Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie

doi: 10.3791/60086 Published: October 20, 2019

Summary

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de muis oogbol met ooglid, oogoppervlak, voorste en posterieure segmenten in relatief intacte positie.

Abstract

Oculaire oppervlak (OS) bestaat uit een epitheel blad met drie verbonden delen: palpebrale conjunctiva, bulbaire conjunctiva en corneale epitheel. Verstoring van OS zou leiden tot keratitis, conjunctivitis of beide (keratoconjunctivitis). In experimentele diermodellen met bepaalde genetische modificaties of kunstmatige operaties, is het nuttig om alle delen van het OS epitheel blad te onderzoeken om relatieve Pathogenetische veranderingen van elk deel parallel te evalueren. Echter, dissectie van OS weefsel als geheel zonder vervorming of beschadiging is uitdagend, voornamelijk te wijten aan de zachtheid en de dunheid van het besturingssysteem aangebracht op fysiek gescheiden maar beweegbare oogleden en oogbol. Bovendien wordt het diepe oogcontact dat wordt gevormd door de harde schedel/orbitale botten volledig bezet door de oogbol, waardoor er weinig ruimte is voor de exploitatie van dissecties. Als gevolg daarvan, directe dissectie van de oogbol met geassocieerde OS weefsels uit de gezichts zijde zou vaak leiden tot weefselschade, vooral de palpebrale en bulbaire conjunctiva. In dit protocol hebben we een methode beschreven om de schedel en orbitale botten opeenvolgend te verwijderen van een in elkaar verteerde muis hoofd, waarbij oogleden, oogoppervlak, lens en netvlies helemaal in één stuk worden verwijderd. De integriteit van het OS-blad was goed bewaard gebleven en kon in één sectie worden onderzocht door histologie of immunokleuring.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het oogoppervlak bestaat uit een continu blad van geregiinaliseerd epitheel, inclusief palpebrale conjunctiva, bulbaire conjunctiva en cornea1. Veel klierstructuren worden geassocieerd met het oculaire oppervlak epitheel en samen genereren een laag van scheur film bescherming van het oppervlak van het hoornvlies van drogen en milieu invasies2. Verstoring van OS zou leiden tot keratitis, conjunctivitis of beide (keratoconjunctivitis). Zowel genetische factoren als milieu irriterende stoffen of hun interacties dragen bij aan pathologische veranderingen van het OS3,4. Dienovereenkomstig is een verscheidenheid aan genetisch gemanipuleerde en fysiek of chemisch geïnduceerde diermodellen gebruikt voor het bestuderen van ziekteprocessen van het menselijk OS.

De structuur en functie van de muis OS is op vele manieren vergelijkbaar met die van de mens. De door de oogklieren afgescheiden traan folie componenten zijn ook vergelijkbaar tussen muizen en mensen. Een schat aan studies is uitgevoerd met behulp van Muismodellen voor verhelderende mechanismen van menselijke OS ziekten5,6,7. In veel gevallen is het van cruciaal belang om wereldwijd te analyseren in plaats van lokale moleculaire veranderingen van het besturingssysteem om uitgebreide informatie te krijgen onder dezelfde experimentele behandeling. Daarom is Monstervoorbereiding met een goede integriteit nodig om ervoor te zorgen dat elk deel van het besturingssysteem gelijktijdig wordt geanalyseerd.

