Isolamento di Intact EyeBall per ottenere tessuto di superficie oculare integrale per l'esame istologico e l'immunoistochimica
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per l’isolamento della bulbo oculare del topo con palpebra, superficie oculare, segmenti anteriori e posteriori in posizione relativamente intatta.
Abstract
La superficie oculare (OS) è costituita da un foglio epiteliale con tre parti collegate: palpebrale conjunctiva, bulbar conjunctiva ed epitelio corneale. L’interruzione dell’OS porterebbe a cheratite, congiuntivite o entrambi (keratoconjunctiviti). Nei modelli animali sperimentali con determinate modifiche genetiche o operazioni artificiali, è utile esaminare tutte le parti del foglio epiteliale dell’OS per valutare i cambiamenti patogenetici relativi di ogni parte in parallelo. Tuttavia, la dissezione del tessuto OS nel suo complesso senza distorsioni o danni è stata difficile, principalmente a causa della morbidezza e della magrezza dell’OS apposte per separare fisicamente le palpebre e il bulbo oculare. Inoltre, la presa oculare profonda formata dal cranio duro / ossa orbitali è completamente occupata dal bulbo oculare lasciando uno spazio limitato per le dissezioni operative. Di conseguenza, la dissezione diretta del bulbo oculare con tessuti OS associati dal lato facciale spesso porterebbe a danni ai tessuti, in particolare la conjunctiva palpebral e bulbar. In questo protocollo, abbiamo descritto un metodo per rimuovere il cranio e le ossa orbitali in sequenza da una testa di topo sezionato, lasciando palpebre, superficie oculare, lente e retina del tutto in un unico pezzo. L’integrità del foglio OS era ben preservata e poteva essere esaminata dall’istologia o dall’immunostaining in un’unica sezione.
Introduction
La superficie oculare è costituita da un foglio continuo di epitelio regionalizzato tra cui palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva e cornea1. Molte strutture ghiandolari sono associate all’epitelio superficiale oculare e insieme generano uno strato di pellicola di strappo che protegge la superficie della cornea dall’essiccazione e dalle invasioni ambientali2. L’interruzione dell’OS porterebbe a cheratite, congiuntivite o entrambi (keratoconjunctiviti). Sia i fattori genetici che gli irritanti ambientali o le loro interazioni contribuiscono ad alterazioni patologiche dell’OS3,4. Di conseguenza, una varietà di modelli animali geneticamente-ingegnerizzati e fisicamente o chimicamente indotti sono stati utilizzati per studiare i processi di malattia del sistema operativo umano.
La struttura e la funzione del sistema operativo del topo è simile a quella degli esseri umani in molti modi. Anche i componenti della pellicola lacrimale secreti dalle ghiandole oculari sono simili tra i topi e gli esseri umani. Una ricchezza di studi è stata condotta utilizzando modelli murini per chiarire i meccanismi delle malattie del sistema operativo umano5,6,7. In molte occasioni, è fondamentale analizzare i cambiamenti molecolari globali invece che locali del sistema operativo per ottenere informazioni complete sotto lo stesso trattamento sperimentale. Pertanto, la preparazione del campione con buona integrità è necessaria per garantire che ogni parte del sistema operativo venga analizzata contemporaneamente.
Il mouse OS si associa strettamente con il bulbo oculare che è stato incorporato nella presa oculare / orbita (una tazza ossea fatta di diverse ossa del cranio) e si connette ad esso attraverso sottili tessuti connettivi. Esistono enormi sfide per sezionare l’intera superficie oculare senza danneggiare il palpebrale o bulbar conjunctiva. Queste sfide discendono da: (i) il sistema operativo è morbido e sottile e apposto per separare fisicamente le palpebre e il bulbo oculare mobili, quindi vulnerabile per distorsioni e danni; e (ii) lo spazio limitato tra le ossa orbitali e il bulbo oculare limitano le operazioni di dissezione. Le sfide sono molto più grandi per il topo adulto. Nel topo embrionale, l’ossificazione ossea orbitale non è completa e i tessuti circostanti sono relativamente sciolti8. La testa può essere rimossa e sezionato, e poi direttamente soggetta alla fissazione della paraformaldeide (PFA) e all’incorporamento9. Al contrario, le ossa orbitali postnatali e adulte del topo sono completamente ossificate con tessuti circostanti spessi, rendendo meno efficiente la penetrazione dei fissativi. Inoltre, le ossa orbitali/teschie sono dure e fragili, facilmente spezzate quando le seziono nei composti di incorporamento morbido come la paraffina. I pezzi rotti di ossa strapperanno all’unanimità i tessuti vicini con conseguente morfologia dei tessuti inferiori.
Molti studi pubblicati spesso hanno mostrato una superficie oculare parziale, che può essere sufficiente per i loro particolari scopi di ricerca10,11. Un esame grossolano della letteratura ha trovato solo pochi studi che mostrano l’intera superficie oculare intatta dimostrata senza una descrizione dettagliata dei protocolli di dissezione12,13. In questo protocollo, abbiamo dettagliato un metodo di dissezione per ottenere la superficie oculare postnatale integrale, in cui le ossa orbitali e crane sono state rimosse ordinatamente, lasciando una superficie oculare intatta insieme al bulbo oculare e alle palpebre, riducendo al minimo i danni fisici. Abbiamo esaminato ulteriormente l’istologia dell’OS ed eseguito l’immunoistochimica usando le sezioni tissutali preparate con questo protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un promemoria fondamentale per la preparazione del bulbo oculare intatto è che tutte le ossa orbitali devono essere rimosse completamente, in particolare le ossa di juga e lacrimali, che sono piccole e si trovano vicino alla parte inferiore della orbita oculare. Qualsiasi osso residale può complicare l’istologia che ne deriva. Nel caso in cui un piccolo pezzo di osso non sia stato completamente rimosso dalla dissezione per caso, può essere prelevato dal blocco di paraffina incorporante utilizzando un paio di sharptwee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il professor Rong Ju per la lettura critica del manoscritto e tutti i membri del laboratorio per l’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Pechino, Cina), il progetto di innovazione di Guangzhou City Sciences and Technologies (201707020009; Guangzhou, Provincia del Guangdong, Cina), “Piano 100 Persone” dell’Università Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, Provincia del Guangdong, Cina), e finanziamenti per la ricerca dal Laboratorio Chiave dello Stato di Oftalmologia presso il Centro Oftalmicico di Hongshan (303060202400339; Guangzhou, Provincia del Guangdong, Cina).
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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