Summary
इस पांडुलिपि ओजोन के संपर्क में, एक मापदंड वायु प्रदूषक के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, विवो में कूपिका मैक्रोफेज efferocysis ख़राब करता है। इस प्रोटोकॉल आमतौर पर इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और तकनीकों का इस्तेमाल करता है और alveolar मैक्रोफेज efferocytosis पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए फुफ्फुसीय चोट के कई मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
ओजोन(ओ3) एक मापदंड वायु प्रदूषक है जो क्रोनिक फुफ्फुसीय रोगों की घटनाओं को बढ़ाता है और बढ़ाता है। हे3 जोखिम फुफ्फुसीय सूजन प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, लेकिन थोड़ा कैसे जोखिम सूजन के संकल्प के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को बदल के बारे में जाना जाता है। एफेरोसाइटोसिस एक संकल्प प्रक्रिया है, जिसके द्वारा मैक्रोफेज फागोसाइटाइज़ एपोप्टोटिक कोशिकाओं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ओ3प्रेरित फेफड़ों की चोट और सूजन के बाद कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis को मापने के लिए है। efferocytosis को मापने के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है; हालांकि, सबसे पूर्व vivo जोड़तोड़ की आवश्यकता है. यहाँ विस्तार से वर्णित एक प्रोटोकॉल है vivo alveolar मैक्रोफेज efferocytosis में मापने के लिए 24 एच के बाद हे3 जोखिम है, जो मैक्रोफेज के पूर्व vivo हेरफेर से बचा जाता है और एक सरल तकनीक है कि सही में perturbations का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है इस समाधान प्रक्रिया. प्रोटोकॉल एक तकनीकी रूप से गैर गहन और अपेक्षाकृत सस्ती विधि है कि पूरे शरीर ओ3 साँस लेना apoptotic कोशिकाओं के oropharyngeal आकांक्षा द्वारा पीछा शामिल है (यानी, Jurkat टी कोशिकाओं) जबकि सामान्य संज्ञाहरण के तहत. अल्वेलर मैक्रोफेज efferocytosis तो ब्रोंकोएल्वेलर (BAL) lavage से एकत्र मैक्रोफेज के प्रकाश माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन द्वारा मापा जाता है। Efferocytosis अंत में एक efferocytic सूचकांक की गणना करके मापा जाता है. सामूहिक रूप से, उल्लिखित तरीकों vivo में फेफड़ों में efferocytic गतिविधि मात्रा जबकि भी O3 या अन्य साँस अपमान के नकारात्मक स्वास्थ्य प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए सेवारत.
Introduction
फेफड़े लगातार पर्यावरण के अपमान के संपर्क में है, हवा कण, वायरस, बैक्टीरिया, और ऑक्सीडेंट गैसों है कि फुफ्फुसीय सूजन1,2,3ट्रिगर सहित . ये अपमान गैस विनिमय समझौता कर सकते हैं और अपरिवर्तनीय ऊतक चोट4,5प्रेरित कर सकते हैं . Alveolar मैक्रोफेज, जो लगभग 95% प्रतिरक्षा कोशिकाओं का गठन murine और homeostasis में मानव फेफड़ों में पाया, पर्यावरण अपमान के बाद फुफ्फुसीय सूजन के महत्वपूर्ण नियामकों रहे हैं1,2, 3,4,5. अल्वेओलर मैक्रोफेज पोजासाइटीकरण और रोगजनकों को नष्ट करके मेजबान रक्षा के दौरान आवश्यक हैं। हाल ही में, कूपिका मैक्रोफेज को ऊतक होमोस्टेसिस को बढ़ावा देने और efferocytosis6,7के माध्यम से सूजन के संकल्प को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है । एफेरोसाइटोसिस एक फागोसाइटिक प्रक्रिया है जिसमें मैक्रोफेज व्याप्त होते हैं और एपोप्टोटिक कोशिकाओं को समाप्त कर देते हैं8,9,10. Efferocytosis भी मध्यस्थों के उत्पादन में परिणाम (यानी, आईएल-10, TGF-जेड, पीजीई2, और नाइट्रिक ऑक्साइड) कि आगे की प्रक्रिया में वृद्धि, सूजन के संकल्प में जिसके परिणामस्वरूप9,10,11 ,12,16,18. यह प्रक्रिया द्वितीयक नेक्रोसिस को रोकने और ऊतक होमेंटासिस12,13,14को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक है . कई अध्ययनों से अस्थमा, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज और अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस8,9,15सहित विभिन्न पुरानी फेफड़ों की बीमारियों के साथ बिगड़ा efferocytosis जुड़ा हुआ है, 16,17.
