Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vivo-vurdering af alveolær makrofag-Efferocytose efter ozoneksponering

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 2Research Triangle Park, National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

Dette manuskript beskriver en protokol til bestemmelse af, hvorvidt udsættelse for ozon, et kriterium luftforurenende stof, hæmmer alveolær makrofag efferocytose in vivo. Denne protokol udnytter almindeligt anvendte reagenser og teknikker og kan tilpasses til flere modeller af lungeskade til at bestemme virkninger på alveolær makrofag efferocytose.

Abstract

Ozon (O3) er et kriterium luftforurenende stof, der forværrer og øger forekomsten af kroniske lungesygdomme. O3 eksponering er kendt for at inducere lungebetændelse, men der vides ikke meget om, hvordan eksponeringen ændrer processer, der er vigtige for opløsningen af inflammation. Efferocytose er en afviklingsproces, hvor makrofager phagocytize apoptotiske celler. Formålet med denne protokol er at måle alveolære makrofag-efferocytose efter O3-induceret lungeskade og inflammation. Der er beskrevet flere metoder til måling af efferocytose; de fleste kræver dog ex vivo manipulationer. Beskrevet i detaljer her er en protokol til at måle in vivo alveolær makrofag efferocytose 24 h efter O3 eksponering, som undgår ex vivo manipulation af makrofager og fungerer som en simpel teknik, der kan bruges til præcist at repræsentere perturbationer i denne afviklingsproces. Protokollen er en teknisk ikke-intensiv og relativt billig metode, der involverer hele kroppen O3 indånding efterfulgt af orofaryngeal aspiration af apoptotiske celler (dvs., Jurkat T celler) under generel anæstesi. Alveolær makrofag efferocytose måles derefter ved let mikroskopi evaluering af makrofager indsamlet fra bronalveolær (BAL) skylning. Efferocytose måles endelig ved at beregne et efferocytisk indeks. Tilsammen kvantificerer de skitserede metoder efferocytisk aktivitet i lungerne in vivo og tjener også til at analysere de negative sundhedsmæssige virkninger af O3 eller andre inhalerede fornærmelser.

Introduction

Lungerne er konstant udsat for miljømæssige fornærmelser, herunder luft partikler, vira, bakterier, og oxidant gasser, der udløser lungebetændelse1,2,3. Disse fornærmelser kan kompromittere gasudveksling og fremkalde irreversibel vævsskade4,5. Alveolære makrofager, som udgør ca. 95% af de immunceller, der findes i murine og humane lunger ved homøostase, er kritiske regulatorer af lungebetændelse efter miljømæssige fornærmelser1,2, 3,4,5. Alveolære makrofager er afgørende i værts forsvaret ved fagocyterende og eliminere patogener. For nylig har alveolære makrofager vist sig at fremme vævs homøostase og opløsningen af inflammation gennem efferocytose6,7. Efferocytose er en Fagocytisk proces, hvor makrofager opsluge og eliminere apoptotiske celler8,9,10. Efferocytose resulterer også i produktionen af mediatorer (dvs. Il-10, TGF-β, PGE2, og nitrogenoxid), der yderligere forstærker processen, hvilket resulterer i opløsningen af inflammation9,10,11 ,12,16,18. Denne proces er nødvendig for at forebygge sekundær nekrose og fremme vævs homøostase12,13,14. Flere undersøgelser har forbundet nedsat efferocytose med forskellige kroniske lungesygdomme, herunder astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, og idiopatisk pulmonal fibrose8,9,15, 16,17.

O3 er et kriterium luftforurenende stof, der forværrer og øger forekomsten af kroniske lungesygdomme19,20,21. O3 inducerer lungebetændelse og-skade og vides at forringe alveolær makrofag fagocytose af bakterielle patogener22,23. Det er imidlertid ukendt, om O3 hæmmer alveolær makrofag efferocytose. Undersøge O3-induceret ændringer i alveolær makrofag efferocytose vil give potentielle indblik i, hvordan eksponering kan føre til kronisk lungesygdom incidens og eksacerbation. Beskrevet nedenfor er en simpel metode til at evaluere alveolær makrofag efferocytose i lungerne hos hunmus efter akut O3 eksponering.