De muis OS nauw verbonden met de oogbol die werd ingebed in het oog socket/baan (een Bony Cup gemaakt van verschillende schedel botten) en verbindt met het door dunne bindweefsels. Er bestaan enorme uitdagingen voor het ontleden van het hele oogoppervlak zonder beschadiging van de palpebrale of bulbaire conjunctiva. Deze uitdagingen dalen van: (i) het besturingssysteem is zacht en dun en aangebracht op fysiek gescheiden maar beweegbare oogleden en oogbol, daarom kwetsbaar voor vervorming en beschadiging; en (II) de beperkte ruimte tussen de orbitale botten en de oogbol beperken de dissectie operaties. De uitdagingen zijn veel groter voor de volwassen muis. In de embryonale muis, de orbitale botossificatie is niet compleet en omringende weefsels zijn relatief los8. Het hoofd kan worden verwijderd en gebisde, en vervolgens direct onderworpen aan Paraformaldehyde (PFA) fixatie en inbedding9. Daarentegen zijn de postnatale en volwassen muis orbitale botten volledig verbeend met dikke omringende weefsels, waardoor de penetratie van Fixatieven minder efficiënt. Bovendien zijn de orbitale/schedel botten hard en broos, gemakkelijk gebroken bij het snijden in de zachte inbedding verbindingen zoals paraffine. De gebroken stukjes botten zullen unaniem de nabijgelegen weefsels scheuren, wat resulteert in inferieure weefsel morfologie.

Veel gepubliceerde studies vertoonden vaak een gedeeltelijk oogoppervlak, wat voldoende kan zijn voor hun specifieke onderzoeksdoeleinden10,11. Een totaal onderzoek van literatuur vond slechts weinig studies waaruit blijkt dat het geheel intact oculair oppervlak wordt gedemonstreerd zonder een gedetailleerde beschrijving van de dissectie protocollen12,13. In dit protocol hebben we een dissectie methode uitgewerkt om een integraal postnatale oculair oppervlak te verkrijgen, waarin orbitale en schedel botten ordelijk werden verwijderd, waardoor het onaangetaste oculaire oppervlak samen met de oogbol en oogleden werd gelaten en de fysieke schade werd geminimaliseerd. We onderzochten verder de OS histologie en voerden immunohistochemie uit met behulp van de weefsel secties die met dit protocol zijn bereid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedures met betrekking tot het gebruik van muizen werden goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité, Zhongshan Ophthalmic Center, en gehecht aan de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en Vision onderzoek.