हे3 एक मापदंड वायु प्रदूषक है जो पुरानी फुफ्फुसीय रोगों की घटनाओं को बढ़ाता है और19,20,21को बढ़ाता है . हे3 फुफ्फुसीय सूजन और चोट पैदा करता है और जीवाणु रोगजनकों के अल्वेलर मैक्रोफेज फागोसाइटोसिस को बाधित करने के लिए जाना जाता है22,23. तथापि, यह अज्ञात है कि क्या हे3 कूपक प्रोसेरोसाइटोसिस को बाधित करता है। जांच हे3-प्रेरित कूपिका efferocytosis में परिवर्तन कैसे जोखिम पुरानी फुफ्फुसीय रोग घटना और उत्तेजना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं में संभावित अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा. नीचे वर्णित तीव्र ओ3 जोखिम के बाद मादा चूहों के फेफड़ों में कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल तरीका है।
रेखांकित विधि आमतौर पर महंगा फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग को नष्ट करने से क्षेत्र में इस्तेमाल किया अन्य efferocytosis प्रोटोकॉल पर कई फायदे posseses, व्यापक प्रवाह साइटोमेट्री माप, और कूपिका मैक्रोफेज के पूर्व vivo हेरफेर24 ,25. इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल फेफड़ों के सूक्ष्म पर्यावरण के संदर्भ में कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis को मापता है, जो मैक्रोफेज फ़ंक्शन को प्रभावित कर सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी तरीकों को पूर्वी कैरोलिना विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. ओजोन(ओ3) और फ़िल्टर्ड हवा जोखिम (दिन 1)
- एक स्टील पिंजरे में 12 महिला C57BL/6J चूहों, 8-12 सप्ताह पुराने की एक अधिकतम प्लेस (12 अलग डिब्बों के साथ) एक ओ3 जोखिम कक्ष में तार जाल lids के साथ.
- तापमान और आर्द्रता को सही ढंग से रिकॉर्ड करने के लिए पिंजरे के साथ जोखिम कक्ष में थर्मामीटर रखें।
- उपकरण से जुड़ी ऑक्सीजन और पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश को चालू करें।
नोट: नियंत्रित तापमान (22-23 डिग्री सेल्सियस) और सापेक्ष आर्द्रता (45%-50%) के साथ विनियमित airflow (gt; 30 वायु परिवर्तन/ हे3 उपकरण द्वारा प्राप्त किया जाता है। हे3 एक यूवी प्रकाश जनरेटर के माध्यम से 100% ऑक्सीजन निर्देशन द्वारा जोखिम कक्ष में प्रणाली द्वारा उत्पन्न होता है, तो एक फ़िल्टर्ड हवा की आपूर्ति के साथ मिश्रण. - 1 पीपीएम के लिए हे3 एकाग्रता समायोजित करें और नियमित रूप से रिकॉर्ड ओ3 स्तर हर 10 मिनट के लिए 3 ज. लगातार तापमान और कक्ष हवा की आर्द्रता की निगरानी, के रूप में एक यूवी प्रकाश photometer के साथ हे3 एकाग्रता है।
नोट: फ़िल्टर हवा जोखिम एक समान उपकरण में प्रदर्शन कर रहे हैं, केवल एक फ़िल्टर हवा जोखिम कक्ष के माध्यम से बह आपूर्ति के साथ. - जानवरों को बिस्तर, भोजन, और पानी के विज्ञापन libitum के साथ उनके संबंधित पिंजरों के लिए वापस ओ3के 3 एच के बाद /
2. Jurkat टी सेल लाइन की तैयारी (दिन 2)
नोट: सभी प्रक्रियाओं एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए.
- 24 एमएल बेसल सेल कल्चर मीडियम में कल्चर ज्यूरकट टी सेल + 10% एफबीएस + 5% पेनिसिलिन/ Jurkat टी कोशिकाओं को एक निलंबन सेल लाइन है कि passaging के माध्यम से बनाए रखा जा सकता है 1:6-1:8 पूर्व गर्म culturing मीडिया में हर 3 दिन. हिलाओ मत।
- apoptotic कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, उन्हें प्रत्येक फ्लास्क में 90% संगम के लिए बढ़ने (जो 3-4 दिन लगते हैं passaging के बाद प्राप्त करने के लिए). इस अध्ययन के लिए, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पांच T75 फ्लास्क से कोशिकाओं का उपयोग करें।
नोट: एक confluent फ्लास्क के बारे में 20-24 लाख कोशिकाओं में शामिल हैं. - प्रत्येक फ्लास्क (लगभग 24 एमएल) से कोशिकाओं (जो पूरे फ्लास्क है) को पिपेट अप करें और कोशिकाओं को एक सेरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके एक बाँझ 50 एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें। कई फ्लास्क के लिए कई शंकु ट्यूबों का प्रयोग करें।
- 50 एमएल शंकु नली से कोशिकाओं के 11 डिग्री एल एलिकोट को हटाकर कोशिकाओं की गणना करें और हेमोसाइटोमीटर स्लाइडों पर ट्रिपन नीले दाग और पिपेट 11 डिग्री सेल्सियस के साथ मिश्रण करें।
- किसी स्वचालित सेल काउंटर में स्लाइड सम्मिलित करें और प्रत्येक फ्लास्क में कुल सेल काउंट की गणना करने के लिए लाइव सेल की संख्या को 24 से गुणा करके लाइव सेल की संख्या रिकॉर्ड करें, क्योंकि प्रत्येक फ्लास्क में मीडिया का 24 एमएल है।
- गोली कोशिकाओं के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 271 x ग्राम पर सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज।
- आकांक्षा द्वारा महादलित को त्यागें और मीडिया में कोशिका गोली को पुनः निलंबित करें ताकि प्रति एमएल 3.0 x 106 कोशिकाएं प्राप्त की जा सकीं।
- 100 मिमी x 20 मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन में कोशिकाओं के 5 एमएल (लगभग नौ व्यंजन का उपयोग किया जाएगा; प्रत्येक डिश में कोशिकाओं की कुल राशि $ 15 x 106) होना चाहिए।
- नियंत्रण के लिए एक डिश का प्रयोग करें / unexposed, और शेष व्यंजन यूवी को उजागर किया जाएगा.
