Summary
Denne protokol beskriver en metode til isolering af muse øjeæblet med øjenlåg, okulær overflade, forreste og bageste segmenter i relativt intakt position.
Abstract
Okulær overflade (os) består af et epitel blad med tre forbundne dele: øjenspalten conjunctiva, bulbar conjunctiva og cornea epithelium. Forstyrrelse af OS ville føre til keratitis, konjunktivitis eller begge dele (keratoconjunctivitis). I eksperimentelle dyremodeller med visse genetiske modifikationer eller kunstige operationer er det nyttigt at undersøge alle dele af OS epitel arket for at evaluere relative patogengenetiske ændringer af hver del parallelt. Men, dissektion af OS væv som helhed uden forvrængning eller skade har været udfordrende, primært på grund af blødhed og tyndhed af OS fastgjort til fysisk adskilte endnu bevægelige øjenlåg og øjeæblet. Desuden er den dybe øjen sokkel dannet af den hårde kraniet/orbital knogler er fuldt besat af øjeæblet forlader begrænset plads til drift dissektioner. Som et resultat, direkte dissektion af øjeæblet med tilhørende os væv fra ansigtet side ville ofte føre til vævsskader, især øjenspalten og bulbar conjunctiva. I denne protokol, vi beskrev en metode til at fjerne kraniet og orbital knogler sekventielt fra en bisected muse hoved, forlader øjenlåg, okulær overflade, linse og nethinden helt i ét stykke. Integriteten af OS-arket var velbevaret og kunne undersøges ved histologi eller immun farvning i et enkelt afsnit.
Introduction
Den okulære overflade består af et kontinuerligt ark regionaliseret Epitelet, herunder øjenspalten conjunctiva, bulbar conjunctiva og cornea1. Mange glandulære strukturer er forbundet med den okulære overflade epitel og sammen generere et lag af tåre film beskytter hornhinden overflade fra tørring og miljømæssige invasioner2. Forstyrrelse af OS ville føre til keratitis, konjunktivitis eller begge dele (keratoconjunctivitis). Både genetiske faktorer og miljø irritanter eller deres interaktioner bidrager til patologiske ændringer af os3,4. Derfor er en række genetisk fremstillede og fysisk eller kemisk inducerede dyremodeller blevet brugt til at studere sygdomsprocesser i det menneskelige OS.
Strukturen og funktionen af musen OS er magen til den af mennesker på mange måder. De tåre film komponenter udskilles af de okulære kirtler er også ens mellem mus og mennesker. Et væld af undersøgelser er blevet udført ved hjælp af musemodeller til belyse mekanismer af menneskelige os sygdomme5,6,7. I mange tilfælde er det afgørende at analysere globale i stedet for lokale molekylære ændringer af OS for at få omfattende information under den samme eksperimentelle behandling. Derfor er prøveforberedelse med god integritet nødvendig for at sikre, at hver del af operativsystemet analyseres samtidigt.
Musen OS stramt associerer med øjeæblet, der var indlejret i øjet socket/kredsløb (en Bony Cup lavet af flere forskellige kraniet knogler) og forbinder til det gennem tynde bindevæv. Der findes enorme udfordringer for dissekting hele okulær overflade uden at beskadige øjenspalten eller bulbar conjunctiva. Disse udfordringer kommer ned fra: (i) OS er bløde og tynde og anbringes på fysisk adskilte, men bevægelige øjenlåg og Eyeball, derfor sårbar for forvrængning og beskadigelse; og (II) den begrænsede plads mellem de orbital knogler og øjeæblet begrænser dissektions operationer. Udfordringerne er meget større for voksne mus. I embryonale mus, den orbital knogle ossifikation er ikke komplet og omgivende væv er relativ løs8. Hovedet kan fjernes og bisected, og derefter direkte udsat for PARAFORMALDEHYD (PFA) fiksering og indlejring9. I modsætning hertil er de postnatal og voksne mus orbital knogler fuldt ossificeret med tykke omgivende væv, hvilket gør penetration af fikater mindre effektiv. Desuden er orbital/kraniet knogler hårde og skøre, let brudt, når skære dem i de bløde indlejring forbindelser såsom paraffin. De brudte stykker af knogler vil enstemmigt rive de nærliggende væv resulterer i ringere væv morfologi.
