Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att avgöra om exponering för ozon, ett kriterium luftförorening, försämrar alveolära makrofage efferocytos in vivo. Detta protokoll använder vanliga reagenser och tekniker och kan anpassas till flera modeller av lungskada för att fastställa effekter på alveolära makrofagen efferocytos.
Abstract
Ozon (O3) är ett kriterium luftförorening som förvärar och ökar incidensen av kroniska lungsjukdomar. O3 exponering är känd för att framkalla lunginflammation, men lite är känt om hur exponeringen förändrar processer som är viktiga för upplösningen av inflammation. Efferocytosis är en resolution process, varvid makrofager fagocytize apoptotiska celler. Syftet med detta protokoll är att mäta alveolära makrofage efferocytos efter O3-inducerad lungskada och inflammation. Flera metoder har beskrivits för att mäta efferocytos; emellertid, de flesta kräver ex vivo manipulationer. Beskrivs i detalj här är ett protokoll för att mäta in vivo alveolära makrofage efferocytosis 24 h efter O3 exponering, som undviker ex vivo manipulation av makrofager och fungerar som en enkel teknik som kan användas för att korrekt representera störningar i Denna resolutions process. Protokollet är en tekniskt icke-intensiv och relativt billig metod som involverar hela kroppen O3 inandning följt av orofaryngeal aspiration av apoptotiska celler (dvs., Jurkat T-celler) medan under narkos. Alveolära makrofagefferocytos mäts sedan genom ljusmikroskopi utvärdering av makrofager som samlats in från bronkoalveolär (BAL) sköljning. Efferocytosis mäts slutligen genom att beräkna ett efferocytic index. Kollektivt, de beskrivna metoderna kvantifiera efferocytic aktivitet i lungan in vivo och samtidigt tjänar till att analysera de negativa hälsoeffekterna av O3 eller andra inhalerade förolämpningar.
Introduction
Lungan utsätts ständigt för miljömässiga förolämpningar, inklusive luft partiklar, virus, bakterier, och oxidationsmedel gaser som utlöser lunginflammation1,2,3. Dessa förolämpningar kan äventyra gasutbyte och framkalla irreversibel vävnadsskada4,5. Alveolära makrofager, som utgör cirka 95% av de immunceller som finns i murin och mänskliga lungor vid homeostas, är kritiska regulatorer av pulmonell inflammation efter miljö förolämpningar1,2, 3,4,5. Alveolära makrofager är viktiga under värd försvaret av fagocyterande och eliminera patogener. Nyligen, alveolära makrofager har visat sig främja vävnad homeostas och upplösning av inflammation genom efferocytosis6,7. Efferocytosis är en fagocytisk process där makrofager uppslukar och eliminera apoptotiska celler8,9,10. Efferocytosis resulterar också i produktion av medlare (i.e., Il-10, TGF-β, PGE2, och kväveoxid) att ytterligare öka processen, vilket resulterar i upplösning av inflammation9,10,11 ,12,16,18. Denna process är nödvändig för att förhindra sekundär nekros och främja vävnad homeostas12,13,14. Flera studier har kopplat nedsatt efferocytos med olika kroniska lungsjukdomar, inklusive astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, och idiopatisk pulmonell fibros8,9,15, 16,17.
O3 är ett kriterium luftförorening som förvärar och ökar incidensen av kroniska lungsjukdomar19,20,21. O3 inducerar lunginflammation och skada och är känt för att försämra alveolära makrofagocytos av bakteriella patogener22,23. Emellertid, det är okänt om O3 försämrar alveolära makrofagen efferocytos. Utreda O3-inducerad förändringar i alveolär makrofagefferocytos kommer att ge potentiell insikt i hur exponeringen kan leda till kronisk lungsjukdom incidens och exacerbation. Beskrivs nedan är en enkel metod för att utvärdera alveolära makrofage efferocytosis i lungorna av kvinnliga möss efter akut O3 exponering.