- यूवी crosslinker सही ऊर्जा के स्तर पर सेट करें, ऊर्जा बटन दबाएँ, और दर्ज करें "600" संख्या पैड का उपयोग कर, जो मशीन के रूप में पढ़ा जाएगा 600 $J/cm2 x 100.
नोट: यूवी crosslinker ऊर्जा इकाइयों में है $J/cm2 x 100; इसलिए, प्राप्त करने के लिए 60 millizoules /cm2, यूवी crosslinker मैच के लिए इकाइयों को परिवर्तित. - यूवी crosslinkerका उपयोग कर 60 millizoules (mJ)/ यूवी जोखिम के दौरान ऊतक संस्कृति व्यंजनों के शीर्ष कवर निकालें, क्योंकि यूवी प्रकाश प्लास्टिक कवर में प्रवेश नहीं करेगा।
- एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में सभी व्यंजन इनक्यूबेट करें, जिसमें unexposed नियंत्रण शामिल है, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के लिए 4 एच.
- एक apoptosis परख का पता लगाने किट जिसमें annexin वी और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) (apoptosis और नेक्रोसिस के लिए मार्कर, क्रमशः) का उपयोग कर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा apoptosis की पुष्टि करें 4 ज ऊष्मायन के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार26, 27.
नोट: यूवी crosslinker में Jurkat टी कोशिकाओं को 600 डिग्री सेल्सियस2की ऊर्जा के स्तर पर, एक 4 एच ऊष्मायन के बाद apoptotic के 75% (दोनों जल्दी और देर से) कोशिकाओं को देर से apoptotic phenotype होने के लिए नेतृत्व करेंगे. इससे वायुजीवी मैक्रोफेज को पहचानना और उन्हें निगलना आसान हो जाता है क्योंकि उनकी झिल्ली समझौता नहीं करती हैं, देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं के विपरीत, इस अध्ययन में एक उच्च efferocytic सूचकांक और अधिक सटीक इमेजिंग के लिए अग्रणी है।- पूल 333 जेडएल (1 x 106 कोशिकाओं) Jurkat टी कोशिकाओं के कई व्यंजन से (दोनों "कोई यूवी" और "यूवी उजागर") एक साथ मुआवजा विश्लेषण ट्यूबों के लिए उपयोग करने के लिए.
- एक बेदाग, annexin वी एकल दाग, पीआई एकल दाग, कोई यूवी नियंत्रण, और 600 $J/cm2 यूवी उजागर लेबल प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में Jurkat टी कोशिकाओं के 333 $L।
- आरटी में 5 मिनट के लिए 188 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सुपरनेंट को कम करें।
- ठंड के 500 डिग्री एल, 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में resssinsing द्वारा कोशिकाओं को धो लें।
- सेंट्रीफ्यूज और गोली कोशिकाओं पर 188 x ग्राम के लिए 5 मिनट RT. centrifugation के बाद supernatant छोड़ दें.
- आसुत जल के साथ 10x बाइंडिंग बफर बफर को कम करके 1x बाइंडिंग बफर प्रति प्रवाह ट्यूब के 400 डिग्री एल तैयार कीजिए जबकि कोशिकाएं अपकेंद्रण होती हैं।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एनेक्सिन वी और पीआई ऊष्मायन अभिकर्मक (100 डिग्री सेल्सियस प्रति नमूना/ट्यूब) तैयार करें।
- अपकेंद्रण के बाद सुपरनेंट को रद्द करें और धीरे से सभी ट्यूबों को 400 डिग्री एल में 1x बाइंडिंग बफर में पुन: निलंबित करें, फिर प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए एनेक्सिन वी ऊष्मायन अभिकर्मक के 100 $L जोड़ें। अंत में, उनके संबंधित ट्यूबों के लिए annexin वी एकल दाग और पीआई एकल दाग के 100 डिग्री एल जोड़ें, लेकिन unstained ट्यूब के लिए 1x बाध्यकारी बफर से परे कुछ भी नहीं जोड़ें.
