Isolierung von intaktem Augapfel zur Beschaffung von integralem Okularemoberflächengewebe für die histologische Untersuchung und Immunhistochemie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung des Mausauges mit Augenlid-, Augenoberfläche-, vorderen und hinteren Segmenten in relativ intakter Position.
Abstract
Die Augenoberfläche (OS) besteht aus einem Epithelblatt mit drei verbundenen Teilen: palpebrale Bindehaut, Bulbarkonjunktiviva und Hornhautepithel. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). In experimentellen Tiermodellen mit bestimmten genetischen Modifikationen oder künstlichen Operationen ist es sinnvoll, alle Teile des OS-Epithelblatts zu untersuchen, um relative pathogenetische Veränderungen jedes Teils parallel zu bewerten. Die Zerlegung des OS-Gewebes als Ganzes ohne Verzerrung oder Beschädigung war jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Weichheit und Dünnheit des Os, das an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln befestigt ist. Darüber hinaus ist die tiefe Augenhöhle, die durch die harten Schädel/Orbitalknochen gebildet wird, durch den Augapfel voll belegt, so dass nur begrenzter Platz für die Bedienung von Sezierungen bleibt. Als Ergebnis würde eine direkte Zerlegung des Augapfels mit zugehörigem OS-Gewebe von der Gesichtsseite oft zu Gewebeschäden führen, insbesondere der palpebralen und bulbaren Bindehaut. In diesem Protokoll beschrieben wir eine Methode, um den Schädel und die Orbitalknochen sequenziell von einem zerkularten Mauskopf zu entfernen, wobei Augenlider, Augenoberfläche, Linse und Netzhaut in einem Stück zusammengelassen werden. Die Integrität des OS-Blattes war gut erhalten und konnte durch Histologie oder Immunostainierung in einem einzigen Abschnitt untersucht werden.
Introduction
Die Augenoberfläche besteht aus einem kontinuierlichen Blatt regionalisiertes Epithel einschließlich palpebrale Bindehaut, Bulbar-Konjunktiva und Hornhaut1. Viele Drüsenstrukturen sind mit dem Augenoberflächenepithel assoziiert und erzeugen zusammen eine Schicht Tränenfolie, die die Hornhautoberfläche vor Trocknung und Umweltinvasionen schützt2. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltreizstoffe oder ihre Wechselwirkungen tragen zu pathologischen Veränderungen des OS3,4bei. Dementsprechend wurden eine Vielzahl von gentechnisch veränderten und physikalisch oder chemisch induzierten Tiermodellen zur Untersuchung von Krankheitsprozessen des menschlichen Betriebssystems verwendet.
Die Struktur und Funktion des Maus-OS ist ähnlich wie die des Menschen in vielerlei Hinsicht. Die von den Augendrüsen sezernierten Tränenfilmkomponenten ähneln auch bei Mäusen und Menschen. Eine Fülle von Studien wurde mit Mausmodellen zur Aufklärung von Mechanismen menschlicher OS-Erkrankungen5,6,7durchgeführt. In vielen Fällen ist es wichtig, globale statt lokale molekulare Veränderungen des Betriebssystems zu analysieren, um umfassende Informationen unter der gleichen experimentellen Behandlung zu erhalten. Daher ist eine Probenvorbereitung mit guter Integrität erforderlich, um sicherzustellen, dass jeder Teil des Betriebssystems gleichzeitig analysiert wird.
Das Mausbetriebssystem verbindet sich eng mit dem Augapfel, der in die Augenhöhle/Orbit eingebettet war (eine knöcherne Tasse aus mehreren verschiedenen Schädelknochen) und verbindet sich mit ihm durch dünnes Bindegewebe. Es gibt enorme Herausforderungen für die Sezieren der gesamten Augenoberfläche, ohne die palpebrale oder bulbar Konjunktiva zu beschädigen. Diese Herausforderungen gehen von: (i) das Betriebssystem ist weich und dünn und befestigt an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln, daher anfällig für Verzerrungen und Beschädigungen; und (ii) der begrenzte Abstand zwischen den Orbitalknochen und dem Augapfel die Seziervorgänge einschränken. Die Herausforderungen sind viel größer für die erwachsene Maus. In der embryonalen Maus ist die Orbitalknochenverknösung nicht vollständig und das umgebende Gewebe ist relativ locker8. Der Kopf kann entfernt und zerlegt werden und dann direkt paraformaldehyd (PFA) Fixierung und Einbettungausgesetzt 9. Im Gegensatz dazu sind die postnatalen und erwachsenen Maus-Orbitalknochen vollständig mit dicken umgebenden Geweben verknözt, was das Eindringen von Fixativen weniger effizient macht. Darüber hinaus sind die Orbital-/Schädelknochen hart und spröde, leicht gebrochen, wenn sie in die weichen Einbettverbindungen wie Paraffin geschnitten werden. Die gebrochenen Knochenstücke reißen einstimmig die nahegelegenen Gewebe, was zu einer minderwertigen Gewebemorphologie führt.
Viele veröffentlichte Studien zeigten oft partielle Augenoberfläche, die für ihre speziellen Forschungszwecke ausreichen kann10,11. Eine grobe Untersuchung der Literatur ergab nur wenige Studien, die zeigten, dass die gesamte intakte Augenoberfläche ohne detaillierte Beschreibung der Sezierprotokolle12,13nachgewiesen wurde. In diesem Protokoll haben wir eine Seziermethode beschrieben, um eine integrierte postnatale Augenoberfläche zu erhalten, bei der Orbital- und Schädelknochen geordnet entfernt wurden, wobei die unberührte Augenoberfläche zusammen mit dem Augapfel und den Augenlidern zurückbleibt, wodurch die körperlichen Schäden minimiert werden. Wir untersuchten die OS-Histologie und führten die Immunhistochemie mit den mit diesem Protokoll hergestellten Gewebeabschnitten durch.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine wichtige Erinnerung für die Vorbereitung des intakten Augapfels ist, dass alle Orbitalknochen vollständig entfernt werden müssen, insbesondere die Juga- und Tränenknochen, die klein sind und sich in der Nähe der Unterseite der Augenhöhle befinden. Alle übrig gebliebenen Knochen können die anschließende Histologie erschweren. Falls ein winziges Stück Knochen nicht versehentlich vollständig aus der Zerlegung entfernt wurde, kann es aus dem Einbettungsparaffinblock mit einem Paar Scharfmacher herausgenommen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Prof. Rong Ju für die kritische Lektüre des Manuskripts und allen Labormitgliedern für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, China), das Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, Provinz Guangdong, China), “100 People Plan” von der Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, Provinz Guangdong, China) und Forschungsgelder vom State Key Laboratory of Ophthalmology am Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, Provinz Guangdong, China).
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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