Metoden som beskrivs har flera fördelar jämfört med andra efferocytosis-protokoll som vanligen används inom området genom att eliminera användningen av kostsamma fluorescerande färgämnen, omfattande flödescytometrimätningar och ex vivo-manipulation av alveolära makrofager24 ,25. Dessutom, detta protokoll åtgärder alveolära makrofage efferocytos i samband med lung mikromiljön, som kan påverka makrofagfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av East Carolina University.
1. ozon (O3) och filtrerad luft exponering (dag 1)
- Placera högst 12 kvinnliga C57BL/6J möss, 8-12 veckor gamla, i en stålbur (med 12 separata avdelningar) med tråds nät lock i en O3 exponeringskammare.
- Placera termometern i exponerings kammaren med buren för att korrekt registrera temperatur och luftfuktighet.
- Slå på syre och ultraviolett (UV) ljus som är ansluten till apparaten.
Obs: reglerat luftflöde (> 30 luftbyten/h) med kontrollerad temperatur (22-23 ° c) och relativ luftfuktighet (45%-50%) erhålls genom O3 -apparaten. O3 genereras av systemet i exponerings kammaren genom att rikta 100% syre genom en UV-ljus generator, sedan blandas med en filtrerad lufttillförsel. - Justera O3 koncentrationen till 1 ppm och regelbundet spela in o3 nivåer varje 10 min för 3 h. kontinuerligt övervaka temperatur och luftfuktighet i kammaren luft, liksom O3 koncentrationen med en UV-ljus fotometer.
Anmärkning: filtrerad luft exponering utförs i en liknande apparat, med endast en filtrerad lufttillförsel som strömmar genom exponerings kammaren. - Returnera djuren till sina respektive burar med strö, mat och vatten AD libitum efter 3 h av O3/filtrerad luft exponering.
2. beredning av Jurkat T-celllinje (dag 2)
Anmärkning: alla procedurer ska utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II.
- Kultur Jurkat T-celler i 24 mL basalcells odling medium + 10% FBS + 5% penicillin/streptomycin vid 37 ° c + 5% CO2 (tabell över material). Jurkat T-celler är en suspension cell linje som kan upprätthållas genom passaging 1:6-1:8 i förvärmda odlingsmedier varje 3 dagar. Skaka inte.
- För att förbereda apoptotiska celler, odla dem till 90% confluency i varje kolv (som tar 3-4 dagar att uppnå efter passaging). För denna studie, Använd celler från fem T75 kolvar för att få tillräckligt antal celler som används i detta protokoll.
Anmärkning: en konfluenta-kolv innehåller ca 20-24 miljoner celler. - Pipettera upp celler (som är hela kolven) från varje kolv (ca 24 mL) och överför celler till ett sterilt 50 mL koniskt rör med hjälp av en serologisk pipett. Använd flera koniska rör för flera kolvar.
- Räkna celler genom att ta bort en 11 μL alikvot av celler från 50 mL koniska röret och blanda med 11 μL trypan blå fläck och Pipettera 11 μL på hemocytometern diabilder.
- Sätt in bilden i en automatiserad cell räknare och registrera antalet levande celler för att beräkna det totala antalet celler i varje kolv genom att multiplicera mängden av de levande cellerna med 24, eftersom varje kolv innehåller 24 mL media.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 271 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT) till pellets celler.
- Kassera supernatanten genom aspiration och Omsuspendera cellpelleten i media för att få 3,0 x 106 celler per ml.
- Alikvot 5 mL av cellerna i 100 mm x 20 mm vävnad kultur rätter (cirka nio rätter kommer att användas; den totala mängden celler i varje maträtt bör vara ~ 15 x 106).
- Använd en skål för kontroll/oexponerad, och resterande rätter kommer att utsättas för UV.
- Ställ in den UV-crosslinker till rätt energinivå, tryck på energi-knappen och ange "600" med hjälp av sifferknapparna, som maskinen kommer att läsas som 600 μJ/cm2 x 100.
Obs: UV-crosslinker energienheter är i μJ/cm2 x 100; Därför, för att uppnå 60 millijoule/cm2, konvertera enheter för att matcha UV-crosslinker. - Bestråla alla rätter med celler, inte inklusive kontroll, på 60 millijoule (mJ)/cm2 med hjälp av UV-crosslinker. Ta bort den övre luckan på vävnaden kultur rätter under UV-exponering, som UV-ljus kommer inte tränga igenom plastlocket.