- आरटी में 15 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट ट्यूब।
- आरटी और decant supernatant पर 5 मिनट के लिए 188 x ग्राम पर सभी कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज।
- 1x बाइंडिंग बफर के 400 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, फिर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एपोप्टोसिस के लिए नमूनों का विश्लेषण करें। धुंधला का सही प्रतिनिधित्व की अनुमति देने के लिए ट्यूब प्रति कम से कम 10,000 घटनाओं लीजिए।
- व्यंजन से सभी विकिरणित कोशिकाओं को आरटी में 5 मिनट के लिए 271 x ग्राम पर centrifugation द्वारा एक 50 एमएल शंकु ट्यूब और गोली कोशिकाओं में गठबंधन.
- अधिनातंक को आकांक्षा द्वारा ट्यूब से त्यागें और कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए 271 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा बाँझ फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) और गोली कोशिकाओं के 24 एमएल में कोशिकाओं को फिर से चालू करें।
- आकांक्षा द्वारा ट्यूब से supernatant छोड़ें और IACUC द्वारा अनुमोदित चूहों dosing के लिए इस्तेमाल किया पीबीएस की मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित. उपयोग की गई खुराक 5-10 x 106 कोशिकाओं/50 $L प्रति माउस के बीच है; इसलिए, 10 चूहों के लिए, 500 डिग्री सेल्सियस में पुन: निलंबित (प्रत्येक खुराक में कोशिकाओं की संख्या विकिरण के लिए सुसंस्कृत हैं कि कितने कोशिकाओं के आधार पर भिन्न होता है)
नोट: मेकअप कम से कम दो अतिरिक्त खुराक किसी भी तरल है कि कोशिकाओं के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप पिपेट टिप के पक्षों के लिए छड़ी कर सकते हैं के लिए खाते में.
3. अपोटोटिक कोशिकाओं की मौरीन ओरोफैरिनल इन्स्टिट्यूल (दिन 2)
- प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए चूहों एनेस्थेटाइज़ करने से पहले एक P200 पिपेट का उपयोग कर apoptotic कोशिकाओं के inoculum dosing तैयार करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार, सर्वोत्तम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए ओरोग्रसनी (ओ.पी.) के लिए लगभग 5-10 x 106 कोशिकाओं वाले 50 जेडएल की मात्रा का उपयोग किया जाता है।
- 1 L/min की प्रवाह दर पर या संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार 2% isoflurane के साथ एक स्पष्ट कक्ष में चूहों anesthetize. एक समय में एक से दो चूहों एनेस्थेटाइज़ करें; संख्या प्रयोगकर्ता के आराम स्तर से निर्धारित होती है. श्वास पैटर्न का निरीक्षण करें और पुष्टि करें कि गहरी साँसें सांसों के बीच 2-3 एस गणना के साथ दिखाई देती हैं। टो प्रति अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई के लिए जाँच करें.
- माउस को अर्ध-पुन: प्राप्त सुपाच्य स्थिति में रखें। जंभिका छेदक द्वारा निलंबित करने के लिए एक तिरछा एक्रिलिक शीट बोर्ड पर खूंटे के बीच बंधे सर्जिकल स्ट्रिंग का उपयोग करें।
- कुंद गैर-रिजेड संद बलप्स की एक जोड़ी का उपयोग करना, हल्के से हड़पने के लिए और माउस जीभ खींच. एक P200 पिपेट के साथ मौखिक गुहा में apoptotic कोशिकाओं को पैदा करना. खुराक सफल होता है जब चूहों खुराक देने के बाद एक crackling शोर 1-2 s बनाते हैं.
नोट: apoptotic सेल पैदा करने से पहले या तो जीभ या oropharynx करने के लिए आघात inducing से बचने के लिए ध्यान रखना. - एक दस्ताने उंगली के साथ, धीरे नाक ब्लॉक जब तक माउस साँस लेता है, जबकि जीभ वापस आ गया है. नाक को तब तक कवर करें जब तक कि मौखिक गुहा में कोई तरल दिखाई न दे और माउस ने दो या अधिक साँस ली है।
नोट: के रूप में चूहों नाक breathers अनिवार्य हैं, नाक को कवर सुनिश्चित करने में मदद करता है कि माउस फेफड़ों में apoptotic कोशिकाओं श्वास होगा. - टीका बोर्ड से माउस निकालें और संज्ञाहरण से वसूली की अनुमति देने के लिए पिंजरे में वापस. रेवोवेरी के दौरान नारस को अवरुद्ध करने से बिस्तर या मलबे को रोकने के लिए माउस को अपनी पीठ पर रखें।
- चूहे संज्ञाहरण से ठीक होने के बाद 90 मिनट प्रतीक्षा करें, जब सभी चूहों को संज्ञाहरण से बचने के बाद एपोटोटिक कोशिकाओं की आमद को घेरने के लिए एवियोलर मैक्रोफेज की अनुमति दी जा सके। आमतौर पर, संज्ञाहरण के बाद जागृति 1-2 मिनट ले जाएगा, जो परिणाम को प्रभावित नहीं करना चाहिए /
4. Bronchoalveolar lavage तरल पदार्थ संग्रह और प्रसंस्करण (दिन 2)
- संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रत्येक माउस euthanize 90 मिनट के बाद माउस apoptotic कोशिकाओं के साथ dosing से संज्ञाहरण से जाग गया है. यहाँ, केटामाइन और जाइलज़ीन के घातक इंजेक्शन का उपयोग किया जाता है (90 मिलीग्राम/किलोग्राम और 10 मिलीग्राम/किलोग्राम, क्रमशः) डायाफ्राम को बाहर निकालकर।
नोट: इस समय बिंदु कूपिका मैक्रोफेज के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है भावना और apoptototic कोशिकाओं को निगल38. - सभी चूहों (छ) को पैमाने पर वजन और रिकॉर्ड भार। BAL मात्रा (26.25 एमएल/किलोग्राम शरीर के वजन) की गणना करने के लिए शरीर के वजन का उपयोग करें।
- उनकी पीठ पर चूहों प्लेस और छाती और गर्दन क्षेत्र बाँझ करने के लिए 70% इथेनॉल स्प्रे.
