Isolering av intakt øyeeplet å få Integral øye Surface tissue for histologiske eksamen og immunhistokjemi
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for isolering av musen øyeeplet med øyelokk, øye overflate, fremre og bakre segmenter i relativt intakt posisjon.
Abstract
Øyeoverflaten (OS) består av et epitel ark med tre sammenkoblede deler: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva og hornhinne epitel. Forstyrrelse av OS ville føre til keratitt, konjunktivitt eller begge (Keratokonjunktivitt). I eksperimentelle dyremodeller med visse genetiske modifikasjoner eller kunstige operasjoner, er det nyttig å undersøke alle deler av OS epitel arket for å evaluere relative pathogenetic endringer av hver del parallelt. Men Disseksjon av OS vev som helhet uten forvrengning eller skade har vært utfordrende, først og fremst på grunn av mykhet og tynnhet av OS festet til fysisk separate ennå bevegelige øyelokk og øyeeplet. I tillegg er det dype øyet socket dannet av den harde skallen/orbital bein fullt okkupert av øyeeplet forlate begrenset plass for drift dissections. Som et resultat, direkte Disseksjon av øyeeplet med tilhørende OS vev fra Facial side vil ofte føre til vevskader, spesielt palpebral og bulbar conjunctiva. I denne protokollen, beskrev vi en metode for å fjerne skallen og orbital bein sekvensielt fra en delt mus hodet, forlater øyelokkene, øye overflate, linse og Retina helt i ett stykke. Integriteten til OS-arket ble godt bevart og kan undersøkes ved histologi eller immunostaining i en enkelt seksjon.
Introduction
Øye flaten består av et sammenhengende ark med regionene epitel, inkludert palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva og hornhinne1. Mange kjertel strukturer er forbundet med øye overflate epitel og sammen generere et lag av tåre film beskytte hornhinnen overflaten fra tørking og miljømessige invasjoner2. Forstyrrelse av OS ville føre til keratitt, konjunktivitt eller begge (Keratokonjunktivitt). Både genetiske faktorer og miljømessige irriterende eller deres interaksjoner bidra til patologiske forandringer i OS3,4. Følgelig har en rekke genetisk konstruerte og fysisk eller kjemisk induserte dyremodeller blitt brukt til å studere sykdoms prosesser i det menneskelige operativsystemet.
Strukturen og funksjon av musen OS er lik som mennesker på mange måter. Tåre film komponentene som skilles ut av øye kjertlene er også like mellom mus og mennesker. Et vell av studier har vært gjennomført ved hjelp av musen modeller for Elucidating mekanismer av menneskelig OS sykdommer5,6,7. I mange tilfeller er det avgjørende å analysere global i stedet for lokale molekylære endringer av OS for å få omfattende informasjon under samme eksperimentelle behandling. Derfor er prøve forberedelser med god integritet nødvendig for å sikre at hver del av operativsystemet analyseres samtidig.
Musa OS tett forbinder med øyeeplet som var innebygd i øyet socket/bane (en bein kopp laget av flere forskjellige skallen bein) og kobles til det gjennom tynne bindevev. Det finnes enorme utfordringer for å dissekere hele øye flaten uten å skade palpebral eller bulbar conjunctiva. Disse utfordringene stige ned fra: (i) OS er myk og tynn og festet til fysisk separate ennå bevegelige øyelokk og øyeeplet, derfor sårbare for forvrengning og skade; og (II) den begrensede plassen mellom orbital bein og øyeeplet begrense disseksjon operasjoner. Utfordringene er mye større for den voksne musen. I den embryonale musen er orbital benet forbening ikke komplett og omkringliggende vev er relative løs8. Hodet kan fjernes og delt, og deretter direkte utsatt for paraformaldehyde (PFA) fiksering og innebygging9. I motsetning til postnatal og voksen mus orbital bein er fullt ossified med tykke omkringliggende vev, noe som gjør inntrengning av fiksativene mindre effektiv. Videre er orbital/Skull Bones harde og sprø, lett ødelagt når skjære dem i myke embedding forbindelser som parafin. Den ødelagte stykker av bein vil enstemmig rive den nærliggende vev som resulterer i dårligere vev morfologi.
Mange publiserte studier viste ofte delvis øye overflate, noe som kan være tilstrekkelig for deres spesielle forskningsformål10,11. En grov undersøkelse av litteratur funnet bare noen studier som viser hele intakt øyeoverflaten blir demonstrert uten detaljert beskrivelse av disseksjon protokoller12,13. I denne protokollen, vi detaljert en disseksjon metode for å få integrert postnatal øye overflate, der orbital og skallen bein ble ryddig fjernet, etterlot urørt øye overflate sammen med øyeeplet og øyelokkene, minimere fysiske skader. Vi undersøkte videre OS-histologi og utførte immunhistokjemi ved hjelp av vevs delene som er klargjort med denne protokollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk påminnelse for utarbeidelse av intakt øyeeplet er at alle orbital bein må fjernes helt, spesielt juga og lacrimal bein, som er små og ligger nær bunnen av øyet socket. Eventuelle venstre-over bein kan komplisere den påfølgende histologi. I tilfelle et lite stykke bein ble ikke helt fjernet fra disseksjon ved et uhell, kan det plukkes ut fra innebygging para fin blokken ved hjelp av et par sharptweezers. Hullet igjen skal fylles med smeltet parafin etter denne operasjonen.
De…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Prof. Rong Ju for kritisk lesning av manuskriptet, og alle Lab medlemmer for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (NSFC: 31571077; Beijing, Kina), Guangzhou City Sciences og Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, Guangdong provinsen, Kina), “100 People plan” fra Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina), og forskningsmidler fra State Key laboratorium av Oftalmologi ved Zhongshan øye Senter (303060202400339; Guangzhou, Guangdong-provinsen i Kina).
Materials
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 – 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