1. dissectie van de oogbol met intact oculair oppervlak en oogleden

  1. Ontleden het hoofd.
    1. Euthananisatie postnatale dag 10 (P10) en P28 muizen (Zie de tabel met materialen voor muis stammen) door cervicale dislocatie, snijd het hoofd van de nek door een paar scherpe schaar.
    2. Bisect hoofd met een paar rechte schaar langs de sagittale middellijn beginnend bij het interpariëtale bot rostrally naar de nasale (Figuur 1a, B).
      Opmerking: de schedel botten verhardt met muis veroudering, wees voorzichtig om de schaar zo veel mogelijk langs de middenlijn te snijden.
    3. Plaats elke helft van de gebisde kop in een schone Petri schaal, snijd de kaak en tong eerst met een scherpe schaar. Gratis de oogzenuw door het snijden van de hersenen voorafgaand aan de optiek Chiasm locatie, en verwijder alle hersenweefsels met inbegrip van olfactorische lamp bevestigd aan de schedel muur.
    4. Nu moeten de overgebleven weefsels alle schedel/orbitale botten hebben die geassocieerd zijn met de oogbol (Figuur 1C, D). Was het resterende deel met PBS om bloed en haar puin te reinigen.
    5. Voorvoegsel weefsels met 4% Paraformaldehyde (PFA, in fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS], pH 7,4) in een conische buis van 50 mL bij kamertemperatuur (RT) met rotatie. De geschatte fixatietijd is als volgt: ~ 10 min voor P0 naar P7; ~ 20 min voor P8 naar P28; en ~ 30 min voor P29 en ouder.
      Opmerking: de voor fixatie biedt weefsel stijfheid waardoor de daaruit voortvloeiende dissectie gemakkelijker wordt. Bovendien vermijdt prefixatie het verlaten van vers weefsel niet te lang voordat de sectie is voltooid.
      Let op: PFA is gevaarlijk en moet voorzichtig behandeld worden.
  2. Verwijder schedel/orbitale botten.
    1. Na de voor fixatie, spoel de ontleed kop snel in PBS drie keer om de gebroken haren en Fixatieven verder te elimineren om verder te gaan met verdere dissectie.
      Let op: blootstelling aan Fixatieven tijdens dissectie kan schadelijk zijn voor de gezondheid.
    2. Plaats het weefsel in 10 cm Petri schaaltje, snijd de schedel in drie delen langs de vlakken aangegeven in Figuur 1D, E. De oogbol in het stopcontact is verborgen in het middelste deel van de schedel onder ethmoïde, frontale en maxillaire botten (Figuur 1D, E).
    3. Gebruik twee paren van No. 4 rechte tang om het ethmoïde bot te schillen om de frontale en maxillaire botten volledig bloot te leggen (Figuur 1F).
    4. Geografisch verdelen het schedel oppervlak (met inbegrip van maxillaire en de frontale botten) in 4 gebieden (Figuur 1F). Steek de punt van de gebogen Tang horizontaal in elk gebied om de maxillaire en frontale botten opeenvolgend te verwijderen (Figuur 1F).
      Opmerking: de maxillaire botten kunnen niet allemaal tegelijk worden verwijderd. Met een geduldig ontleden ze stuk voor stuk. Het frontale bot is rechtstreeks verbonden met de oogbol door zachte bindweefsels. Wees voorzichtig bij het verwijderen van de oogbol om het strekken van de oogbol te voorkomen en het bindvlies te beschadigen.
    5. Na verwijdering van het partiële maxillaire bot en alle frontale botten zouden de onderliggende traan-en jukbeen beenderen worden blootgesteld (Figuur 1G). Verwijder de twee botten en bijbehorende subcutane spieren en vetten rond de oogbol, trim de oogbol met bijgevoegde oogleden en de huid in een klein vierkant vormig blok om het weefsel volume te verminderen en vergemakkelijkt het oriënteren van het weefsel bij het insluiten (Figuur 1 H).
    6. Plaats de oogbol en de bijbehorende weefsels terug in 4% PFA en blijf 's nachts op 4 °C fixeren. Het vaste weefsel kan gedurende ten minste één maand worden bewaard bij 4 °C in PBS met een toevoeging van 0,02% NaN3. U ook onmiddellijk naar histologische analyse gaan.
      Opmerking: als het weefsel voor langere perioden moet worden opgeslagen, kan het gemakkelijk worden opgeslagen in 70% ethanol.