- सर्जिकल कैंची के साथ पूरे अधर पक्ष के साथ स्टर्नम के ठीक नीचे एक 2 "अनुदैर्घ्य कटौती करें, और संदंश के साथ स्टर्नम पकड़े हुए, डायाफ्राम को निक करें ताकि फेफड़ों को छाती गुहा में वापस गिरने की अनुमति मिल सके।
- रिब पिंजरे के किनारों के साथ बाद में कट करें ताकि फेफड़ों को अधिक कमरे का विस्तार करने की अनुमति मिल सके, फिर छाती गुहा को संदों के साथ वापस मोड़ दें।
- श्वासनली को बेनकाब करने के लिए गर्दन के माध्यम से vasculature के साथ एक 1 "वर्टिकल कट करें।
- श्वासनली से मांसपेशियों और ऊतक खींचने और इसे बेनकाब करने के लिए दो संदंश का उपयोग करें। अतिरिक्त संभावित रक्तस्राव से बचें और श्वासनली को काटने से बचें, क्योंकि यह वास्कुलेचर, अनुदैर्घ्य मांसपेशियों, और संयोजी ऊतक से घिरा हुआ है।
- श्वासनली में एक भट्ठा बनाने के लिए सुई का उपयोग करें (सिर से नीचे की दूरी का लगभग एक चौथाई) और एक कैनुला (18 जी एक्स 1.25") को एक सिरिंज के साथ पहले से लोड 1x पीबीएस (26.25 एमएल/किलोग्राम शरीर के वजन, $0.7-1.0 एमएल में एक 8-10 सप्ताह पुराने मादा C57/6J) को शामिल करें। Hea.
- फेफड़ों को धीरे-धीरे फुलाने के लिए फेफड़ों में पीबीएस की मात्रा को पुश करें, मात्रा को सिरिंज में वापस बाहर खींच लें। इस प्रक्रिया को कुल 3 बार दोहराएँ.
- एक 15 एमएल ट्यूब में प्रत्येक विशिष्ट माउस से जमा lavage तरल पदार्थ ले लीजिए.
- 610 x g पर 610 x g पर ब्रोंकोएल्वेलर लेवेज को 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेट को 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। गोली ब्रोन्कोएल्वेलर अंतरिक्ष से कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है।
- सेल गोली के लिए एक े आर सी एल lysis बफर के 1 एमएल जोड़कर एकत्र बाल तरल पदार्थ में अवशिष्ट लाल रक्त कोशिकाओं को निकालें, तो भंवर अच्छी तरह से और बर्फ पर 1 मिनट के लिए lyse. बाद में, lysis प्रतिक्रिया को रोकने के लिए पीबीएस के 4 एमएल जोड़ें।
- 610 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा गोली कोशिकाओं को 6 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस पर और एक वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ supernatant aspirate.
- 1x पीबीएस + 10% FBS प्रत्येक बाल नमूना ट्यूब के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित। प्रत्येक नमूने (कोई trypan नीले) से कुल हवाई क्षेत्र कोशिकाओं के परिमाणीकरण के लिए एक हीमोसाइटोमीटर पर कोशिकाओं की गणना। मध्यम त्वरण और एक साइटोसेंट्रीफ्यूज का उपयोग करते हुए, 3 मिनट के लिए 56 x ग्राम पर प्रत्येक नमूने के 120 डिग्री एल। स्लाइड को रात भर सुखा लें।
5. कूपिका मैक्रोफेज efferocytic सूचकांक की गणना (दिन 3)
- hematoxylin और eosin के साथ स्लाइड दाग दोनों efferocytic और अंतर सेल मायने रखता है की गणना के लिए अनुमति देने के लिए, प्रत्येक स्लाइड से गिना कम से कम 200 कोशिकाओं के साथ.
- एक जैविक माइक्रोस्कोप पर एक उज्ज्वल क्षेत्र सेटिंग के तहत स्लाइड देखें (एक 20x या 40x उद्देश्य सबसे अच्छा काम करेगा).
