globo ocular intacto é que todos os ossos orbitais devem ser removidos completamente, especialmente os ossos da juga e lacrimal, que são pequenos e localizados perto do fundo do soquete do olho. Qualquer osso esquerdo pode complicar a histologia que se seguiu. No caso de um pequeno pedaço de osso não foi completamente removido da dissecção por acidente, ele pode ser retirado do bloco de parafina incorporação usando um par de sharptweezers. O furo deixado para trás deve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem ao Prof. Rong Ju a leitura crítica do manuscrito e todos os membros do laboratório para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de ciências naturais da China (NSFC: 31571077; Pequim, China), o Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, província de Guangdong, China), “plano de 100 pessoas” da Universidade de Sun Yat-Sen (8300-18821104; Guangzhou, província de Guangdong, China), e financiamento da pesquisa do laboratório chave do estado do ophthalmology no centro ophthalmic de Zhongshan (303060202400339; Guangzhou, província de Guangdong, China).

Materials

1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech FG701-01
50ml centrifuge tube Corning 430829
Adhesive microscope slides Various
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:500 – 1,000
Alexa Fluor 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:500 – 1,000
Anti-K12 antibody Abcam ab124975 Suggested concentration 1:1,000
Anti-K14 antibody Abcam ab7800 Suggested concentration 1:800
Citric acid Various
Cover slide Various
Curved forceps World Precision Instruments 14127
Dissecting microscope. Olmpus SZ61
Ethyl alcohol Various
Fluorescent Microscope Zeiss AxioImager.Z2
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242
Microwave ovens Galanz P70D20TL-D4
Mouse strains C57/BL6 and Sv129 mixed
No.4 straight forceps World Precision Instruments 501978-6
Normal Goat Serum Various
Paraformaldehyde (PFA) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane
Tissue culture dish Various
Trisodium citrate Various
Triton X-100 Sigma-Aldrich SLBW6818

References

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Cite This Article
Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).

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