Mange offentliggjorte undersøgelser viste ofte delvis okulær overflade, hvilket kan være tilstrækkeligt til deres særlige forskningsformål10,11. En grov undersøgelse af litteraturer fandt kun få undersøgelser viser hele intakt okulær overflade, der påvises uden detaljeret beskrivelse af dissektion protokoller12,13. I denne protokol, vi detaljeret en dissektion metode til at opnå en integreret postnatal okulær overflade, hvor orbital og kraniet knogler blev ordnet fjernet, forlader uberørt okulær overflade sammen med øjeæblet og øjenlåg, minimere de fysiske skader. Vi undersøgte yderligere OS histologi og udførte immun histokemi ved hjælp af vævs sektioner udarbejdet med denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer brug af mus blev godkendt af Animal Care og brug udvalg, Zhongshan oftalmologiske Center, og holdt sig til ARVO erklæring om brug af dyr i oftalmisk og vision forskning.
1. dissektion af øjeæblet med intakt okulær overflade og øjenlåg
- Dissekere hovedet.
- Euthanize postnatale dag 10 (P10) og P28 mus (Se tabellen over materialer til muse stammer) ved livmoderhals dislokation, skær hovedet af halsen af et par skarpe saks.
- Bisect hoved med et par lige saks langs sagittale midterlinjen begyndende ved interparietalknoglen knogle rostrally til næse (figur 1a, B).
Bemærk: kraniet knogle hærder med mus ældning, være omhyggelig med at holde saks skære langs midterlinjen så meget som muligt. - Placer hver halvdel af det bisected hoved i en ren Petri skål, afskårne kæben og tungen først ved hjælp af skarp saks. Frigør synsnerven ved at skære det væk fra hjernen før den optiske chiasm placering, og fjern alle hjernevæv, herunder olfaktoriske pære fastgjort til kraniet væggen.
- Nu skal de resterende væv have alle kraniet/orbital knogler forbundet med øjeæblet (figur 1C, D). Vask den resterende del med PBS for at rense blod og hår snavs.
- Præfikset væv med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA, i fosfat-bufferet saltvand [PBS], pH 7,4) i et 50 mL konisk rør ved stuetemperatur (RT) med rotation. Den omtrentlige fikserings periode er som følger: ~ 10 min for p0 til P7; ~ 20 min for P8 til P28; og ~ 30 min for P29 og ældre.
Bemærk: præfiksation giver vævs stivhed, hvilket gør den efterfølgende dissektion lettere. Desuden, præfiksation undgår at efterlade fersk væv ufast for længe før dissektion er færdig.
Forsigtig: PFA er farlig og skal håndteres forsigtigt.
- Fjern kraniet/orbital knogler.
- Efter præfixing skal du hurtigt vaske det dissekterede hoved i PBS tre gange for yderligere at eliminere de ødelagte hår og fikseringsmidler for at fortsætte med yderligere dissektion.
Forsigtig: udsættelse for fikater under dissektion kan være sundhedsskadelig. - Placer vævet i 10 cm Petri skål, skær kraniet i tre dele langs de planer, som er angivet i figur 1D, E. Øjeæblet i soklen er skjult i den midterste del af kraniet under ethmoid, frontal og maxillær knogler (figur 1D, E).
- Brug to par af No. 4 lige pincet til at skrælle ethmoid-knoglen for fuldt ud at udsætte frontal-og maxillær knoglerne (figur 1F).
- Geografisk opdeling af kraniets overflade (herunder maxillær og frontal knogler) i 4 områder (figur 1F). Indsæt spidsen af buede pincet vandret i hvert område for at fjerne maxillær og frontal knogler sekventielt (figur 1F).