Den skitserede metode besidder flere fordele i forhold til andre efferocytose protokoller almindeligvis anvendes i marken ved at eliminere brugen af dyre fluorescerende farvestoffer, omfattende flow cytometri målinger, og ex vivo manipulation af alveolære makrofager24 ,25. Desuden, denne protokol foranstaltninger alveolær makrofag efferocytose i forbindelse med lunge mikromiljø, som kan påvirke makrofag funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i East Carolina University.

1. ozon (O3) og filtreret luft eksponering (dag 1)

  1. Der må højst være 12 kvindelige C57BL/6J-mus, 8-12 uger gamle, i et stålbur (med 12 separate rum) med trådnetlåg i et O3 -eksponerings kammer.
  2. Placer termometret i eksponerings kammeret med buret for nøjagtigt at registrere temperatur og fugtighed.
  3. Tænd for den ilt og ultraviolet (UV) lys, der er fastgjort til apparatet.
    Bemærk: reguleret luftmængde (> 30 luft Skift/h) med kontrolleret temperatur (22-23 °C) og relativ luftfugtighed (45%-50%) er fremstillet af O3 apparatet. O3 genereres af systemet i eksponerings kammeret ved at instruere 100% ilt gennem en UV-lysgenerator og derefter blande med en filtreret lufttilførsel.
  4. Juster O3 koncentrationen til 1 ppm og regelmæssigt rekord o3 niveauer hver 10 min for 3 h. kontinuerligt overvåge temperatur og fugtighed af kammer luft, som er O3 koncentration med en UV-lys fotometer.
    Bemærk: filtrerede luft eksponeringer udføres i et lignende apparat med kun en filtreret lufttilførsel, der strømmer gennem eksponerings kammeret.
  5. Returner dyrene til deres respektive bure med sengetøj, mad og vand ad libitum efter 3 timer af O3/filtreret luft eksponering.

2. forberedelse af Jurkat T cellelinje (dag 2)

Bemærk: alle procedurer skal udføres i et biologisk sikkerhedskabinet i klasse II.