2. histologische analyse

  1. Paraffine gedeelte en hematoxyline en eosine (H & E) kleuring
    1. Volg het standaardprotocol dat elders wordt beschreven9 om paraffine insluiten en snijden uit te voeren.
  2. Immunohistochemie (IHC)
    1. Dewax de paraffine delen met xyleen en hydrateer de secties door middel van alcohol Series (100%, 95%, 80%) in gedistilleerd water (dH2O).
    2. Antigeen opvraging uitvoeren door microgolf behandeling van de weefsel glaasjes in 0,01 M citroenzuur buffer (3 g triatriumcitraat, 0,4 g citroenzuur per 1 L dubbel gedistilleerd H2O) in een glazen schuif pot met laag vermogen (120 W). Energie moet met tussenpozen worden geleverd voor totaal 5-10 min met elk interval van ongeveer 2 min.
      Opmerking: High-Power magnetron of consistente verwarming zou leiden tot loslating van weefsel secties van de glijbaan.
    3. Kies de dia's uit de glazen pot, veeg voorzichtig de restvloeistof rond elke sectie af met behulp van gezichts weefsels en plaats ze op het schuif rek in een histologie doos. Teken een vierkant rond elke sectie met een waterdichte histologische pen. Plaats 100 μL blokkerende buffer (0,1% Triton X-100 en 10% Donkey serum in 1x PBS) op elk vierkant en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT.
    4. Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing met vacuüm, voeg het primaire antilichaam toe (Zie de tabel met materialen) met de gewenste verdunning in de blokkerende buffer en blijf de glaasjes bij 4 °c gedurende 24 uur of langer inbroed.
      Opmerking: de concentratie voor elk primair antilichaam dat voor IHC wordt gebruikt, varieert en moet worden getest in proef experimenten.
    5. Wassen weefsel dia's met PBST (0,1% Triton in PBS) drie keer, voor 10 min elk. Herhaal stap 2.2.4 met behulp van het secundaire antilichaam (Zie tabel met materialen) samen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ter vervanging van de blokkerende buffer. Blijven gedurende ten minste 4 uur of langer bij kamertemperatuur (RT) inbroed.
    6. Verwijder het secundaire antilichaam, de wasweefsel gedeelten met PBST-oplossing driemaal, gedurende 10 minuten per stuk, en spoel vervolgens met een schone PBS voor nog eens 5 minuten.
    7. Veeg de resterende PBS omringende weefsel secties af, Monteer de dekstroken op secties met afdekmedium. Voer fluorescerende microscopie uit om afbeeldingen te verkrijgen (Zie de tabel met materialen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De belangrijkste schedel botten bekeken vanuit verschillende perspectieven werden geïllustreerd in Figuur 1A-E, met kleuren die wijzen op verschillende botten. We gebruikten vier weken oud dier voor demonstratie van de dissectie processen. Na dissectie stappen 1.1.1-1.1.3 en een korte voor fixatie (stap 1.1.4), wordt de oogbol met bijbehorende gelaats beenderen gedemonstreerd in Figuur 1E. Verdere trimmen te verwijderen voorste (nasale en premaxillaire) en posterieure (bv, pariëtale) evenals ethmoïde botten gegenereerd weefsel blok met voornamelijk maxillaire en frontale botten bovenop de oogbol (Figuur 1F). Sequentiële verwijdering van deze beenderen volgens aangewezen gebieden in Figuur 1F blootgestelde onderliggende traan-en jukbeen beenderen evenals harderin klier (Figuur 1G). De Harderin klier bevestigd aan de oogbol diende als een mijlpaal (Figuur 1G), en moet worden gehouden op zijn plaats te allen tijde. Isolatie van de oogbol werd voltooid door het verwijderen van alle botten en omringende vetten en spierweefsels (Figuur 1H).

Na het insluiten van paraffine werd de oogbol verdeeld en H & E-gekleurd. Representatieve afbeeldingen worden weergegeven in afbeelding 2. De relatief intacte posities van de oogleden, het hoornvlies en het conjunctivale oppervlak werden in één deel gevisualiseerd (Figuur 2A), waarvan delen werden vergroot in Figuur 2B, C. De morfologie van het objectief is moeilijk te onderhouden (Figuur 2A) vanwege zijn stijfheid en kwetsbaarheid. We hebben deze dissectie methode toegepast op andere postnatale leeftijden en lieten een voorbeeld zien van H & E histologie van P10 oogbal sectie (Figuur 3). In het algemeen, hoe jonger de muis is, hoe beter de oogbol morfologie behouden blijft. Immuunbevlekte paraffine secties van de seriële postnatale leeftijd worden weergegeven in Figuur 4, met keratine 12 (K12) (Figuur 4A-F) en keratine 14 (K14) (Figuur 4G-L) kleuring van het hoornvlies en het hele OS epitheel, Respectievelijk.

Figure 1
Afbeelding 1: illustratie van de oogbal dissectie in 4 weken oude volwassen muis. (a-D) Het schematische diagram van de schedel samenstelling bekeken vanaf boven (A), onder (B), laterale (C) en middelste vlak (D), respectievelijk. Onderbroken lijnen in (A) en (B) duiden op niet-ingesneden vlakken. (E) bisge-halve schedel op 4-weekse ouderdom die exact overeenkomt met (D). F) mediale-Plane-weergave van ontleed weefsel tussen de twee dwarsvlakken in (D) en (E). De oogbol (onderbroken cirkel) was voornamelijk ingebed onder de frontale (Fron) en maxillaire (max). Gekleurde onderbroken lijnen verdelen geografisch het gebisde vlak in 4 gebieden, waarin botten grofweg werden verwijderd volgens de volgorde of getallen. Houd er rekening mee dat de holten (ETH) Bone is verwijderd. G) na verwijdering van frontaal bot en partiële maxillaire, werden harderin klier (HAR) en jukbeen (kruik) en traan (La) botten blootgesteld. Cirkel onderbroken lijnen geven de oogbal positie aan. (H) geïsoleerde oogbal bekeken van binnenuit nadat de sectie is beëindigd. Pijl wijst naar de oogzenuw (aan). E = oog, na = nasaal, pre = premaxilla, Max = Maxillair, La = traan, Fron = frontale, Ali = Alisphenoid, Jug = Jugal, PAL = paling, Ptery = Pterygoïde, Squ = Squamosal, par = pariëtale, ETH = ethmoïde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: H &Amp; E histologie van het oogoppervlak weefsel bij postnatale 4 weken oud. A) ooglid, conjunctiva en cornea worden gevisualiseerd in één weefsel sectie. Boxed gebieden van "b" en "c" werden respectievelijk vergroot in (B) en (C). B) het epitheel van het hoornvlies, het stroma en het endotheel. C) het bindvlies met de Goblet cellen. CE = hoornvlies epitheel, St = stroma, Ed = endotheel, GC = Goblet cel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: H &Amp; E histologie van het oogoppervlak weefsel op postnatale dag 10. A) intacte oogbol bij P10. Boxed gebieden van "b" en "c" werden respectievelijk vergroot in (B) en (C). B) het hoornvlies. C) het bindvlies. CE = hoornvlies epitheel, St = stroma, Ed = endotheel, CJ = conjunctiva. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: immunokleuring van het oogoppervlak van P5 tot P15. De vierkante vakken in elk paneel werden in hun recht vergroot. (a-F) Keratine 12 werd specifiek uitgedrukt in het hoornvlies epitheel (pijlen). (G-L) De keratine 14 uitgedrukt in het oogoppervlak. AC = voorste oogkamer, PC = palpebrale conjunctiva. Dit cijfer is gewijzigd van een eerdere publicatie Guo et al.14. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een kritische herinnering voor de voorbereiding van de intacte oogbol is dat alle orbitale botten volledig moeten worden verwijderd, vooral de juga-en traan beenderen, die klein zijn en zich in de buurt van de onderkant van de oogkas bevinden. Eventuele overgebleven beenderen kunnen de daaruit voortvloeiende histologie compliceren. In het geval dat een klein stukje bot niet per ongeluk volledig uit de sectie is verwijderd, kan het worden afgehaald uit het insluitings paraffine blok met behulp van een paar sharppincet. Na deze operatie moet het gat worden gevuld met gesmolten paraffine.

Extra voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van de lens. De gebroken stukjes lens zijn meestal verspreid door de hele sectie. Dit zal een aanzienlijke invloed hebben op microscopie onderzoek en beeldanalyse. Pogingen om lens te verwijderen schade ofwel het oogoppervlak (als de operatie werd uitgevoerd vanuit het gezicht kant) of het netvlies (als de operatie was van de optische schijf kant van het netvlies). Een alternatieve manier om de negatieve impact van de aanwezigheid van lens weefsel zonder dissectie te verminderen is om de snij richtingen te wijzigen. Bijvoorbeeld, om de morfologie van het oogoppervlak te sparen, moet het snijden van het paraffine blok worden uitgevoerd vanaf de anterieure oogbol naar het achterste, anders vanuit de tegenovergestelde richting.