- कूपिक सूचकांक की गणना कीजिए जो एलोवेलर मैक्रोफेज की संख्या के अनुपात के आधार पर कीजिए, जो कि फेगोसाइटोसेड एपोटोटिक ज्यूर्ट टी कोशिकाओं को कोशिका विभेदी स्लाइड पर कुल 200 मैक्रोफेज से बाहर ले जाने के बिना कूपक मैक्रोफेज तक ले जाते हैं। डेटा इनपुट के अनुपात को प्रतिशत में कनवर्ट करें. निम्न समीकरण का उपयोग करें:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हे3 जोखिम फुफ्फुसीय सूजन और चोट प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, और efferocytosis ऊतक homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक है। C57BL/6J मादा चूहों को फ़िल्टर्ड हवा (एफए) या 1 पीपीएम ओ3 के लिए 3 एच और नेक्रोप्सी 24 एच पोस्ट-एक्सपोजर के लिए फुफ्फुसीय सूजन और चोट की जांच करने के लिए उजागर किया गया। हे3-अवेकेड चूहों ने एफए नियंत्रण समूह की तुलना में हवाई क्षेत्र में मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल में उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित की (चित्र 1ए, बी)। इसके अतिरिक्त, O3-exposed चूहों बाल प्रोटीन में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी, कूपिका उपकला बाधा रोग का एक मार्कर 24 एच पोस्ट-एक्सपोजर (चित्र 1ब्) .
यह निर्धारित करने के लिए कि ओ3-प्रेरितफुफ्फुसीय सूजन विवो में कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis में दोषों के साथ जुड़ा हुआ है, C57BL/6J मादा चूहों को ओरोफैरिनसियल आकांक्षा 24 एच पोस्ट-एफए या पोस्ट-ओ 3 के माध्यम से एपोटोटिक जुकट टी कोशिकाओं के साथ पैदा किया गया था। जोखिम. Jurkat टी कोशिकाओं में Apoptosis प्रवाह cytometry द्वारा dosing से पहले की पुष्टि की थी, और वहाँ जल्दी में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी (annexin वी+ पीआई- और देर से (annexin वी+ और PI+) apoptotic कोशिकाओं (चित्र 2ए ,बी) जोखिम स्तर और ऊष्मायन समय के परिणामस्वरूप $75% apoptotic Jurkat टी कोशिकाओं के दोहराव परिणाम के परिणामस्वरूप. क्या एक efferocytic मैक्रोफेज के रूप में पहचान की गई थी की एक बढ़ाया छवि चित्र 3एमें दिखाया गया है। Efferocytic मैक्रोफेज मैक्रोफेज कि एक Jurkat टी सेल को घेर लिया था के रूप में पहचान की गई (काले तीर द्वारा संकेत दिया), नियमित कूपिका मैक्रोफेज की तुलना में (सफेद तीर द्वारा इंगित)(चित्र 3बी)। जब कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis प्रोटोकॉल का उपयोग मूल्यांकन किया गया था, वहाँ एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण एफए नियंत्रण की तुलना में O3- उजागर समूह के efferocytic सूचकांक में कमी थी (चित्र 3बी, सी) . इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि ओ3प्रेरित फुफ्फुसीय सूजन एपोटोटिक कोशिकाओं की कम निकासी के साथ जुड़ा हुआ है, जो फेफड़ों की चोट और सूजन को बढ़ा सकता है।
चित्रा 1: हे3 जोखिम फुफ्फुसीय सूजन और चोट लाती है। C57BL/6J मादा चूहों को फ़िल्टर की गई हवा (एफए) या 1 पीपीएम ओ3 के लिए 3 ज 24 एच पोस्ट-एक्सपोजर के संपर्क में किया गया था, चूहों को फुफ्फुसीय सूजन और चोट का विश्लेषण करने के लिए नेक्रोप्सी किया गया था (प्रति समूह $ 6)। (ए) ब्रोंकोल्वेलर लावेज (बीएएल) सेल विभेदों की गणना की गई थी, फिर उपकला (एपि), इओसिनोफिल्स (इओस), लिम्फोसाइट्स (लिम्फ), मैक्रोफेज (एमजेड), और न्यूट्रोफिल (पीएमएन) की पहचान प्रत्येक स्लाइड से कम से कम 200 कोशिकाओं के साथ की गई थी। (ख)सेलुलर अंतर की एक प्रतिनिधि छवि. (ग)बाल तरल पदार्थ में कुल प्रोटीन। डेटा के रूप में व्यक्त कर रहे हैं - SEM (* पी और lt; 0.01). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: Jurkat टी कोशिकाओं में यूवी प्रेरित apoptosis की पुष्टि. Jurkat टी कोशिकाओं यूवी (60 mJ/cm2) एक यूवी Crosslinker (मॉडल 1800) का उपयोग करने के संपर्क में थे. यूवी जोखिम के बाद, Jurkat टी कोशिकाओं 4 एच के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated थे। ऊष्मायन के बाद, Jurkat टी कोशिकाओं annexin वी और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ दाग थे, और apoptosis प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया था। प्रारंभिक एपोप्टोटिक, देर से एपोप्टोटिक, और नेक्रोटिक कोशिकाओं की पहचान क्रमशः एनेक्सिन वी+/पीआई-, एनेक्सिन वी+/पीआई+ ,एनेक्सिन वी- /पीआई+के रूप में की जाती है। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री तितर बितर भूखंडों (के 10,000 घटनाओं दर्ज के साथ) (ए) unexposed Jurkat टी कोशिकाओं और (बी) यूवी उजागर Jurkat टी कोशिकाओं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: हे3 जोखिम अल्वेलर मैक्रोफेज efferocytosis कम हो जाती है। C57BL/6J मादा चूहों फ़िल्टर्ड हवा (एफए) या 1 पीपीएम ओ3 के लिए 3 ज 24 एच पोस्ट-एक्सपोजर के संपर्क में थे, चूहों oropharyngeally लगभग 5 x 106 apoptotic Jurkat टी कोशिकाओं के साथ पैदा किए गए थे। 1.5 ज पैदा करने के बाद, ब्रोंकोएलवेलर लावेज (BAL) किया गया था, और efferocytic सूचकांक 200 मैक्रोफेज (एन $ 11 प्रति समूह) की गिनती के बाद प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा बाल मैक्रोफेज में गणना की गई थी। (ए)एक efferocytic मैक्रोफेज के प्रतिनिधि छवि. (बी)एफए या ओ3 प्रदर्शन के बाद कूपिका मैक्रोफेज (सफेद तीर) और efferocytic मैक्रोफेज (काले तीर) की पहचान। (ग) एफए या ओ3 प्रदर्शन (* * पी एंड एलटी; 0.0001) के बाद efferocytic सूचकांक की गणना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: Suboptimal Jurkat टी सेल apoptosis 350 एनएम ठंढा बल्ब का उपयोग कर. Jurkat टी कोशिकाओं 10 मिनट के लिए यूवी Crosslinker का उपयोग कर विकिरणित किया गया और 1 एच के लिए 5% सीओ2 पर 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated. यूवी जोखिम के बाद, Jurkat टी कोशिकाओं 4 एच के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated थे। ऊष्मायन के बाद, Jurkat टी कोशिकाओं annexin वी और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ दाग थे, तो apoptosis प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया गया था। प्रारंभिक एपोप्टोटिक, देर से एपोप्टोटिक, और नेक्रोटिक कोशिकाओं की पहचान क्रमशः एनेक्सिन वी+/पीआई-, एनेक्सिन वी+/पीआई+, और एनेक्सिन वी- /पीआई+ केरूप में की जाती है। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों (के साथ 10,000 दर्ज की घटनाओं) 350 एनएम बल्ब के साथ यूवी उजागर Jurkat टी कोशिकाओं के दिखाए जाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efferocytosis एक विरोधी भड़काऊ प्रक्रिया है जिसमें मैक्रोफेज स्पष्ट apoptotic कोशिकाओं और मलबे के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई विरोधी भड़काऊ मध्यस्थों9,10,11,12,16 का उत्पादन ,18. efferocytosis के कई मॉडल कैसे मैक्रोफेज सूजन6,7के संकल्प में एक महत्वपूर्ण कोशिका है में अंतर्दृष्टि प्रदान की है . हाल ही में , पुराने फेफड़ों के रोगों की प्रगति efferocytosis8,9,15,16,17में दोषों के साथ जुड़ा हुआ है . हालांकि, यह वर्तमान में स्पष्ट नहीं है कि क्या ओ 3 जैसे वायु प्रदूषकों के संपर्कमें, efferocytosis में दोष होता है। यह प्रोटोकॉल ओ3 प्रदर्शन के बाद कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis के मूल्यांकन में सक्षम बनाता है। यह भी प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विवो में efferocytosis मात्रा और फेफड़ों microenvironment के संदर्भ में efferocytosis की माप की अनुमति देता है, पूर्व vivo जोड़तोड़ या महंगा फ्लोरोसेंट रंगों के बिना. हालांकि इस प्रोटोकॉल ओ3 जोखिम के संदर्भ में किया जाता है, फेफड़ों की सूजन और चोट के कई मॉडल इस प्रोटोकॉल के साथ कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
मौजूदा तरीकों पर इस विधि के लाभ शारीरिक पर्यावरण के संदर्भ में कूपिका मैक्रोफेज का विश्लेषण करने की क्षमता है। कूपिका मैक्रोफेज के पूर्व विवो विश्लेषण में एपोप्टोटिक कोशिकाओं के साथ चढ़ाना और ऊष्मायन शामिल है। प्लेटिंग कूपिका मैक्रोफेज शारीरिक और जीनोमिक दोनों परिवर्तन पैदा कर सकते हैं जो efferocytosis28,29,30को बदल सकते हैं . इसके अतिरिक्त, फेफड़ों में, कूपिका मैक्रोफेज एक सूक्ष्म पर्यावरण में मौजूद होते हैं जिसमें सर्फैक्टेंट और फेफड़ों की अस्तर तरल पदार्थ के घटक होते हैं जो मैक्रोफेज फ़ंक्शन31,32,33को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं, 34,35. हमारी विधि कोई पूर्व विवो जोड़तोड़, जो अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है के साथ फेफड़ों में efferocytosis माप की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के बारे में अधिक गहराई से अध्ययन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कैसे फेफड़ों microenvironment कूपिका efferocytosis बदल सकते हैं.