- Inkubera alla rätter i en cellkultur inkubator, inklusive oexponerad kontroll, vid 37 ° c vid 5% CO2 för 4 h.
- Bekräfta apoptos genom flödescytometri med hjälp av en apoptos assay Detection kit innehållande Annexin V och propidiumjodid jodid (PI) (markörer för apoptos respektive nekros) efter 4 h inkubation, enligt tillverkarens instruktioner26, 27.
Anmärkning: Irradierande Jurkat T-celler i UV-crosslinker på en energinivå på 600 μJ/cm2, efter en 4 h inkubation kommer att leda till ≥ 75% av apoptotiska (både tidigt och sent) celler som har mer tidig apoptotisk fenotyp än den sena apoptotiska fenotypen. Detta gör det lättare för alveolära makrofager att känna igen dem och uppslukar som deras membran är kompromisslös, till skillnad från sena apoptotiska celler, vilket leder till en högre efferocytic index och mer exakt avbildning av alveolära makrofage efferocytosis i denna studie.- Pool 333 μL (1 x 106 celler) av Jurkat T celler från flera rätter (både "ingen UV" och "UV-exponerade") tillsammans för att använda för kompensations analys rör.
- Aliquot 333 μL av Jurkat T-celler i ofärgade, Annexin V enda fläck, PI enda fläck, ingen UV-kontroll, och 600 μJ/cm2 UV-exponerade märkta flödescytometri rör.
- Centrifugera rören vid 188 x g i 5 min vid RT och Dekantera supernatanten.
- Tvätta celler genom att omlägga 500 μL kall, 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Centrifugera och pelletceller vid 188 x g i 5 minuter vid RT. Kassera supernatanten efter centrifugering.
- Bered 400 μL 1x bindningsbuffert per flödesrör genom att späda 10X bindningsbuffert med destillerat vatten medan cellerna centrifugeras.
- Förbered Annexin V och PI inkuberingsreagens (100 μL per prov/tub) enligt tillverkarens anvisningar.
- Dekanera supernatanten efter centrifugering och försiktigt Omsuspendera alla rör i 400 μL 1x bindningsbuffert, tillsätt sedan 100 μL Annexin V inkubationsreagens till varje provrör. Slutligen, tillsätt 100 μL av Annexin V enda fläcken och PI enda fläcken till sina respektive rör, men inte lägga något utöver 1x bindning buffert till ofärde röret.
- Inkubera rören i mörker i 15 minuter vid RT.
- Centrifugera alla celler vid 188 x g i 5 minuter vid RT och dekanant supernatant.
- Omsuspendera cellerna i 400 μL 1x bindningsbuffert och analysera sedan prover för apoptos med flödescytometri. Samla minst 10 000 händelser per tub för att möjliggöra korrekt återgivning av färgning.
- Kombinera alla bestrålade celler från rätter till ett 50 mL koniskt rör och pellets celler genom centrifugering vid 271 x g i 5 minuter vid RT.
- Kassera supernatanten från röret genom att aspirera och Omsuspendera celler i 24 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och pellets celler genom centrifugering vid 271 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten från röret genom att aspirera och Omsuspendera celler i mängden PBS som används för dosering av möss som godkänts av IACUC. Den dos som används är mellan 5-10 x 106 celler/50 μl per mus; Därför, för 10 möss, Omsuspendera i 500 μL (antal celler i varje dos varierar beroende på hur många celler som odlas för bestrålning).
Anmärkning: makeup minst två ytterligare doser för att ta hänsyn till eventuell vätska som kan fastna på sidorna av pipettspetsen vilket resulterar i förlust av celler.
3. murin orofaryngeal instillation av apoptotiska celler (dag 2)
- Förbered dosering inokulum av apoptotiska celler med en P200 pipett före anesthetizing möss att påskynda förfarandet. Enligt de institutionella riktlinjerna utnyttjas en volym på 50 μL innehållande cirka 5-10 x 106 celler för orofaryngeal (o.p.) instillation för att säkerställa bästa resultat.