  1. Kultur Jurkat T celler i 24 mL basal cellekulturmedium + 10% FBS + 5% penicillin/streptomycin ved 37 °C + 5% CO2 (tabel af materiale). Jurkat T celler er en suspension cellelinje, der kan opretholdes gennem passaging 1:6-1:8 i præ-varmet dyrkning medier hver 3 dage. Må ikke rystes.
  2. For at forberede apoptotiske celler, dyrke dem til 90% konfluency i hver kolbe (som tager 3-4 dage at opnå efter passaging). Til denne undersøgelse skal du bruge celler fra fem T75 kolber for at få det tilstrækkelige antal celler, der anvendes i denne protokol.
    Bemærk: en flydende-kolbe indeholder ca. 20-24 millioner celler.
  3. Pipette celler (som er hele kolben) fra hver kolbe (ca. 24 mL) og overfører celler til et sterilt 50 mL konisk rør ved hjælp af en serologisk pipette. Brug flere koniske rør til flere kolber.
  4. Tæl celler ved at fjerne en 11 μL alikvot celler fra 50 mL konisk slange og bland med 11 μL trypan og et blå plet og pipettere 11 μL på hemocytometer-slides.
  5. Indsæt slide i en automatiseret celle tæller, og Registrer antallet af levende celler for at beregne det samlede celleantal i hver kolbe ved at multiplicere antallet af levende celler med 24, da hver kolbe indeholder 24 mL medier.
  6. Centrifuger cellesuspensionen ved 271 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) til pellet celler.
  7. Supernatanten kasseres ved aspiration, og celle pellet opslæmmes i medierne for at opnå 3,0 x 106 celler pr. ml.
  8. Aliquot 5 mL celler i 100 mm x 20 mm vævskultur retter (ca. ni retter vil blive anvendt; den samlede mængde af celler i hver skål skal være ~ 15 x 106).
  9. Brug en skål til kontrol/ikke eksponeret, og de resterende retter vil blive udsat for UV.
  10. Indstil UV-krydsbinderens til det korrekte energi niveau, tryk på knappen energi, og indtast "600" ved hjælp af det numeriske tastatur, som maskinen vil læse som 600 μj/cm2 x 100.
    Bemærk: UV-kryds linker energienheder er i μJ/cm2 x 100; Derfor, for at opnå 60 millijoules/cm2, konvertere enheder til at matche UV-kryds linker.
  11. Irradiate alle retter med celler, ikke inklusive kontrol, ved 60 millijoules (mJ)/cm2 ved hjælp af UV-kryds linker. Fjern det øverste dæksel af vævskultur retterne under UV-eksponering, da UV-lys ikke vil trænge ind i plastikdækslet.
  12. Alle retterne i en cellekultur inkubator, herunder ueksponeret kontrol, inkuberes ved 37 °C ved 5% CO2 i 4 timer.
  13. Bekræft apoptose ved flowcytometri ved hjælp af et apoptose-analyse detektionssæt, der indeholder bilagI V og propidium kaliumiodid (PI) (markører for apoptose og nekrose) efter 4 h inkubation, i fabrikantens anvisninger26 . 27.
    Bemærk: irradiating jurkat T celler i UV-kryds linker på et energi niveau på 600 μj/cm2, efter en 4 h inkubation vil føre til ≥ 75% af apoptotiske (både tidlige og sene) celler, der har mere tidlig apoptotisk fænotype end den sene apoptotiske fænotype. Dette gør det lettere for alveolære makrofager at genkende dem og opsluge som deres membraner er kompromisløs, i modsætning til sene apoptotiske celler, fører til et højere efferocytisk indeks og mere præcis billeddannelse af alveolær makrofag efferocytose i dette studie.
    1. Pool 333 μL (1 x 106 celler) af Jurkat T celler fra flere retter (både "ingen UV" og "UV-eksponeret") sammen til brug for kompensation analyse rør.
    2. Aliquot 333 μl jurkat T celler i en uplettet, tilstillede V enkelt bejdset, pi enkelt bejdset, ingen UV-kontrol, og 600 μj/cm2 UV-eksponeret mærket flow flowcytometri rør.
    3. Centrifugerør ved 188 x g i 5 min ved RT og dekanteres supernatanten.
    4. Vask cellerne ved at resuspendere i 500 μL kold, 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS).
    5. Centrifugerings-og pellet celler ved 188 x g i 5 minutter ved rt. kassér supernatanten efter centrifugering.
    6. Forbered 400 μL 1x bindings buffer pr. flow slange ved at fortynde 10x bindings buffer med destilleret vand, mens cellerne centrifugerer.
    7. Forbered bilagI V og PI inkubations reagens (100 μL pr. prøve/tube) pr. fabrikantens anvisninger.
    8. Supernatanten dekommes efter centrifugering, og alle rør resuspenderes forsigtigt i 400 μL 1x bindings buffer, hvorefter 100 μL af bilagin V inkubations reagens tilsættes til hvert prøveglas. Endelig tilsættes 100 μL bilagin V enkelt bejdser og PI enkelt pletten til deres respektive rør, men tilsæt ikke noget ud over 1x binding buffer til det ufarvede rør.
    9. Inkubér i mørket i 15 minutter ved RT.
    10. Centrifuger alle celler ved 188 x g i 5 minutter ved RT og dekanteres supernatant.
    11. Resuspension celler i 400 μL af 1x binding buffer, derefter analysere prøver for apoptose af flow cytometry. Saml mindst 10.000 hændelser pr. tube for at give nøjagtig gengivelse af farvning.
  14. Kombiner alle de bestrålede celler fra retterne til en 50 mL koniske slange-og pellet celler ved centrifugering ved 271 x g i 5 minutter ved rt.
  15. Supernatanten fjernes fra røret ved aspiration og gensuspension af cellerne i 24 mL steril fosfatbuffer (PBS) og pellet celler ved centrifugering ved 271 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  16. Supernatanten fjernes fra røret ved aspiration og resuspension af celler i den mængde PBS, der anvendes til dosering af mus, som er godkendt af IACUC. Den anvendte dosis er mellem 5-10 x 106 celler/50 μl pr. mus; Derfor, for 10 mus, resuspension i 500 μL (antal celler i hver dosis varierer afhængigt af hvor mange celler der dyrkes til bestråling).
    Bemærk: makeup mindst to ekstra doser til at højde for enhver væske, der kan holde sig til siderne af pipettespidsen resulterer i tab af celler.