Een nuttige opmerking voor de PFA-Fixed paraffine sectie is dat antigeen opvraging meestal nodig is voor immunokleuring zoals het gebruik van K12 en K14 antilichamen. Er zijn echter veel uitzonderingen dat antigeen-opvraging niet-specifieke signalen zou genereren die de achtergrondkleuring vergroten. Zo moet men voorzichtig zijn bij het gebruik van antigeen-ophaal technologie, en indien mogelijk van tevoren antilichamen in proef experimenten testen.

Over het algemeen zijn er twee methoden voor het isoleren van de oogbal uit de schedel/orbitale botten: (i) direct de oogbol uit gezichts zijde ontleden; en (II) Verwijder de binnenste schedel/orbitale botten om de oogbol vrij te maken. De uitdaging voor de eerste methode is dat oogbol diep in de orbitale socket zakt met een smalle ruimte tussendoor voor dissectie. Bovendien zou de beweegbare oogbal het bindvlies epitheel op een bepaald punt strekken wanneer de dissectie gereedschappen aanraken, het creëren van onbedoelde schade. Daarentegen begint de tweede methode met dissectie van schedel/orbitale botten, die verder van de oogbol en het bijbehorende oogoppervlak weefsel zijn, waardoor het risico op beschadiging van het bindvlies wordt verminderd. Bovendien zijn er geen ruimtelijke vernauwingen voor het uitvoeren van dissecties. Hoewel de eerste methode kan werken als er grote waarschuwingen zijn genomen, is de tweede zeker gemakkelijker en beter.

Samenvattend hebben we een methode beschreven voor het isoleren van de muis oogbol met intact ooglid en het bijbehorende oogoppervlak van de postnatale muizen. Het beschreven protocol is geschikt voor de isolatie van de oogbol met intact ooglid en de bijbehorende oculaire weefsels in postnatale muizen. Het protocol is vooral nuttig wanneer de integriteit van het besturingssysteem of volledige oculaire weefsels vereist is. We hebben deze methode gebruikt om weefselmonsters voor te bereiden voor onderzoek van keratine markers in OS onder normale en pathologische omstandigheden. We concluderen dat de oculaire weefsels van dergelijke preparaten bijzonder nuttig zijn om te kijken naar differentiële reguleringen van een eiwit in verschillende delen van het besturingssysteem op één sectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken prof. Rong Ju voor de kritische lezing van het manuscript en alle lableden voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Peking, China), het Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation project (201707020009; Guangzhou, provincie Guangdong, China), "100 people plan" van Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, provincie Guangdong, China), en onderzoek financiering van State Key laboratorium voor oogheelkunde in Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, provincie Guangdong, China).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech FG701-01
50ml centrifuge tube Corning 430829
Adhesive microscope slides Various
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:500 - 1,000
Alexa Fluor 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:500 - 1,000
Anti-K12 antibody Abcam ab124975 Suggested concentration 1:1,000
Anti-K14 antibody Abcam ab7800 Suggested concentration 1:800
Citric acid Various
Cover slide Various
Curved forceps World Precision Instruments 14127
Dissecting microscope. Olmpus SZ61
Ethyl alcohol Various
Fluorescent Microscope Zeiss AxioImager.Z2
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242
Microwave ovens Galanz P70D20TL-D4
Mouse strains C57/BL6 and Sv129 mixed
No.4 straight forceps World Precision Instruments 501978-6
Normal Goat Serum Various
Paraformaldehyde (PFA) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane
Tissue culture dish Various
Trisodium citrate Various
Triton X-100 Sigma-Aldrich SLBW6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
  2. Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
  3. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
  4. Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
  5. Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15, (4), 713-722 (2017).
  6. Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
  7. Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18, (2), 168-180 (2016).
  8. Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54, (3), 267-278 (1991).
  9. Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22, (17), 4443-4454 (2003).
  10. Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22, (12), 2992-3003 (2003).
  11. Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178, (5), 2058-2065 (2011).
  12. Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140, (3), 594-605 (2013).
  13. McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141, (23), 4628-4639 (2014).
  14. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).More

Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter