分离完整眼珠以获得整体眼表面组织，用于组织学检查和免疫组织化学
Summary
该协议描述了一种在相对完整位置分离眼睑、眼表面、前段和后段的小鼠眼球的方法。
Abstract
眼部表面 （OS） 由上皮片组成，其三个连接部分：胸膜结膜、胸膜结膜和角膜上皮。操作系统中断会导致角膜炎、结膜炎或两者（角膜结膜炎）。在具有某些基因修饰或人工操作的实验动物模型中，检查 OS 上皮表的所有部分以并行评估每个部分的相对病理遗传变化非常有用。然而，对操作系统组织整体进行解剖，没有变形或损伤一直具有挑战性，这主要是因为附在物理上分离但可移动的眼睑和眼球的操作系统柔软和薄薄。此外，硬头骨/轨道骨骼形成的深眼窝被眼球完全占据，留下有限的空间进行解剖。因此，从面部侧直接切除眼球与相关的OS组织往往会导致组织损伤，特别是胸膜和胸膜结膜。在这个协议中，我们描述了一种从分离的小鼠头部依次取出头骨和轨道骨骼的方法，将眼睑、眼表面、透镜和视网膜完全分离在一块。OS 表的完整性得到了很好的保存，可以通过组织学或免疫染色在单个部分进行检查。
Introduction
眼部表面由连续的局部上皮片组成，包括胸膜结膜、胸膜结膜和角膜1。许多腺体结构与眼表面上皮相关，并共同产生一层撕裂膜，保护角膜表面免受干燥和环境入侵2。操作系统中断会导致角膜炎、结膜炎或两者（角膜结膜炎）。遗传因素和环境刺激物或其相互作用都促成了OS3，4的病理改变。因此，各种基因工程和物理或化学诱导的动物模型被用于研究人类操作系统的疾病过程。
鼠标操作系统的结构和功能在许多方面与人类相似。眼腺分泌的泪膜成分在小鼠和人类之间也相似。利用小鼠模型阐明人类OS疾病5、6、7的机制进行了大量研究。在许多情况下，分析操作系统的全局性而不是局部分子变化，以获得相同实验处理下的全面信息至关重要。因此，需要具有良好完整性的样品制备，以确保同时分析操作系统的每个部分。
鼠标操作系统与嵌入在眼窝/轨道中的眼球（由几个不同头骨制成的骨杯）紧密相连，并通过薄连接组织连接到它。在不破坏眼皮或胸膜结膜的情况下解剖整个眼部表面存在巨大的挑战。这些挑战来自：（i） 操作系统柔软而薄薄，并贴在物理上分离但可移动的眼睑和眼球上，因此容易受到变形和损坏;（ii）轨道骨骼和眼球之间的有限空间限制了解剖操作。对于成年小鼠来说，挑战要大得多。在胚胎小鼠中，轨道骨的骨化不完备，周围组织相对松散8。头部可以去除和分一半，然后直接进行甲醛（PFA）固定和嵌入9。相比之下，产后和成年小鼠轨道骨骼完全被厚厚的周围组织所渗透，使得固定剂的渗透效率降低。此外，轨道/头骨是硬和脆的，很容易打破时，切片他们在软嵌入化合物，如石蜡。破碎的骨头会一致撕裂附近的组织，导致劣质组织形态。
许多已发表的研究往往显示部分眼表面，这可能足以为他们的特定研究目的10，11。对文献的一次总检查发现，只有很少的研究显示整个完整的眼表面被证明没有详细的解剖协议12，13。在此协议中，我们详细介绍了一种解剖方法，以获得完整的产后眼部表面，其中轨道和头骨被有序地去除，留下未接触的眼表面以及眼球和眼睑，最大限度地减少了物理损伤。我们进一步检查了OS组织学，并使用使用该协议准备的组织部分进行免疫组织化学。
Protocol
Representative Results
Discussion
准备完整眼球的一个关键提醒是，所有轨道骨骼必须完全去除，尤其是小而靠近眼窝底部的朱加骨和乳状骨骼。任何遗留的骨头都可能使随后的骨骼学复杂化。如果一小块骨头没有被意外从解剖中完全去除，则可以使用一对尖锐的钳子从嵌入的石蜡块中挑选出来。此操作后，留下的孔应填充熔化的石蜡。
处理镜头时应格外小心。破碎的镜头通常分散在整个部分。这将极大地?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢荣居教授对手稿的批判性阅读，并感谢所有实验室成员提供技术支持。这项工作得到了国家自然科学基金（国家自然科学基金委员会：31571077）的资助;中国北京），广州市科技创新项目（201707020009）;中国广东省广州市”百人计划”来自中山大学（8300-18821104）;中国广东省广州市，中山眼科中心眼科国家重点实验室（303060202400339）;中国广东省广州市）。
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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