- Anesthetize möss i en klar kammare med 2% isofluran med en flödeshastighet på 1 L/min eller enligt de institutionella riktlinjerna. Anesthetize en till två möss i taget; antalet bestäms av försöksledaren komfort nivå. Observera andningsmönstret och bekräfta djupa andetag är synliga med 2 – 3 s räknas mellan andetag. Kontrollera om djupet av anestesi av bristen på svar på tå nypa.
- Placera musen i en semi-recumbent liggande läge. Använd en kirurgisk sträng bunden mellan pinnar på en lutande akryl plåt för att avbryta genom maxillary incisors.
- Med hjälp av ett par trubbiga icke-räfflade forceps, lätt greppa och dra musen tungan. Ingjuta de apoptotiska cellerna i munhålan med en P200 pipett. Dosering är framgångsrik när mössen gör ett sprakande brus 1 – 2 s efter att ha gett dosen.
Anmärkning: var noga med att undvika att inducera trauma antingen till tungan eller orofarynx före apoptotiska cell instillation. - Med en handskar finger, försiktigt blockera näsan tills musen inhalerar medan tungan är tillbakadragen. Täck näsan tills ingen vätska är synlig i munhålan och musen har tagit två eller flera inhalationer.
Obs: eftersom möss är obligate näsa andetag, som täcker näsan hjälper till att säkerställa att musen kommer att inhalera de apoptotiska cellerna i lungorna. - Ta bort musen från inympning styrelsen och returnera den till buren för att möjliggöra återhämtning från anestesi. Placera musen på ryggen för att förhindra strö eller skräp från att blockera Nares under revovery.
- Vänta 90 min efter att musen återhämtar sig från anestesi för att tillåta alveolära makrofager att uppsluga tillströmningen av apoptotiska celler efter alla möss har vaknat från anestesi. Typiskt, uppvaknande efter anestesi kommer att ta 1 – 2 min, vilket inte bör påverka resultatet/tidpunkten för instillation.
4. uppsamling och bearbetning av bronalveolärlavage (dag 2)
- Euthanize varje mus per institutionella riktlinjer 90 min efter att musen har vaknat upp från anestesi från dosering med apoptotiska celler. Här, en dödlig injektion av ketamin och xylazin används (90 mg/kg och 10 mg/kg, respektive) följt av excising membranet.
Obs: denna tid punkt ger tillräcklig tid för alveolära makrofager att känna och uppsluka apoptotiska celler38. - Väg alla möss (g) på en skala och rekord vikter. Använd kroppsvikten för att beräkna BAL volym (26,25 mL/kg kroppsvikt).
- Placera möss på ryggen och spraya 70% etanol för att sterilisera bröstet och halsen området.
- Gör en 2 "längsgående snitt strax under bröstbenet längs hela ventrala sidan med kirurgisk sax, och medan du håller bröstbenet med tång, Nick membranet att låta lungorna att falla tillbaka i brösthålan.
- Skär i sidled längs sidorna av revbenen för att låta lungorna mer utrymme att expandera när lavaging, sedan vika bröstet hålighet tillbaka med pinkoppar.
- Gör en 1 "vertikal skära upp längs kärlsystemet genom halsen för att exponera luftstrupen.
- Använd två tång för att dra muskler och vävnad från luftstrupen och utsätta den. Undvik ytterligare potentiell blödning och skära luftstrupen, eftersom det är omgivet av kärl, längsgående muskler, och bindväv.
- Använd en nål för att göra en skåra i luftstrupen (ungefär en fjärdedel av avståndet ner från huvudet) och sätt en kanyl (18 G x 1,25 ") med en spruta förladdad med 1x PBS (26,25 mL/kg kroppsvikt, ~ 0,7-1,0 mL i en 8-10 vecka gammal kvinnlig C57Bl/6J mus) caudally i trac Hea.
- Tryck volymen PBS i lungorna långsamt så att lungorna kan blåsa upp då, dra tillbaka volymen i sprutan. Upprepa denna process totalt 3 gånger.
- Samla den poolade pumpning vätskan från varje specifik mus i en 15 ml tub.
- Centrifugera bronalveolär sköljning vid 610 x g i 6 min vid 4 ° c och samla supernatanten i en 1,5 ml tub och frysa vid-80 ° c. Pelleten representerar celler från bronalveolära rymden.
- Ta bort kvarvarande röda blodkroppar i insamlade BAL vätska genom att tillsätta 1 mL ACK RBC lysis buffert till cellpelleten, sedan Vortex väl och lyse för 1 min på is. Tillsätt därefter 4 mL PBS för att stoppa Lys reaktionen.
- Pellets celler genom centrifugering vid 610 x g i 6 min vid 4 ° c och Aspirera supernatanten med en vakuum aspirator.
- Omsuspendera cellerna i 1 mL 1x PBS + 10% FBS till varje provrör av BAL. Räkna celler på en hemocytometern för kvantifiering av totala luftrums celler från varje prov (ingen trypan blå). Centrifugera 120 μL av varje prov på diabilder vid 56 x g i 3 min, med medelhög acceleration och en cytocentrifug. Torka av bilderna över natten.
5. beräkning av det alveolära makrofag-efferocytiska indexet (dag 3)
- Färga glasen med hematoxylin och eosin för att möjliggöra beräkning av både efferocytic och differential cells räkning, med minst 200 celler räknat från varje bild.
- Visa bilder under en ljus-fält inställning på ett biologiskt Mikroskop (en 20x eller 40x mål fungerar bäst).
- Beräkna efferocytic index baserat på förhållandet mellan antalet alveolära makrofager som fagocytos apoptotiska Jurkat T-celler till alveolära makrofager utan apoptotiska celler upptag av en total 200 makrofager på en cell differential Slide. Konvertera förhållandet till en procentsats för datainmatning. Använd följande ekvation:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O3 exponering är känd för att framkalla lunginflammation och skada, och efferocytosis krävs för att bibehålla vävnad homeostas. C57BL/6j kvinnliga möss utsattes för filtrerad luft (FA) eller 1 ppm O3 för 3 h och obduceras 24 h efter exponering för att undersöka lunginflammation och skada. O3-exponerade möss uppvisade en signifikant ökning av makrofager och neutrofiler i luftrummet jämfört med kontrollgruppen för anläggningstillgångar (figur 1a, B). Dessutom, O3-exponerade möss hade en signifikant ökning av bal protein, en markör för alveolära epitelial barriär dysfunktion 24 h efter exponering (figur 1C).
För att avgöra om O3-inducerad lunginflammation är förknippad med defekter i alveolära makrofagen efferocytosis in vivo, C57BL/6j honmöss var instillade med apoptotiska Jurkat T celler via orofaryngeal aspiration 24 h post-FA eller post-O3 exponeringen. Apoptos i Jurkat T- celler bekräftades av flödescytometri före dosering, och det fanns en signifikant ökning i början (Annexin v+ Pi-och sent (Annexin v+ och PI+) apoptotiska celler (figur 2a, B). Exponeringsnivån och inkubationstiden resulterade i repetitiva resultat av ~ 75% apoptotiska Jurkat T-celler. En förstorad bild av vad som identifierades som en efferocytisk makrofage visas i figur 3A. Efferocytiska makrofager identifierades som makrofager som hade uppslukade en Jurkat T-cell (indikeras med svarta pilar), jämfört med vanliga alveolära makrofager (indikeras med vita pilar) (figur 3B). När alveolära makrofagefferocytos bedömdes använda protokollet, det fanns en statistiskt signifikant minskning av efferocytic index för O3-exponerade gruppen jämfört med FA kontroller (figur 3B, C). Dessa data indikerar att O3-inducerad lunginflammation är förknippad med minskad clearance av apoptotiska celler, som kan förlänga lungskada och inflammation.
Figur 1: O3 exponeringen inducerar lunginflammation och skada. C57BL/6j kvinnliga möss exponerades för filtrerad luft (FA) eller 1 ppm O3 för 3 h. 24 h efter exponering, möss var obduceras att analysera lunginflammation och skada (n = 6 per grupp). A) cell differentialerna för bronalveolär pumpning (bal) beräknades, därefter identifierades epitelial (EPI), eosinofiler (EOS), lymfocyter (lymfa), makrofager (Mɸ) och neutrofiler (PMN) med minst 200 celler räknat från varje bild. B) en representativ bild av cellulära differentialer. Ctotalt protein i Bal vätskan. Data uttrycks som ± SEM (* * p < 0,01). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bekräftelse av UV-inducerad apoptos i Jurkat T-celler. Jurkat T-celler exponerades för UV (60 mJ/cm2) med hjälp av en UV-crosslinker (modell 1800). Efter UV-exponering inkuberades Jurkat T-celler vid 37 ° c med 5% CO2 för 4 h. Efter inkubering färgas Jurkat T-celler med Annexin V och propidiumjodid jodid (PI), och apoptos utvärderades av flödescytometri. Tidiga apoptotiska, sena apoptotiska och nekrotiska celler identifieras som Annexin V+/PI-, Annexin v+/PI+, Annexin v-/PI+, respektive. Representativa flödescytometri spridningsdiagram (med 10 000 händelser inspelade) av (a) oexponerade Jurkat t-celler och (B) UV-exponerade Jurkat t-celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: O3 exponeringen minskar den alveolära makrofagefferocytos. C57BL/6J honmöss exponerades för filtrerad luft (FA) eller 1 ppm O3 för 3 h. 24 h efter exponering, möss var orofaryngeally ingjued med cirka 5 x 106 apoptotiska Jurkat T celler. 1,5 h efter instillation, bronkoalveolär pumpning (bal) utfördes, och efferocytic index beräknades i Bal makrofager av ljusmikroskopi efter att ha räknat 200 makrofager (n = 11 per grupp). A) representativ bild av ett efferocytiskt makrofage. B) identifiering av alveolära makrofager (vita pilar) och efferocytisk makrofage (svarta pilar) efter exponering för FA eller O3 . C) beräkning av det efferocytiska indexet efter exponering för FA eller O3 (* * * p < 0,0001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: suboptimal Jurkat T-cell apoptos med 350 nm frostat lökar. Jurkat T-celler bestrålades med hjälp av UV-Crosslinkaren i 10 min och inkuberades vid 37 ° c vid 5% CO2 för 1 h. Efter UV-exponering inkuberades Jurkat T-celler vid 37 ° c med 5% CO2 för 4 h. Efter inkubering färgas Jurkat T-celler med Annexin V och propidiumjodid jodid (PI), därefter utvärderades apoptos med flödescytometri. Tidiga apoptotiska, sena apoptotiska och nekrotiska celler identifieras som Annexin V+/PI-, Annexin v+/PI+, respektive Annexin v-/PI+. Representativa flödescytometridiagram (med 10 000 händelser inspelade) av UV-exponerade Jurkat T-celler med 350 nm-lampor visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efferocytosis är en anti-inflammatorisk process där makrofager tydliga apoptotiska celler och skräp samt producera flera anti-inflammatoriska mediatorer9,10,11,12,16 ,18. Flera modeller av efferocytosis har gett insikt i hur makrofage är en kritisk cell i resolutionen av inflammation6,7. Nyligen, utvecklingen av kroniska lungsjukdomar har förknippats med defekter i efferocytosis8,9,15,16,17. Det är dock för närvarande oklart om exponering för luftföroreningar såsom O3, resulterar i defekter i efferocytosis. Detta protokoll möjliggör utvärdering av alveolära makrofagefferocytos efter O3 exponering. Det kvantifierar också efferocytosis in vivo med hjälp av ljusmikroskopi och möjliggör mätning av efferocytosis i samband med lung mikromiljön, utan ex vivo manipulationer eller dyra fluorescerande färgämnen. Även om detta protokoll utförs i samband med O3 exponering, kan flera modeller av lunginflammation och skada användas med detta protokoll för att utvärdera alveolära makrofage efferocytos.