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण घटक कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis के मूल्यांकन के लिए apoptotic कोशिकाओं की पीढ़ी है. यह apoptosis, नहीं परिगलन प्रेरित करने के लिए सही यूवी जोखिम स्तर का अनुकूलन शामिल है. हमारे प्रोटोकॉल 254 एनएम तरंगदैर्ध्य उत्सर्जन बल्ब और 60 mJ/cm2के एक जोखिम स्तर के साथ यूवी crosslinker का उपयोग करता है. यूवी बल्ब विकल्प apoptosis के उत्पादन में महत्वपूर्ण हैं, नहीं परिगलन. 350 एनएम यूवी बल्ब प्रोटीन झिल्ली पार से जोड़ने और नसबंदी के लिए उत्कृष्ट हैं, लेकिन apoptosis प्रेरित करने में विफल35,36,37. 350 एनएम बल्बों के साथ 60 उJ/सेमी2 के संपर्क में Jurkat टी कोशिकाओं का एक उदाहरण डॉट साजिश देर apoptotic और नेक्रोटिक कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण वृद्धि के साथ चित्र 4 में दिखाया गया है। साथ ही, प्रोटोकॉल एक 4 एच ऊष्मायन पोस्ट-यूवी जोखिम का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल के इस भाग को अनुकूलित करने के लिए, हमने पहले विभिन्न ऊष्मायन समयों की जांच की और पाया कि 1.5 और 2 एच ऊष्मायन पोस्ट-एक्सपोजर केवल लगभग 40% एपोप्टोसिस मिले, जिसमें 5% से कम का एक efferocytic सूचकांक था (डेटा नहीं दिखाया गया)। वर्तमान साहित्य के आधार पर, $70%-80% कुल apoptotic कोशिकाओं efferocytosis38को मापने के लिए पर्याप्त हैं.
इस प्रोटोकॉल के लिए एक सीमा यह है कि यह एफए या ओ3 जोखिम के बाद हवाई क्षेत्र में सभी मैक्रोफेज के efferocytic प्रतिक्रिया की जांच करता है और भर्ती मैक्रोफेज से ऊतक निवासी मैक्रोफेज भेद नहीं करता है। फेफड़ों के निवासी मैक्रोफेज को कूपिका मैक्रोफेज कहा जाता है जो भ्रूण यकृत से उत्पन्न होता है, जबकि भर्ती मैक्रोफेज रक्त जनित भ्रूण मूल से प्राप्त होता है। चोट लगने पर फेफड़े में एक अत्यधिक विषमांगी मैक्रोफेज जनसंख्या हो सकती है, जिसमें अद्वितीय आनुवंशिकी और कोशिका सतह मार्कर28,29,30,31 ,32, 33,34,35. यह ज्ञात है कि इन मैक्रोफेज आबादी की प्रतिरक्षा संबंधी प्रतिक्रिया और कार्य भिन्न हैं; तथापि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि टिश्यू रेजिडेंट मैक्रोफेज की भर्ती29,30,31की तुलना में अधिक प्रभावपूर्ण प्रतिक्रिया है . ऊतक निवासी मैक्रोफेज बनाम भर्ती मैक्रोफेज की efferocytic प्रतिक्रिया का निर्धारण वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है; हालांकि, मैक्रोफेज आबादी को एफएसीएस द्वारा शुद्ध और विश्लेषण के लिए स्लाइड पर चढ़ाया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल केवल inbred के एक तनाव में कूपिका मैक्रोफेज efferocytic समारोह का आकलन, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चूहों. यह पहले सूचित किया गया है कि चूहों के विभिन्न उपभेदों O3 जोखिम के लिए अलग अलग प्रतिक्रियादिखाने के लिए, फुफ्फुसीय सूजनसहित 39,40. इसलिए, जांच किए गए तनाव के आधार पर कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis में अंतर हो सकता है। यह एक चर है कि जब vivo परख में इस प्रदर्शन पर विचार किया जाना चाहिए है.
अंत में, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल विवो में कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis के मूल्यांकन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल लागत प्रभावी और सरल है, यह एक परख है कि व्यापक रूप से उपयोग किया जा सकता है बना रही है. इसके अलावा, इस विधि फेफड़ों की चोट के कई मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है और / या सूजन कैसे विभिन्न फुफ्फुसीय अपमान मैक्रोफेज efferocytosis बदल सकते हैं की समझ को बढ़ाने के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
इस अध्ययन के स्वास्थ्य प्रभाव संस्थान वाल्टर ए Rosenblith पुरस्कार और NIEHS R01ES028829 (के एम जी के लिए) द्वारा वित्त पोषित है. हम डॉ Dianne वाल्टर्स (शरीर विज्ञान विभाग, ECU) alveolar मैक्रोफेज के प्रतिनिधि चित्र प्राप्त करने के साथ उसकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
References
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