3. murine orofaryngeale instillation af apoptotiske celler (dag 2)

  1. Forbered doserings inokulum af apoptotiske celler ved hjælp af en P200 pipette før bedøvelse af mus for at fremskynde proceduren. Ifølge de institutionelle retningslinjer anvendes et volumen på 50 μL, der indeholder ca. 5-10 x 106 celler, til orofaryngeal (o.p.) instillation for at sikre de bedste resultater.
  2. Anæstetize mus i et klart kammer med 2% isofluran ved en strømningshastighed på 1 L/min eller i henhold til de institutionelle retningslinjer. Anæstetize en til to mus ad gangen; antallet bestemmes af det komfort niveau af eksperimententer. Observere vejrtrækning mønster og bekræft dybe vejrtrækninger er synlige med 2 – 3 s tæller mellem vejrtrækninger. Check for dybden af anæstesi ved manglende reaktion på tåen knivspids.
  3. Placer musen i en semi-Recumbent liggende position. Brug en kirurgisk snor bundet mellem pinde på en skrå akryl ark bord til at suspendere af maxillær incisors.
  4. Brug et par stump ikke-ridged pincet, tag let fat i og træk i muse tungen. Indstill de apoptotiske celler i mundhulen med en P200 pipette. Dosering er vellykket, når musene laver en knitrende støj 1 – 2 s efter at have givet dosis.
    Bemærk: pas på, at du ikke inducerer traumer enten tungen eller orofarynx før den apoptotiske celle instillation.
  5. Med en dykket finger blokerer du forsigtigt næsen, indtil musen inhalerer, mens tungen trækkes tilbage. Dække næsen indtil ingen væske er synlig i mundhulen og musen har taget to eller flere inhalationer.
    Bemærk: da mus er forpligte næse ånder, der dækker næsen hjælper med at sikre, at musen vil inhalere de apoptotiske celler i lungerne.
  6. Fjern musen fra inokulering Board og returnere den til buret for at tillade inddrivelse fra anæstesi. Placer musen på ryggen for at forhindre strøelse eller snavs i at blokere Nares under revovery.
  7. Vent 90 min efter musen genopretter fra anæstesi at tillade alveolære makrofager at opsluge tilstrømning af apoptotiske celler efter alle musene har vækket fra anæstesi. Typisk, opvågnen efter anæstesi vil tage 1 – 2 min, som ikke bør påvirke udfaldet/timing af instillation.

4. bronalveolær skylning væske indsamling og behandling (dag 2)

  1. Euthanize hver mus per institutionelle retningslinjer 90 min efter musen er vågnet op fra anæstesi fra dosering med apoptotiske celler. Her anvendes en dødelig injektion af ketamin og xylazin (henholdsvis 90 mg/kg og 10 mg/kg) efterfulgt af exciserende mellem gulvet.
    Bemærk: dette tidspunkt giver tilstrækkelig tid til alveolære makrofager til at fornemme og opsluge apoptotiske celler38.
  2. Vejer alle mus (g) på skalaen og plade Lodderne. Brug kropsvægten til at beregne BAL volumen (26,25 mL/kg legemsvægt).
  3. Placer mus på ryggen og spray 70% ethanol til at sterilisere brystet og halsen område.
  4. Lav en 2 "langsgående snitlige under brystbenet langs hele ventrale side med kirurgisk saks, og mens du holder brystbenet med pincet, Nick membranen for at tillade lungerne at falde tilbage i brysthulen.
  5. Skær sideværts langs siderne af ribburet for at give lungerne mere plads til at ekspandere, når du skyller, og fold derefter brysthulen tilbage med pincet.
  6. Lav en 1 "lodret skåret op langs Vaskulaturen gennem halsen for at udsætte luftrøret.
  7. Brug to pincet til at trække muskler og væv ud af luftrøret og udsætte det. Undgå yderligere potentiel blødning og skære luftrøret, da det er omgivet af vaskulatur, langsgående muskler, og bindevæv.
  8. Brug en nål til at lave en spalte i luftrøret (ca. en fjerdedel af afstanden ned fra hovedet) og Indsæt en kanyle (18 G x 1,25 ") med en sprøjte, der er fyldt med 1x PBS (26,25 mL/kg legemsvægt, ~ 0,7-1,0 mL i en 8-10 uge gammel kvindelig C57Bl/6J mus), der er Hea.
  9. Skub volumen PBS ind i lungerne langsomt for at få lungerne til at puste derefter, træk volumen tilbage ud i sprøjten. Gentag denne proces i alt 3 gange.
  10. Saml den samlede skylning væske fra hver specifik mus i et 15 ml rør.
  11. Der centrifugeres bronalveolære skylning ved 610 x g i 6 minutter ved 4 °c, og supernatanten opsamles i et 1,5 ml rør og fryses ved-80 °c. Pellet repræsenterer celler fra bronalveolære rum.
  12. Fjern resterende røde blodlegemer i indsamlet BAL væske ved at tilføje 1 mL ACK RBC lysis buffer til celle pellet, så vortex godt og lyse i 1 min på is. Tilsæt derefter 4 mL PBS for at stoppe lysisreaktionen.
  13. Pellet celler ved centrifugering ved 610 x g i 6 min ved 4 °c og aspirere supernatanten med en vakuum aspirator.
  14. Resuspension af celler i 1 mL 1x PBS + 10% FBS til hver BAL prøve slange. Tæl celler på et hemocytometer til kvantificering af de samlede luftrums celler fra hver prøve (ingen trypan og et blå). Der centrifugeres 120 μL af hver prøve på slides ved 56 x g i 3 min. ved hjælp af medium acceleration og en cytocentrifuge. Tør diasene natten over.