Fördelar med denna metod över befintliga metoder är dess förmåga att analysera alveolära makrofager i samband med fysiologiska miljö. Ex vivo-analys av alveolära makrofager inkluderar plätering och inkubering med apoptotiska celler. Plätering alveolära makrofager kan inducera både fysiologiska och genomiska förändringar som kan förändra efferocytosis28,29,30. Dessutom, i lungan, alveolära makrofager finns i en mikromiljö som innehåller tensid och komponenter i lungan foder vätska som är kända för att påverka makrofagfunktion31,32,33, 34,35. Vår metod gör att efferocytosis mätningar i lungan utan ex vivo manipulationer, som är mer fysiologiskt relevanta. Framtida tillämpningar av detta protokoll kan leda till mer djupgående studier om hur lung mikromiljön kan förändra alveolära makrofagen efferocytos.
En kritisk komponent i detta protokoll är generering av apoptotiska celler för utvärdering av alveolära makrofagen efferocytos. Detta innebär att optimera den korrekta UV-exponeringsnivån för inducera apoptos, inte nekros. Vårt protokoll använder UV-crosslinker med 254 nm våglängd emissions lökar och en exponeringsnivå på 60 mJ/cm2. Den UV-lampa val är avgörande för att producera apoptos, inte nekros. 350 nm UV-lampor är utmärkta för protein membran cross-linking och sterilisering men misslyckas med att inducera apoptos35,36,37. Ett exempel dot Plot av Jurkat T-celler utsätts för 60 mJ/cm2 med 350 nm lökar visas i figur 4 med en signifikant ökning av sena apoptotiska och nekrotiska celler. Dessutom använder protokollet en 4 h inkubering efter UV-exponering. För att optimera denna del av protokollet undersökte vi tidigare olika inkubationstider och fann att 1,5 och 2 h inkubering efter exponering endast gav cirka 40% apoptos, med ett efferocytiskt index på mindre än 5% (data ej visad). Baserat på aktuell litteratur, ~ 70%-80% totalt apoptotiska celler är tillräckliga för att mäta efferocytosis38.
En begränsning av detta protokoll är att den undersöker det efferocytiska svaret hos alla makrofager i luftrummet efter exponering för FA eller O3 och inte särskiljer vävnads residenta makrofager från rekryterade makrofager. Den lung hemvist makrofag kallas alveolär makrofage härstammar från foster levern, medan rekryterade makrofager härrör från ett blodburna embryonala ursprung. Vid skada kan lungan ha en mycket heterogen makrofagpopulation med unik genetik och uttryck för cellytmarkörer28,29,30,31,32, 33,34,35. Det är känt att den immunologiska reaktionen och funktionen hos dessa makrofagpopulationer är olika; emellertid, nyare studier har visat att vävnaden bosatt makrofage har ett större efferocytic svar jämfört med rekryterade makrofager29,30,31. Bestämning av efferocytisk respons från vävnads residenta makrofager jämfört med rekryterade makrofager kan bedömas med det aktuella protokollet. emellertid, den makrofagpopulationer måste renas med FACS och pläterade på diabilder för analys. Dessutom, detta protokoll endast bedömer alveolära makrofage efferocytic funktion i en stam av inavlade, kommersiellt tillgängliga möss. Det har tidigare rapporterats att olika stammar av möss visar olika svar på O3 exponering, inklusive lunginflammation39,40. Därför, det kan finnas skillnader i alveolära makrofagefferocytos baserat på den stam som undersökts. Detta är en variabel som bör övervägas när du utför denna in vivo-analys.
Sammanfattningsvis tillåter det protokoll som beskrivs ovan utvärderingen av alveolära makrofage efferocytos in vivo. Detta protokoll är kostnadseffektivt och enkelt, vilket gör det till ett test som kan utnyttjas i stor utsträckning. Dessutom, denna metod kan tillämpas på många modeller av lungskada och/eller inflammation för att öka förståelsen för hur olika pulmonella förolämpningar kan förändra makrofagen efferocytos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie finansieras av hälsoeffekter Institute Walter A. Rosenblith Award och NIEHS R01ES028829 (till K. M. G). Vi vill tacka Dr Dianne Walters (Institutionen för fysiologi, ECU) för hennes hjälp med att få representativa bilder av alveolära makrofager.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
References
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
