Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour l'examen histologique et l'immunohistochimie
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour l’isolement du globe oculaire de souris avec la paupière, la surface oculaire, les segments antérieurs et postérieurs dans la position relativement intacte.
Abstract
La surface oculaire (OS) se compose d’une feuille épithéliale avec trois parties reliées : conjonctive palpébrale, conjonctive bulbar et épithélium cornéen. La perturbation du système d’exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Dans les modèles animaux expérimentaux avec certaines modifications génétiques ou opérations artificielles, il est utile d’examiner toutes les parties de la feuille épithéliale OS pour évaluer les changements pathogénétiques relatifs de chaque partie en parallèle. Cependant, la dissection du tissu d’OS dans son ensemble sans distorsion ou dommages a été difficile, principalement en raison de la douceur et la minceur de l’OS apposé sur les paupières physiquement séparées mais mobiles et globe oculaire. En outre, la douille oculaire profonde formée par le crâne dur / os orbitaux est entièrement occupé par le globe oculaire laissant un espace limité pour l’exploitation des dissections. En conséquence, la dissection directe du globe oculaire avec les tissus associés os du côté facial conduirait souvent à des dommages de tissu, particulièrement la conjonctive palpébrale et bulpale. Dans ce protocole, nous avons décrit une méthode pour enlever le crâne et les os orbitaux séquentiellement d’une tête de souris coupée en deux, laissant des paupières, la surface oculaire, la lentille et la rétine tout à fait en une seule pièce. L’intégrité de la feuille d’OS était bien préservée et pouvait être examinée par histologie ou immunostaining dans une seule section.
Introduction
La surface oculaire se compose d’une feuille continue d’épithélium régionalisé comprenant la conjonctive palpébrale, la conjonctive bulbar et la cornée1. Beaucoup de structures glandulaires sont associées à l’épithélium de surface oculaire et génèrent ensemble une couche de film lacrymal protégeant la surface de cornée du séchage et des invasions environnementales2. La perturbation du système d’exploitation entraînerait une kératite, une conjonctivite ou les deux (kératoconjonctivite). Les facteurs génétiques et les irritants environnementaux ou leurs interactions contribuent à des altérations pathologiques de l’OS3,4. En conséquence, une variété de modèles animaux génétiquement modifiés et d’origine physique ou chimique ont été utilisés pour étudier les processus de la maladie de l’OS humain.
La structure et la fonction de l’OS de souris est similaire à celle des humains à bien des égards. Les composants du film lacrymal sécrétépar par les glandes oculaires sont également similaires entre les souris et les humains. Une multitude d’études a été menée à l’aide de modèles murins pour élucider les mécanismes des maladies humaines OS5,6,7. Dans de nombreuses occasions, il est essentiel d’analyser les changements moléculaires globaux au lieu des changements moléculaires locaux de l’OS pour obtenir des informations complètes sous le même traitement expérimental. Par conséquent, la préparation de l’échantillon avec une bonne intégrité est nécessaire pour s’assurer que chaque partie du système d’exploitation doit être analysée simultanément.
Le système d’exploitation de souris s’associe étroitement avec le globe oculaire qui a été incorporé dans la prise/orbite d’oeil (une tasse osseuse faite de plusieurs os différents de crâne) et se connecte à lui par des tissus conjonctifs minces. Il existe d’énormes défis pour disséquer toute la surface oculaire sans endommager la conjonctive palpébrale ou bulbe. Ces défis descendent de: (i) l’OS est doux et mince et apposé sur les paupières et les globes oculaires physiquement séparés mais mobiles, donc vulnérables pour la distorsion et les dommages; et (ii) l’espace limité entre les os orbitaux et le globe oculaire limitent les opérations de dissection. Les défis sont beaucoup plus grands pour la souris adulte. Chez la souris embryonnaire, l’ossification orbitale osseuse n’est pas complète et les tissus environnants sont relativement lâches8. La tête peut être enlevée et coupée en deux, puis directement soumise à la fixation du paraformaldéhyde (PFA) et à l’intégration9. En revanche, les os orbitaux postnatals et adultes de souris sont entièrement ossifiés avec les tissus environnants épais, rendant la pénétration des fixatifs moins efficace. En outre, les os orbitaux/crâne sont durs et cassants, facilement cassés en les sectionnant dans les composés mous d’embedding tels que la paraffine. Les morceaux cassés d’os déchireront unanimement les tissus voisins ayant pour résultat la morphologie inférieure de tissu.
Beaucoup d’études éditées ont souvent montré la surface oculaire partielle, qui peut être suffisante pour leurs buts particuliers de recherche10,11. Un examen brut des littératures a trouvé seulement peu d’études montrant la surface oculaire intacte entière étant démontrée sans description détaillée des protocoles de dissection12,13. Dans ce protocole, nous avons détaillé une méthode de dissection pour obtenir la surface oculaire postnatale intégrale, dans laquelle les os orbitaux et de crâne ont été ordonnés enlevés, laissant la surface oculaire intacte avec le globe oculaire et les paupières, minimisant les dommages physiques. Nous avons examiné en outre l’histologie d’OS et avons exécuté l’immunohistochimie utilisant les sections de tissu préparées avec ce protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un rappel critique pour la préparation du globe oculaire intact est que tous les os orbitaux doivent être enlevés complètement, en particulier les os juga et lacrimal, qui sont petits et situés près du fond de la douille oculaire. Les os restants peuvent compliquer l’histologie qui s’ensuit. Dans le cas où un petit morceau d’os n’a pas été complètement enlevé de la dissection par accident, il peut être choisi à partir du bloc de paraffine d’emcasterie utilisant une paire de sharptweezers. Le trou laissé der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le professeur Rong Ju pour la lecture critique du manuscrit, et tous les membres du laboratoire pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, Chine), le Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, province du Guangdong, Chine), « Plan 100 personnes » de l’Université Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, province du Guangdong, Chine), et le financement de la recherche du State Key Laboratory of Ophthalmology du Zhongshan Ophthalmic Center (30306020202400339; Guangzhou, province du Guangdong, Chine).
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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