Bemærk: de maxillære knogler kan ikke alle fjernes på én gang. Tålmodigt dissekere dem stykke for stykke. Den frontale knogle er direkte forbundet til øjeæblet gennemblødt bindevæv. Vær forsigtig, når du fjerner den fra øjeæblet for at undgå at strække øjeæblet og beskadige conjunctiva. - Efter fjernelse af partiel maxillær knogle og alle frontal knogler vil de underliggende lacrimal-og Jugal-ben blive eksponeret (figur 1G). Fjern de to knogler og tilknyttede subkutane muskler og fedt omkring øjeæblet, trim øjeæblet med vedlagte øjenlåg og hud i en lille firkantet figur blok for at reducere vævs volumen og lette orienteringen af vævet, når det indlejres (figur 1 H).
- Placer øjeæblet og det tilhørende væv tilbage i 4% PFA, og Fortsæt med at fastgøre natten over ved 4 °C. Det faste væv kan opbevares i mindst en måned ved 4 °C i PBS med tilsætning af 0,02% NaN3. Alternativt, Fortsæt til histologisk analyse med det samme.
Bemærk: Hvis vævet skal opbevares i længere perioder, kan det let opbevares i 70% ethanol.
- Efter præfixing skal du hurtigt vaske det dissekterede hoved i PBS tre gange for yderligere at eliminere de ødelagte hår og fikseringsmidler for at fortsætte med yderligere dissektion.
2. histologisk analyse
- Paraffin sektion og hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning
- Følg standardprotokol beskrevet andetsteds9 for at udføre paraffin indlejring og skæring.
- Immun histokemi (IHC)
- Devoks paraffin sektionerne med xylen og rehydrere sektionerne gennem alkohol serien (100%, 95%, 80%) destilleret vand (dH2O).
- Udfør antigen hentning ved mikrobølge behandling af vævs diasene i 0,01 M citronsyre buffer (3 g trinatriucitrat, 0,4 g citronsyre pr. 1 L dobbeltdestilleret H2O) i en glasrutschebane med lav effekt (120 W). Energi bør periodisk leveres til total 5-10 min med hvert interval, der varer ca. 2 min.
Bemærk: High-Power mikrobølge eller konsekvent opvarmning ville føre til løsrivelse af vævs sektioner fra diaset. - Pick ud slides fra glas krukke, forsigtigt tørre af resterende væske omkring hver sektion ved hjælp af facial væv og placere dem på slide rack i en histologi boks. Tegn en firkant omkring hver sektion med en vandtæt histologisk pen. Placer 100 μL blokerende buffer (0,1% Triton X-100 og 10% æsel serum i 1x PBS) på hver firkant, og Inkuber i 30 minutter ved RT.
- Fjern forsigtigt blokerings opløsningen med vakuum, tilsæt det primære antistof (Se tabellen over materialer) med ønsket fortynding i blokerende buffer, og Fortsæt med at inkubere gliderne ved 4 °c i 24 timer eller længere.
Bemærk: koncentrationen for hvert primært antistof, der anvendes til IHC, varierer og skal afprøves i pilotforsøg. - Vask vævs gliderne med PBST (0,1% Triton i PBS) tre gange, i hver 10 min. Gentag trin 2.2.4 med det sekundære antistof (Se tabel over materialer) sammen med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (dapi), som erstatter blokerings bufferen. Fortsæt med at inkubere i mindst 4 timer eller længere ved stuetemperatur (RT).
- Fjern det sekundære antistof, vask vævs sektioner med PBST-opløsning tre gange, i 10 minutter hver, og vask derefter med Clean PBS i yderligere 5 minutter.
- Aftør de resterende PBS-omgivende vævs sektioner, Monter dæksedlerne på sektioner med monterings medium. Udfør fluorescerende mikroskopi for at opnå billeder (Se tabellen over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De store kraniet knogler set fra forskellige perspektiver blev illustreret i figur 1A-E, med farver, der betegner forskellige knogler. Vi brugte fire uger gammelt dyr til demonstration af dissektions processerne. Efter dissektion-trin 1.1.1-1.1.3 og en kort præfiksation (trin 1.1.4) demonstreres øjeæblet med tilhørende ansigts knogler i figur 1E. Yderligere trimning at fjerne forreste (nasal og premaxillær) og posterior (f. eks parietal) samt ethmoid knogler genereret vævs blok med hovedsagelig maxillær og frontal knogler oven på øjeæblet (figur 1F). Sekventiel fjernelse af disse knogler i henhold til udpegede områder i figur 1F eksponerede underliggende lacrimal og Jugal knogler samt harderin kirtel (figur 1G). Harderin kirtel knyttet til øjeæblet tjente som en milepæl (figur 1G), og bør holdes på plads på alle tidspunkter. Isolering af øjeæblet blev afsluttet ved fjernelse af alle knogler og omgivende fedtstoffer og muskelvæv (figur 1H).
Efter paraffin indlejring, blev øjeæblet sektioneret og H & E-farvede. Repræsentative billeder er vist i figur 2. De relative intakte positioner af øjenlåg, hornhinde og konjunktival overflade blev visualiseret i en sektion (figur 2A), hvoraf dele blev forstørret i figur 2B, C. Linsen morfologi er svært at vedligeholde (figur 2A) på grund af sin stivhed og skrøbelighed. Vi anvendte denne dissektion metode til andre postnatale aldre og viste et eksempel på H & E histologi af P10 øjeæblet sektion (figur 3). Generelt, jo yngre musen er, jo bedre er øjeæblet morfologi bevaret. Immunofarvede paraffin sektioner fra serielle postnatale aldre er vist i figur 4, med keratin 12 (K12)(figur 4A-F) og Keratin 14 (K14) (figur 4G-L) farvning af hornhinden og hele os epithelium, Henholdsvis.
Figur 1: illustration af øjeæblet dissektion i 4-ugers gammel voksen mus. (A-D) Det skematiske diagram over kraniets sammensætning set fra henholdsvis top (A), bund (B), lateral (C) og mellemste plan (D). Stiplede linjer i (A) og (B) angiver de bierede planer. (E) bisected-halv kraniet ved 4-ugers alderdom, der nøjagtigt matcher (D). F) medial-plane visning af dissekeret væv mellem de to tværgående planer i (D) og (E). Øjeæblet (stiplede cirkel) var hovedsageligt indlejret under frontal (Fron) og maxillær (max). Farvede stiplede linjer geografisk opdele det bisected flyet i 4 områder, hvor knogler blev groft fjernet som pr rækkefølgen eller tal. Bemærk, at ethmoid (ETH) knoglen er blevet fjernet. G) efter fjernelse af frontal knogle og partiel maxillær blev der eksponeret harderin kirtel (har) og Jugal (Jug) og lacrimal (La) knogler. Cirkel stiplede linjer indikerer øjeæblet position. (H) isoleret øjeæblet set indefra efter dissektion afsluttet. Pil peger på synsnerven (on). E = Eye, na = nasal, præ = premaxilla, Max = Maxillær, La = lacrimal, Fron = frontal, Ali = Alisphenoid, Jug = Jugal, PAL = Palatin, Ptery = pterygoid, squ = Squamosal, par = parietal, ETH = ethmoid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: H &Amp; E histologi af det okulære overfladevæv ved 4-ugers postnatal. (A) øjenlåg, conjunctiva og hornhinden visualiseres i én vævs sektion. Boxed områder af "b" og "c" blev forstørret i henholdsvis (B) og (C). B) cornea epithelium, stroma og endothelium. C) conjunctiva med Flammernes Pokal celler. CE = cornea epithelium, St = stroma, Ed = endothelium, GC = Flammernes Pokal celle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: H &Amp; E histologi af det okulære overfladevæv på postnatale dag 10. (A) intakt øjeæblet ved P10. Boxed områder af "b" og "c" blev forstørret i henholdsvis (B) og (C). B) hornhinden. C) conjunctiva. CE = cornea epitel, St = stroma, Ed = endothelium, CJ = conjunctiva. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: immun farvning af den okulære overflade fra P5 til P15. Kvadrat-boxed område i hvert panel blev forstørret i deres højre. (A-F) Keratin 12 blev specifikt udtrykt i cornea epitel (pile). (G-L) Keratin 14 udtrykt i den okulære overflade. AC = forreste kammer, PC = øjenspalten conjunctiva. Dette tal blev ændret fra en tidligere publikation Guo et al.14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk påmindelse til forberedelse af den intakte øjeæblet er, at alle orbital knogler skal fjernes helt, især har og lacrimal knogler, som er små og placeret nær bunden af øjet socket. Eventuelle venstre-over knogler kan komplicere den efterfølgende histologi. Hvis et lille stykke knogle ikke var helt fjernet fra dissektion ved et uheld, kan det blive plukket ud fra indlejring paraffin blok ved hjælp af et par skarp pincet. Hullet efterladt skal fyldes med smeltet paraffin.
Der bør udvises yderligere forsigtighed ved håndtering af linsen. De ødelagte stykker af linsen er normalt spredt gennem hele afsnittet. Dette vil i høj grad påvirke mikroskopi undersøgelse og billedanalyse. Forsøg på at fjerne linsen ville skade enten den okulære overflade (hvis operationen blev udført fra ansigts siden) eller nethinden (hvis operationen var fra den optiske skive side af nethinden). En alternativ måde at reducere den negative indvirkning af tilstedeværelsen af linse væv uden dissektion er at ændre skæring retninger. For eksempel, at gemme den okulære overflade morfologi, skæring af paraffin blokken skal udføres fra forreste af øjeæblet til den bageste, ellers, fra den modsatte retning.
En nyttig note til at gøre for PFA-fast paraffin sektion er, at antigen hentning er normalt nødvendigt for immun farvning såsom brug af K12 og K14 antistoffer. Men der er mange undtagelser, at antigen hentning ville generere ikke-specifikke signaler øge baggrunds farvning. Således bør man være forsigtig, når man bruger antigen hentning teknologi, og bør test antistoffer i pilotforsøg, hvis det er muligt, på forhånd.
Generelt er der to metoder til isolering af øjeæblet fra kraniet/orbital knogler: (i) direkte dissekere øjeæblet fra ansigtet side; og (II) fjerne indersiden kraniet/orbital knogler for at frigøre øjeæblet. Udfordringen for den første metode er, at øjeæblet synker dybt ind i orbital stikket med et smalt mellemrum i mellem for dissektion. Desuden ville den bevægelige øjeæblet strække conjunctiva epitel på et givet tidspunkt, når dissektion værktøjer røre ved det, skaber utilsigtede skader. Derimod begynder den anden metode med dissektion af kraniet/orbital knogler, som er længere fra øjeæblet og tilhørende okulær overflade væv, hvilket reducerer risikoen for at beskadige conjunctiva. Desuden er der ingen rumlige konstriktioner for at udføre dissektioner. Selv om den første metode kan arbejde, hvis store advarsler blev taget, den anden er helt sikkert lettere og bedre.
Sammenfattende har vi beskrevet en metode til isolering af mus øjeæblet med intakt Øjenlåg og tilhørende okulær overflade fra de postnatale mus. Den beskrevne protokol er egnet til isolering af øjeæblet med intakt Øjenlåg og associeret okulært væv i postnatale mus. Protokollen er især nyttig, når integriteten af OS eller hele det okulære væv er påkrævet. Vi har brugt denne metode til at forberede vævsprøver til undersøgelse af keratin markører i OS under normale og patologiske forhold. Vi konkluderer, at de okulære væv fra sådanne præparater er særligt nyttige for at se på differentiale regler for et protein i forskellige dele af OS på et enkelt afsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takke Prof. Rong Ju for kritisk læsning af manuskriptet, og alle Lab medlemmer for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (NSFC: 31571077; Beijing, Kina), den Guangzhou City Sciences and Technologies innovation Project (201707020009; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina), "100 People plan" fra Sun Yat-sen Universitet (8300-18821104; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina), og forskning finansiering fra State Key laboratorium af Ophthalmology på Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
