Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de muis oogbol met ooglid, oogoppervlak, voorste en posterieure segmenten in relatief intacte positie.
Abstract
Oculaire oppervlak (OS) bestaat uit een epitheel blad met drie verbonden delen: palpebrale conjunctiva, bulbaire conjunctiva en corneale epitheel. Verstoring van OS zou leiden tot keratitis, conjunctivitis of beide (keratoconjunctivitis). In experimentele diermodellen met bepaalde genetische modificaties of kunstmatige operaties, is het nuttig om alle delen van het OS epitheel blad te onderzoeken om relatieve Pathogenetische veranderingen van elk deel parallel te evalueren. Echter, dissectie van OS weefsel als geheel zonder vervorming of beschadiging is uitdagend, voornamelijk te wijten aan de zachtheid en de dunheid van het besturingssysteem aangebracht op fysiek gescheiden maar beweegbare oogleden en oogbol. Bovendien wordt het diepe oogcontact dat wordt gevormd door de harde schedel/orbitale botten volledig bezet door de oogbol, waardoor er weinig ruimte is voor de exploitatie van dissecties. Als gevolg daarvan, directe dissectie van de oogbol met geassocieerde OS weefsels uit de gezichts zijde zou vaak leiden tot weefselschade, vooral de palpebrale en bulbaire conjunctiva. In dit protocol hebben we een methode beschreven om de schedel en orbitale botten opeenvolgend te verwijderen van een in elkaar verteerde muis hoofd, waarbij oogleden, oogoppervlak, lens en netvlies helemaal in één stuk worden verwijderd. De integriteit van het OS-blad was goed bewaard gebleven en kon in één sectie worden onderzocht door histologie of immunokleuring.
Introduction
Het oogoppervlak bestaat uit een continu blad van geregiinaliseerd epitheel, inclusief palpebrale conjunctiva, bulbaire conjunctiva en cornea1. Veel klierstructuren worden geassocieerd met het oculaire oppervlak epitheel en samen genereren een laag van scheur film bescherming van het oppervlak van het hoornvlies van drogen en milieu invasies2. Verstoring van OS zou leiden tot keratitis, conjunctivitis of beide (keratoconjunctivitis). Zowel genetische factoren als milieu irriterende stoffen of hun interacties dragen bij aan pathologische veranderingen van het OS3,4. Dienovereenkomstig is een verscheidenheid aan genetisch gemanipuleerde en fysiek of chemisch geïnduceerde diermodellen gebruikt voor het bestuderen van ziekteprocessen van het menselijk OS.
De structuur en functie van de muis OS is op vele manieren vergelijkbaar met die van de mens. De door de oogklieren afgescheiden traan folie componenten zijn ook vergelijkbaar tussen muizen en mensen. Een schat aan studies is uitgevoerd met behulp van Muismodellen voor verhelderende mechanismen van menselijke OS ziekten5,6,7. In veel gevallen is het van cruciaal belang om wereldwijd te analyseren in plaats van lokale moleculaire veranderingen van het besturingssysteem om uitgebreide informatie te krijgen onder dezelfde experimentele behandeling. Daarom is Monstervoorbereiding met een goede integriteit nodig om ervoor te zorgen dat elk deel van het besturingssysteem gelijktijdig wordt geanalyseerd.
De muis OS nauw verbonden met de oogbol die werd ingebed in het oog socket/baan (een Bony Cup gemaakt van verschillende schedel botten) en verbindt met het door dunne bindweefsels. Er bestaan enorme uitdagingen voor het ontleden van het hele oogoppervlak zonder beschadiging van de palpebrale of bulbaire conjunctiva. Deze uitdagingen dalen van: (i) het besturingssysteem is zacht en dun en aangebracht op fysiek gescheiden maar beweegbare oogleden en oogbol, daarom kwetsbaar voor vervorming en beschadiging; en (II) de beperkte ruimte tussen de orbitale botten en de oogbol beperken de dissectie operaties. De uitdagingen zijn veel groter voor de volwassen muis. In de embryonale muis, de orbitale botossificatie is niet compleet en omringende weefsels zijn relatief los8. Het hoofd kan worden verwijderd en gebisde, en vervolgens direct onderworpen aan Paraformaldehyde (PFA) fixatie en inbedding9. Daarentegen zijn de postnatale en volwassen muis orbitale botten volledig verbeend met dikke omringende weefsels, waardoor de penetratie van Fixatieven minder efficiënt. Bovendien zijn de orbitale/schedel botten hard en broos, gemakkelijk gebroken bij het snijden in de zachte inbedding verbindingen zoals paraffine. De gebroken stukjes botten zullen unaniem de nabijgelegen weefsels scheuren, wat resulteert in inferieure weefsel morfologie.
Veel gepubliceerde studies vertoonden vaak een gedeeltelijk oogoppervlak, wat voldoende kan zijn voor hun specifieke onderzoeksdoeleinden10,11. Een totaal onderzoek van literatuur vond slechts weinig studies waaruit blijkt dat het geheel intact oculair oppervlak wordt gedemonstreerd zonder een gedetailleerde beschrijving van de dissectie protocollen12,13. In dit protocol hebben we een dissectie methode uitgewerkt om een integraal postnatale oculair oppervlak te verkrijgen, waarin orbitale en schedel botten ordelijk werden verwijderd, waardoor het onaangetaste oculaire oppervlak samen met de oogbol en oogleden werd gelaten en de fysieke schade werd geminimaliseerd. We onderzochten verder de OS histologie en voerden immunohistochemie uit met behulp van de weefsel secties die met dit protocol zijn bereid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een kritische herinnering voor de voorbereiding van de intacte oogbol is dat alle orbitale botten volledig moeten worden verwijderd, vooral de juga-en traan beenderen, die klein zijn en zich in de buurt van de onderkant van de oogkas bevinden. Eventuele overgebleven beenderen kunnen de daaruit voortvloeiende histologie compliceren. In het geval dat een klein stukje bot niet per ongeluk volledig uit de sectie is verwijderd, kan het worden afgehaald uit het insluitings paraffine blok met behulp van een paar sharppincet. Na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken prof. Rong Ju voor de kritische lezing van het manuscript en alle lableden voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Peking, China), het Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation project (201707020009; Guangzhou, provincie Guangdong, China), “100 people plan” van Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, provincie Guangdong, China), en onderzoek financiering van State Key laboratorium voor oogheelkunde in Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, provincie Guangdong, China).
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