5. beregning af alveolært makrofag-efferocytisk indeks (dag 3)

  1. Plette slides med hematoxylinlegemer og eosin for at give mulighed for beregning af både efferocytiske og differentielle celletal, med mindst 200 celler tælles fra hvert dias.
  2. Se slides under en lys-felt indstilling på et biologisk mikroskop (en 20x eller 40x mål vil fungere bedst).
  3. Beregn det efferocytiske indeks baseret på forholdet mellem antallet af alveolære makrofager, som fagocytoserede apoptotiske Jurkat T celler til alveolære makrofager uden apoptotisk celle optagelse ud af en total 200 makrofager på en celle differentialslide. Konverter forholdet til en procentdel for data input. Brug følgende ligning:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

O3 eksponering er kendt for at inducere lungebetændelse og-skade, og efferocytose er nødvendig for at opretholde vævs homøostase. C57BL/6J hunmus blev udsat for filtreret luft (FA) eller 1 ppm O3 for 3 h og nekropsied 24 h efter eksponering for at undersøge lungebetændelse og tilskadekomst. O3-udsatte mus viste en signifikant stigning i makrofager og neutrofiler i luftrummet sammenlignet med FA Control Group (figur 1a, B). Derudover havde O3-udsatte mus en signifikant stigning i bal protein, en markør for alveolær epitelial barriere dysfunktion 24 h efter eksponering (figur 1C).

At afgøre, om O3-induceret lungebetændelse er forbundet med defekter i alveolær makrofag efferocytose in vivo, C57BL/6j hunmus blev indpodet med apoptotiske jurkat T celler via orofaryngeale aspiration 24 h post-FA eller post-O3 eksponering. Apoptose i Jurkat T-celler blev bekræftet af flowcytometri før dosering, og der var en signifikant stigning i tidligt (bilagin V+ pi- og sent (bilagin v+ og PI+) apoptotiske celler (figur 2a, B). Eksponeringsniveauet og inkubationstiden resulterede i gentagne resultater af ~ 75% apoptotiske jurkat T-celler. Et forstørret billede af, hvad der blev identificeret som en efferocytisk makrofag, er vist i figur 3A. Efferocytiske makrofager blev identificeret som makrofager, der havde opslugt en Jurkat T-celle (indikeret med sorte pile) sammenlignet med almindelige alveolære makrofager (indikeret med hvide pile) (figur 3B). Når alveolær makrofag efferocytose blev vurderet ved hjælp af forsøgsprotokollen, var der et statistisk signifikant fald i det efferocytiske indeks for den O3-eksponerede gruppe sammenlignet med FA-kontrollerne (figur 3B, C). Disse data indikerer, at O3-induceret lungebetændelse er forbundet med nedsat clearance af apoptotiske celler, som kan forlænge lungeskade og inflammation.

Figure 1
Figur 1: O3 eksponering inducerer lungebetændelse og tilskadekomst. C57BL/6J hunmus blev udsat for filtreret luft (FA) eller 1 ppm O3 for 3 h. 24 h efter eksponering, mus blev nekropsied at analysere lungebetændelse og skade (n = 6 pr. gruppe). (A) bronalveolære skylning (bal) celle forskelle blev beregnet, så epitelial (EPI), eosinofile (EOS), lymfocytter (lymfeknuder), makrofager (Mɸ), og neutrofiler (PMN) blev identificeret med mindst 200 celler tælles fra hver slide. B) et repræsentativt billede af celle forskellene. C) totalt protein i modvæsken. Data udtrykkes som ± SEM (* * p < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: bekræftelse af UV-induceret apoptose i Jurkat T-celler. Jurkat T celler blev udsat for UV (60 mJ/cm2) ved hjælp af en UV-kryds linker (model 1800). Efter UV-eksponering blev Jurkat T-celler inkuberet ved 37 °C med 5% CO2 for 4 h. Efter inkubation blev jurkat T-cellerne plettet med bilagI V og propidium kaliumiodid (PI), og apoptose blev evalueret af flowcytometri. Tidlige apoptotiske, sene apoptotiske og nekrotiske celler identificeres som annekset i henholdsvis V+/pi-, bilagI v+/pi+, bilagin v-/pi+. Repræsentative flow cytometri scatter plots (med 10.000 registrerede hændelser) af (A) ikke-eksponerede jurkat t-celler og (B) UV-eksponerede jurkat t-celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: O3 eksponeringen nedsætter alveolær makrofag efferocytose. C57BL/6J hunmus blev udsat for filtreret luft (FA) eller 1 ppm O3 for 3 h. 24 h efter eksponering, mus var orofaryngeally indpodet med ca. 5 x 106 apoptotiske jurkat T celler. 1,5 h efter instillation blev bronalveolær skylning (BAL) udført, og det efferocytiske indeks blev beregnet i BAL makrofager ved let mikroskopi efter optælling 200 makrofager (n = 11 pr. gruppe). A) repræsentativt billede af et efferocytisk makrofag. B) identifikation af alveolære makrofager (hvide pile) og efferocytisk makrofag (sorte pile) efter eksponering af FA eller O3 . C) beregning af det efferocytiske indeks efter eksponering for FA eller O3 (* * * p < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: suboptimal Jurkat T Cell apoptose ved hjælp af 350 nm matteret pærer. Jurkat T-celler blev bestrålet ved hjælp af UV-kryds linker i 10 min og inkuberet ved 37 °C ved 5% CO2 for 1 time. Efter UV-eksponering blev Jurkat T-celler inkuberet ved 37 °C med 5% CO2 for 4 h. Efter inkubation blev jurkat T-cellerne plettet med bilagin V og propidium kaliumiodid (PI), og apoptose blev derefter evalueret af flowcytometri. Tidlige apoptotiske, sene apoptotiske og nekrotiske celler identificeres som annekset i henholdsvis V+/pi-, bilagI v+/pi+og bilagI v-/pi+. Repræsentative strømnings cytometri-parceller (med 10.000 registrerede hændelser) af UV-eksponerede Jurkat T-celler med 350 nm-pærer vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efferocytose er en antiinflammatorisk proces, hvor makrofager klar apoptotiske celler og snavs samt producere flere anti-inflammatoriske mediatorer9,10,11,12,16 ,18. Flere modeller af efferocytosis har givet indsigt i, hvordan makrofag er en kritisk celle i opløsningen af inflammation6,7. For nylig, progression af kroniske lungesygdomme har været forbundet med defekter i efferocytose8,9,15,16,17. Det er imidlertid i øjeblikket uklart, om udsættelse for luftforurenende stoffer som O3, resulterer i defekter i efferocytose. Denne protokol muliggør evaluering af alveolær makrofag efferocytose efter O3 eksponering. Det kvantificerer også efferocytose in vivo ved hjælp af lys mikroskopi og tillader måling af efferocytose i forbindelse med lunge mikromiljøet, uden ex vivo manipulationer eller dyre fluorescerende farvestoffer. Selv om denne protokol er udført i forbindelse med O3 eksponering, flere modeller af lungebetændelse og skade kan anvendes med denne protokol til at evaluere alveolær makrofag efferocytose.

Fordele ved denne metode over eksisterende metoder er dens evne til at analysere alveolære makrofager i forbindelse med fysiologiske miljø. Ex vivo-analyse af alveolære makrofager omfatter plating og inkubation med apoptotiske celler. Plating alveolære makrofager kan inducere både fysiologiske og genomiske forandringer, der kan ændre efferocytose28,29,30. I lungerne findes der desuden alveolære makrofager i et mikromiljø, som indeholder overfladeaktivt stof og komponenter i lunge slimhinden, som vides at påvirke makrofagfunktionen31,32,33, 34af35. Vores metode tillader efferocytose målinger i lungerne uden ex vivo manipulationer, som er mere fysiologisk relevant. Fremtidige anvendelser af denne protokol kan føre til mere dybtgående undersøgelser af, hvordan lunge mikromiljøet kan ændre alveolær makrofag efferocytose.

Et kritisk element i denne protokol er generering af apoptotiske celler til evaluering af alveolær makrofag-efferocytose. Dette indebærer at optimere den korrekte UV-eksponering niveau for at inducere apoptose, ikke nekrose. Vores protokol bruger UV-kryds linker med 254 nm bølgelængde emission pærer og et eksponeringsniveau på 60 mJ/cm2. UV-pære valg er afgørende for at producere apoptose, ikke nekrose. 350 nm UV-pærer er fremragende til protein membran Cross-linking og sterilisering, men undlader at inducere apoptose35,36,37. Et eksempel dot plot af Jurkat T celler udsat for 60 mJ/cm2 med 350 nm pærer er vist i figur 4 med en signifikant stigning i sene apoptotiske og nekrotiske celler. Desuden, protokollen bruger en 4 h inkubation post-UV-eksponering. For at optimere denne del af protokollen, vi tidligere undersøgt forskellige inkubationstider og fandt, at 1,5 og 2 h inkubation efter eksponering kun gav ca 40% apoptose, med et efferocytisk indeks på mindre end 5% (data ikke vist). Baseret på Aktuel litteratur, ~ 70%-80% samlede apoptotiske celler er tilstrækkelige til måling af efferocytosis38.

En begrænsning til denne protokol er, at den undersøger den efferocytiske respons fra alle makrofager i luftrummet efter FA-eller O3 -eksponeringen og ikke skelner mellem de fastboende makrofager og de indanterede makro phager. Det lunge residente makrofag kaldet alveolær makrofag stammer fra føtal leveren, hvorimod rekrutterede makrofager stammer fra en blod båret embryonal oprindelse. Ved skade kan lungerne have en meget heterogen makrofag population med unik genetik og ekspression af celleoverflade markører28,29,30,31,32, 33,34,35. Det vides, at den immunologiske respons og funktion af disse makrofag populationer er forskellige; Nylige undersøgelser har imidlertid indikeret, at vævs Resident makrofag har et større efferocytisk respons sammenlignet med rekrutterede makrofager29,30,31. Bestemmelse af den efferocytiske respons af vævs residente makrofager vs. rekrutterede makrofager kan vurderes med den nuværende protokol; men makrofag populationer skal renses ved FACER og belagt på dias til analyse. Desuden, denne protokol kun vurderer alveolær makrofag efferocytisk funktion i én stamme af indavlede, kommercielt tilgængelige mus. Det er tidligere blevet rapporteret, at forskellige stammer af mus viser forskellige reaktioner på O3 eksponering, herunder lungebetændelse39,40. Der kan derfor være forskelle i alveolær makrofag-efferocytose baseret på den undersøgte stamme. Dette er en variabel, der bør overvejes ved udførelse af denne in vivo-analyse.

Konklusionen er, at den ovenfor beskrevne protokol gør det muligt at evaluere alveolær makrofag-efferocytose in vivo. Denne protokol er omkostningseffektiv og enkel, hvilket gør det en analyse, der kan udnyttes bredt. Desuden kan denne metode anvendes til talrige modeller af lungeskade og/eller inflammation for at øge forståelsen af, hvordan forskellige pulmonale fornærmelser kan ændre makrofag efferocytose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse er finansieret af Health Effects Institut Walter A. Rosenblith Award og NIEHS R01ES028829 (til K. M. G). Vi vil gerne takke Dr. Dianne Walters (Institut for fysiologi, ECU) for hendes hjælp til at opnå repræsentative billeder af alveolære makrofager.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
  2. Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
  3. Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
  4. Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
  5. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
  6. Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
  7. Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
  8. Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
  9. Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
  10. Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
  11. Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
  12. O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
  13. Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
  14. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  15. Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
  16. Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
  17. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
  18. Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
  19. Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
  20. Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
  21. Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
  22. Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
  23. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  24. Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
  25. Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
  26. Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
  27. Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
  28. Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
  29. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  30. Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
  31. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
  32. Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
  33. Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
  34. Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
  35. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  36. Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
  37. Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
  38. Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
  39. Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
  40. Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).

Tags

Immunologi og infektion luftforurening ozon lunge betændelse alveolær makrofag efferocytose
In vivo-vurdering af alveolær makrofag-Efferocytose efter ozoneksponering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hodge, M. X., Reece, S. W.,… More

Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter