Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung, ob die Exposition gegenüber Ozon, einem Kriterium des Luftschadstoffs, die Alveolarmakrophagen-Efferozytose in vivo beeinträchtigt. Dieses Protokoll verwendet häufig verwendete Reagenzien und Techniken und kann an mehrere Modelle von Lungenverletzungen angepasst werden, um Die Auswirkungen auf die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose zu bestimmen.
Abstract
Ozon (O3) ist ein Kriterium Luftschadstoff, das die Inzidenz von chronischen Lungenerkrankungen verschlimmert und erhöht. O3 Exposition ist bekannt, lungenentzündung zu induzieren, aber wenig ist darüber bekannt, wie Exposition verändert Prozesse wichtig für die Auflösung von Entzündungen. Efferozytose ist ein Auflösungsprozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen phagozytisieren. Der Zweck dieses Protokolls ist es, alveolare Makrophagen-Efferozytose nachO3-induziertenLungenverletzungen und Entzündungen zu messen. Zur Messung der Efferozytose wurden mehrere Methoden beschrieben; die meisten erfordern jedoch Ex-vivo-Manipulationen. Beschrieben im Detail hier ist ein Protokoll zur Messung in vivo alveolar Makrophagen-Efferozytose 24 h nach O3-Exposition, die Ex-vivo-Manipulation von Makrophagen vermeidet und als einfache Technik dient, die verwendet werden kann, um Störungen in Auflösungsprozess. Das Protokoll ist eine technisch nicht-intensive und relativ kostengünstige Methode, die eine Ganzkörper-O3-Inhalation, gefolgt von oropharyngealer Aspiration von apoptotischen Zellen (d. h. Jurkat-T-Zellen) unter Vollnarkose beinhaltet. Die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose wird dann durch Lichtmikroskopie auswertung von Makrophagen gemessen, die aus Bronchoalveolar (BAL) Lavage gesammelt wurden. Die Efferozytose wird schließlich durch die Berechnung eines efferozytischen Indexes gemessen. Zusammen quantifizieren die skizzierten Methoden die efferozytische Aktivität in der Lunge in vivo und dienen gleichzeitig der Analyse der negativen gesundheitlichen Auswirkungen von O3 oder anderen inhalierten Beleidigungen.
Introduction
Die Lunge ist ständig Umweltbeleidigungen ausgesetzt, einschließlich Luftpartikeln, Viren, Bakterien und oxidativen Gasen, dieLungenentzündungenauslösen 1,2,3. Diese Beleidigungen können den Gasaustausch gefährden und irreversible Gewebeverletzungen induzieren4,5. Alveolar-Makrophagen, die etwa 95% der Immunzellen in murinen und menschlichen Lungen bei Homöostase ausmachen, sind kritische Regulatoren der Lungenentzündung nach Umweltbeleidigungen1,2, 3,4,5. Alveolar Makrophagen sind während der Wirtsabwehr durch Phagozytisierung und Eliminierung von Krankheitserregern unerlässlich. Kürzlich, Alveolar Makrophagen haben gezeigt, gewebeHomöostase und die Auflösung von Entzündungen durch Efferozytose zu fördern6,7. Efferozytose ist ein phagozytischer Prozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen8,9,10verschlingen und eliminieren. Die Efferozytose führt auch zur Herstellung von Mediatoren (d.h. IL-10, TGF-, PGE2und Stickstoffmonoxid), die den Prozess weiter verstärken, was zur Auflösung von Entzündungen9,10,11 ,12,16,18. Dieser Prozess ist notwendig, um sekundäre Nekrose zu verhindern und Gewebehomöostase zu fördern12,13,14. Mehrere Studien haben eine beeinträchtigte Efferozytose mit verschiedenen chronischen Lungenerkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen und idiopathische Lungenfibrose8,9,15, 16,17.
O3 ist ein Kriterium Luftschadstoff, der die Inzidenz von chronischen Lungenerkrankungen verschlimmert und erhöht19,20,21. O3 induziert Lungenentzündung und -verletzung und ist dafür bekannt, alveolare Makrophagenphagozytose von bakteriellen Erregern zu beeinträchtigen22,23. Es ist jedoch nicht bekannt, obO3 die Alveolarmakrophagen-Efferozytose beeinträchtigt. Die Untersuchung vonO3-induziertenVeränderungen bei der Alveolarmakrophagen-Efferozytose wird potenzielle Einblicke in die Frage liefern, wie eine Exposition zu chronischer Inzidenz von Lungenerkrankungen und Verschlimmerung führen kann. Im Folgenden beschrieben ist eine einfache Methode zur Bewertung der alveolären Makrophagen-Efferozytose in der Lunge weiblicher Mäuse nach akuterO3-Exposition.
Die skizzierte Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Efferozytoseprotokollen, die häufig im Feld verwendet werden, indem kostspielige Fluoreszenzfarbstoffe, umfangreiche Durchflusszytometriemessungen und Ex-vivo-Manipulationen von Alveolarmakrophagen eliminiert werden24 ,25. Darüber hinaus misst dieses Protokoll die Alveolarmakrophagen-Efferozytose im Kontext der Lungenmikroumgebung, die die Makrophagenfunktion beeinflussen kann.
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Protocol
Alle Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der East Carolina University genehmigt.
1. Ozon (O3) und gefilterte Luftexpositionen (Tag 1)
- Legen Sie maximal 12 weibliche C57BL/6J-Mäuse, 8-12 Wochen alt, in einen Stahlkäfig (mit 12 separaten Fächern) mit Drahtgitterdeckeln in eine O 3-Belichtungskammer.
- Legen Sie das Thermometer in die Belichtungskammer mit dem Käfig, um die Temperatur und Luftfeuchtigkeit genau aufzuzeichnen.
- Schalten Sie das Sauerstoff- und ULTRAviolette (UV) Licht ein, das am Gerät befestigt ist.
HINWEIS: Geregelter Luftstrom (>30 Luftwechsel/h) mit kontrollierter Temperatur (22-23 °C) und relativer Luftfeuchtigkeit (45%-50%) wird durch dasO-3-Gerät erhalten. O3 wird vom System in der Belichtungskammer erzeugt, indem 100% Sauerstoff durch einen UV-Lichtgenerator geleitet und dann mit einer gefilterten Luftzufuhr vermischt wird. - Stellen Sie die O3-Konzentration auf 1 ppm ein und nehmen Sie regelmäßig O3-Werte alle 10 min für 3 h auf. Überwachen Sie kontinuierlich die Temperatur und Luftfeuchtigkeit der Kammerluft, ebenso wie dieO-3-Konzentration mit einem UV-Lichtphotometer.
HINWEIS: Gefilterte Lufteinwirkungen werden in einem ähnlichen Gerät durchgeführt, wobei nur eine gefilterte Luftzufuhr durch die Belichtungskammer fließt. - Bringen Sie die Tiere nach 3 h O3/gefilterter Luftexposition in ihre jeweiligen Käfige mit Bettwäsche, Nahrung und Wasser ad libitum zurück.
2. Vorbereitung der Jurkat T Zelllinie (Tag 2)
HINWEIS: Alle Verfahren sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt werden.
- Kultur Jurkat T Zellen in 24 ml Basalzellkulturmedium + 10% FBS + 5% Penicillin/Streptomycin bei 37 °C + 5%CO2 (Materialtabelle). Jurkat-T-Zellen sind eine Suspensionszelllinie, die durch Passaging 1:6-1:8 in vorgewärmte Kultivierungsmedien alle 3 Tage aufrechterhalten werden kann. Nicht schütteln.
- Um apoptotische Zellen vorzubereiten, wachsen sie zu 90% Konfluenz in jedem Kolben (was 3-4 Tage dauert, um nach dem Passieren zu erreichen). Verwenden Sie für diese Studie Zellen aus fünf T75-Kolben, um die ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
HINWEIS: Ein Konfluentkolben enthält etwa 20-24 Millionen Zellen. - Pipette-Zellen (das ist der gesamte Kolben) aus jedem Kolben (ca. 24 ml) und übertragen Zellen in ein steriles 50 ml konisches Rohr mit einer serologischen Pipette. Verwenden Sie mehrere konische Rohre für mehrere Kolben.
- Zählen Sie zellen, indem Sie ein 11-L-Aliquot von Zellen aus dem 50 ml konischen Rohr entfernen und mit 11 l Trypan-Blaufleck und Pipette 11 l auf Hämozytometer-Dias mischen.
- Fügen Sie das Dia in einen automatisierten Zellenzähler ein, und erfassen Sie die Anzahl der lebenden Zellen, um die Gesamtzahl der Zellen in jedem Kolben zu berechnen, indem Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit 24 multiplizieren, da jeder Kolben 24 ml Medien enthält.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 271 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zu Pelletzellen.
- Entsorgen Sie den Überstand durch Aspiration und setzen Sie das Zellpellet in den Medien wieder aus, um 3,0 x 106 Zellen pro ml zu erhalten.
- Aliquot 5 ml Zellen in 100 mm x 20 mm Gewebekultur-Gerichte (ca. neun Gerichte werden verwendet werden; die Gesamtmenge der Zellen in jeder Schale sollte 15 x 106betragen).
- Verwenden Sie eine Schale für die Kontrolle / unbelichtet, und die restlichen Gerichte werden UV ausgesetzt werden.
- Stellen Sie den UV-Verkreuzer auf das richtige Energieniveau ein, drücken Sie die Energietaste und geben Sie "600" mit dem Nummernblock ein, das die Maschine als 600 'J/cm2 x 100 ablesen wird.
ANMERKUNG: UV-Vernetzen der Energieeinheiten ist in 2x 100 mm; um 60 Millijoule/cm2zu erreichen, konvertieren Sie daher Einheiten in übereinstimmung mit dem UV-Vernetzen. - Bestrahlen Sie alle Geschirre mit Zellen, ohne die Steuerung, bei 60 Millijoule (mJ)/cm2 mit dem UV-Vernetzen. Entfernen Sie die obere Abdeckung der Gewebekultur-Gerichte während der UV-Exposition, da UV-Licht nicht in die Kunststoffabdeckung eindringen wird.
- Alle Gerichte in einem Zellkultur-Inkubator, einschließlich unbelichteten Kontrollen, bei 37 °C bei 5%CO2 für 4 h inkubieren.
- Bestätigen Sie die Apoptose durch Durchflusszytometrie mit einem Apoptose-Assay-Detektionskit mit Anhang V und Propidiumjodid (PI) (Marker für Apoptose bzw. Nekrose) nach 4 h Inkubation gemäß den Anweisungen des Herstellers26, 27.
ANMERKUNG: Die Bestrahlung von Jurkat-T-Zellen im UV-Vernetzen mit einem Energieniveau von 600 J/cm2führt nach einer 4-h-Inkubation zu 75 % apoptotischen (sowohl frühen als auch späten) Zellen mit einem frühen apoptotischen Phänotyp als der späte apoptotische Phänotyp. Dies erleichtert es Alveolar-Makrophagen, sie zu erkennen und zu verschlingen, da ihre Membranen im Gegensatz zu späten apoptotischen Zellen kompromisslos sind, was zu einem höheren efferozytischen Index und einer genaueren Abbildung der Alveolar-Makrophagen-Efferozytose in dieser Studie führt.- Pool 333 l (1 x 106 Zellen) von Jurkat-T-Zellen aus mehreren Schalen (sowohl "kein UV" als auch "UV-belichtet") zusammen, um für Kompensationsanalyseröhren zu verwenden.
- Aliquot 333 L Jurkat-T-Zellen in einem ungefärbten, Anhang-V-Einzelfleck, PI-Einzelfleck, ohne UV-Kontrolle und 600 -J/cm2 UV-beschriftete, durchsichtige Durchflusszytometrieröhrchen.
- Zentrifugenrohre bei 188 x g für 5 min bei RT und dekantieren den Überstand.
- Waschen Sie Zellen, indem Sie in 500 l kalter, 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) wieder aufsetzen.
- Zentrifugen- und Pelletzellen bei 188 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand nach zentrifugieren.
- Bereiten Sie 400 l 1x Bindungspuffer pro Durchflussrohr vor, indem Sie den 10-fachen Bindungspuffer mit destilliertem Wasser verdünnen, während die Zellen zentrifugieren.
- Erstellen Sie das Inkubationsreagenz von Anhang V und PI (100 l pro Probe/Tube) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Dekantieren Sie den Überstand nach der Zentrifugation und setzen Sie alle Rohre in 400 L 1x Bindungspuffer vorsichtig wieder auf, und fügen Sie dann jedem Probenröhrchen 100 L Annexin-V-Inkubationsreagenz hinzu. Fügen Sie schließlich 100 l Anhang in V einzelfleck und PI-Einzelfleck zu ihren jeweiligen Röhrchen hinzu, fügen Sie aber nichts über den 1x-Bindungspuffer hinaus zum unbefleckten Rohr hinzu.
- Röhren im Dunkeln für 15 min bei RT inkubieren.
- Zentrifugieren Sie alle Zellen bei 188 x g für 5 min bei RT und Dekanatsüberstand.
- Resuspend Zellen in 400 L 1x Bindungspuffer, dann analysieren Proben für Apoptose durch Durchflusszytometrie. Sammeln Sie mindestens 10.000 Ereignisse pro Rohr, um eine genaue Darstellung der Färbung zu ermöglichen.
- Kombinieren Sie alle bestrahlten Zellen aus Geschirr in einem 50 ml konischen Rohr und Pelletzellen durch Zentrifugation bei 271 x g für 5 min bei RT.
- Entsorgen Sie den Überstand aus dem Röhrchen durch Aspiration und Resuspendieren von Zellen in 24 ml steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS) und Pelletzellen durch Zentrifugation bei 271 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entsorgen Sie den Überstand aus der Röhre durch Aspiration und resuspendieren Sie Zellen in der Menge an PBS, die für die Bewesung von Mäusen verwendet wird, die von DER IACUC zugelassen wurden. Die verwendete Dosis liegt zwischen 5-10 x 106 Zellen/50 l pro Maus; daher wird bei 10 Mäusen in 500 l (anzahl der Zellen in jeder Dosis variiert je nachdem, wie viele Zellen zur Bestrahlung kultiviert werden).
HINWEIS: Make-up mindestens zwei zusätzliche Dosen für jede Flüssigkeit, die an den Seiten der Pipette Spitze haften kann, was zum Verlust von Zellen.
3. Murinor-oropharyngeale Instillation von apoptotischen Zellen (Tag 2)
- Bereiten Sie die Inokulumung von apoptotischen Zellen mit einer P200-Pipette vor der Anästhesisierung von Mäusen vor, um das Verfahren zu beschleunigen. Gemäß den institutionellen Richtlinien wird ein Volumen von 50 l, das etwa 5-10 x 106 Zellen enthält, für die oropharyngeale (o.p.) Instillation verwendet, um beste Ergebnisse zu erzielen.
- Anästhesisieren Sie Mäuse in einer klaren Kammer mit 2% Isofluran mit einer Durchflussrate von 1 l/min oder gemäß den institutionellen Richtlinien. Anästhetisieren Sie ein bis zwei Mäuse gleichzeitig; die Zahl wird durch das Komfortniveau des Experimentators bestimmt. Beobachten Sie das Atemmuster und bestätigen Sie, dass tiefe Atemzüge mit 2-3 s Zählungen zwischen den Atemzügen sichtbar sind. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf die Zehenprise.
- Positionieren Sie die Maus in einer halbliegeförmigen Supine-Position. Verwenden Sie eine chirurgische Schnur zwischen Stiften auf einer schrägen Acrylplatte gebunden, um durch die Kieferschneidezähne zu suspendieren.
- Mit einem Paar stumpfer, nicht gerittener Zangen, leicht greifen und ziehen Sie die Mauszunge. Instillieren Sie die apoptotischen Zellen mit einer P200-Pipette in die Mundhöhle. Dosierung ist erfolgreich, wenn die Mäuse ein knisterndes Geräusch 1-2 s nach der Abgabe der Dosis machen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, vor der instillierenden apoptotischen Zelle keine Traumata auf die Zunge oder Oropharynx zu verursachen. - Mit einem Gehandicaptfinger die Nase vorsichtig blockieren, bis die Maus einatmet, während die Zunge eingefahren wird. Bedecken Sie die Nase, bis keine Flüssigkeit in der Mundhöhle sichtbar ist und die Maus zwei oder mehr Inhalationen genommen hat.
HINWEIS: Da Mäuse pflichtpflichtige Nasenatmungsmittel sind, trägt die Abdeckung der Nase dazu bei, dass die Maus die apoptotischen Zellen in die Lunge einatmet. - Entfernen Sie die Maus von der Impftafel und geben Sie sie in den Käfig zurück, um eine Erholung von der Anästhesie zu ermöglichen. Legen Sie die Maus auf den Rücken, um zu verhindern, dass Bettwäsche oder Schutt die Nares während der Revovery blockieren.
- Warten Sie 90 min, nachdem sich die Maus von der Anästhesie erholt hat, um alveolar-Makrophagen den Zustrom von apoptotischen Zellen zu verschlingen, nachdem alle Mäuse aus der Anästhesie erwacht sind. In der Regel dauert das Erwachen nach der Anästhesie 1-2 min, was das Ergebnis/Zeitpunkt der Instillation nicht beeinflussen sollte.
4. Bronchoalveolare Spülflüssigkeitsammlung und -verarbeitung (Tag 2)
- Euthanisieren Sie jede Maus nach institutionellen Richtlinien 90 min, nachdem die Maus aus der Anästhesie aus der Befruchtung mit apoptotischen Zellen aufgewacht ist. Hierbei wird eine tödliche Injektion von Ketamin und Xylazin (90 mg/kg bzw. 10 mg/kg) verwendet, gefolgt von der Exzisierung des Zwerchfells.
HINWEIS: Dieser Zeitpunkt lässt genügend Zeit für Alveolar-Makrophagen zu erkennen und zu verschlingen apoptotische Zellen38. - Wiegen Sie alle Mäuse (g) auf einer Skala und zeichnen Gewichte auf. Verwenden Sie das Körpergewicht, um das BAL-Volumen (26,25 ml/kg Körpergewicht) zu berechnen.
- Legen Sie Mäuse auf den Rücken und sprühen Sie 70% Ethanol, um den Brust- und Nackenbereich zu sterilisieren.
- Machen Sie einen 2" Längsschnitt direkt unterhalb des Brustbeins entlang der gesamten ventralen Seite mit chirurgischer Schere, und während Sie das Brustbein mit Zangen halten, nicken Sie das Zwerchfell, damit die Lunge wieder in die Brusthöhle fallen kann.
- Seitlich entlang der Seiten des Rippenkäfigs schneiden, damit sich die Lunge beim Spülen mehr Raum ausdehnen kann, und dann die Brusthöhle mit Zangen zurückfalten.
- Machen Sie eine 1" vertikale geschnitten entlang Vaskulatur durch den Hals, um die Luftröhre auszusetzen.
- Verwenden Sie zwei Zangen, um Muskeln und Gewebe von der Luftröhre zu ziehen und sie freizulegen. Vermeiden Sie zusätzliche potenzielle Blutungen und Schneiden der Luftröhre, da es von Vaskulatur, Längsmuskeln und Bindegewebe umgeben ist.
- Verwenden Sie eine Nadel, um einen Schlitz in der Luftröhre zu machen (ca. ein Viertel des Abstands vom Kopf) und legen Sie eine Kanüle (18 G x 1,25") mit einer Spritze vorbelastet mit 1x PBS (26,25 ml/kg Körpergewicht, 0,7-1,0 ml in einem 8-10 Wochen alten Weibchen C57Bl/6J Maus) Hea.
- Drücken Sie das Volumen von PBS langsam in die Lunge, damit sich die Lunge aufblähen kann, ziehen Sie das Volumen zurück in die Spritze. Wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt 3 Mal.
- Sammeln Sie die gepoolte Spülflüssigkeit von jeder bestimmten Maus in einem 15 ml Rohr.
- Zentrifugieren Sie die Bronchoalveolar-Lavage bei 610 x g für 6 min bei 4 °C und sammeln Sie Überstand in ein 1,5 ml Rohr und gefrieren bei -80 °C. Das Pellet stellt Zellen aus dem bronchoalveolarraumaren Raum dar.
- Entfernen Sie die verbleibenden roten Blutkörperchen in gesammelter BAL-Flüssigkeit, indem Sie dem Zellpellet 1 ml ACK-RBC-Lysepuffer hinzufügen, dann gut wirbeln und 1 min auf Eis lysen. Fügen Sie danach 4 ml PBS hinzu, um die Lyse-Reaktion zu stoppen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 610 x g für 6 min bei 4 °C und aspirieren den Überstand mit einem Vakuumsauger.
- Resuspend Zellen in 1 ml 1x PBS + 10% FBS zu jedem BAL-Probenröhrchen. Zählen Sie Zellen auf einem Hämozytometer für die Quantifizierung der gesamten Luftraumzellen aus jeder Probe (kein Trypanblau). Zentrifuge 120 l jeder Probe auf Dias bei 56 x g für 3 min, mit mittlerer Beschleunigung und einer Zytozentrifuge. Trocknen Sie die Rutschen über Nacht.
5. Berechnung des alveolären Makrophagen-Efferozytikindex (Tag 3)
- Färben Sie die Dias mit Hämatoxylin und Eosin, um die Berechnung der efferozytischen und differenziellen Zellzahl zu ermöglichen, wobei mindestens 200 Zellen aus jeder Folie gezählt werden.
- Sehen Sie Sich Dias unter einer hellfeldförmigen Einstellung auf einem biologischen Mikroskop an (ein 20-x- oder 40-faches Objektiv funktioniert am besten).
- Berechnen Sie den efferozytischen Index basierend auf dem Verhältnis der Anzahl der alveolar-Makrophagen, die phagozytosierte apoptotische Jurkat-T-Zellen zu alveolar-Makrophagen ohne apoptotische Zellaufnahme aus insgesamt 200 Makrophagen auf einem Zelldifferenzschlitten. Konvertieren Sie das Verhältnis in einen Prozentsatz für die Dateneingabe. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
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Representative Results
O3 Exposition ist bekannt, Lungenentzündung und Verletzungen zu induzieren, und Efferozytose ist erforderlich, um Gewebe Homöostase zu erhalten. C57BL/6J weibliche Mäuse wurden gefilterter Luft (FA) oder 1 ppm O3 für 3 h und necropsied 24 h nach der Exposition ausgesetzt, um Lungenentzündungen und Verletzungen zu untersuchen. O3-exponierte Mäuse zeigten im Vergleich zur FA-Kontrollgruppe einen signifikanten Anstieg der Makrophagen und Neutrophilen im Luftraum (Abbildung 1A,B). Zusätzlich hattenO3-exponierteMäuse eine signifikante Zunahme des BAL-Proteins, einem Marker der alveolären Epithelbarriere-Dysfunktion 24 h nach der Exposition (Abbildung 1C).
Um festzustellen, obO3-induzierteLungenentzündung mit Defekten bei der alveolar-Makrophagen-Efferozytose in vivo verbunden ist, wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse mit apoptotischen Jurkat-T-Zellen über oropharyngeale Aspiration 24 h post-FA oder post-O 3 instilliert Exposition. Die Apoptose in Jurkat-T-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie vor der Dosing bestätigt, und es gab einen signifikanten Anstieg der frühen (Annexin V+ PI- und späten (Annexin V+ und PI+) apoptotischen Zellen (Abbildung 2A,B). Der Expositionspegel und die Inkubationszeit führten zu sich wiederholenden Ergebnissen von 75 % apoptotischen Jurkat-T-Zellen. Abbildung 3Azeigt ein vergrößertes Bild dessen, was als efferozytische Makrophagen identifiziert wurde. Efferozytische Makrophagen wurden als Makrophagen identifiziert, die eine Jurkat-T-Zelle verschlungen hatten (angezeigt durch schwarze Pfeile), im Vergleich zu regulären alveolären Makrophagen (angezeigt durch weiße Pfeile) (Abbildung 3B). Als die Alveolarmakrophagen-Efferozytose anhand des Protokolls bewertet wurde, gab es eine statistisch signifikante Abnahme des efferozytischen Index derO3-exponiertenGruppe im Vergleich zu FA-Kontrollen ( Abbildung3B,C). Diese Daten deuten darauf hin, dassO3-induzierte Lungenentzündung mit einer verminderten Clearance von apoptotischen Zellen verbunden ist, die Lungenverletzungen und Entzündungen verlängern können.
Abbildung 1:O3-Exposition induziert Lungenentzündungen und Verletzungen. C57BL/6J weibliche Mäuse wurden gefilterter Luft (FA) oder 1 ppm O3 für 3 h ausgesetzt. 24 h nach der Exposition, Mäuse wurden nekropoliert, um Lungenentzündungen und Verletzungen zu analysieren (n = 6 pro Gruppe). (A) Bronchoalveolare Lavage (BAL) Zelldifferenzen wurden berechnet, dann wurden epitheliale (epi), Eosinophile (Eos), Lymphozyten (Lymphe), Makrophagen (M) und Neutrophile (PMN) mit mindestens 200 Zellen aus jedem Dia gezählt identifiziert. (B) Ein repräsentatives Bild der zellulären Differentiale. (C) Gesamtprotein in der BAL-Flüssigkeit. Die Daten werden ausgedrückt als SEM (**p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bestätigung der UV-induzierten Apoptose in Jurkat-T-Zellen. Jurkat-T-Zellen wurden mit einem UV-Vernetzen (Modell 1800) UV (60mJ/cm2)ausgesetzt. Nach UV-Exposition wurden Jurkat-T-Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 4 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden Jurkat-T-Zellen mit Annexin V und Propidiumiodid (PI) gefärbt, und die Apoptose wurde durch Durchflusszytometrie bewertet. Frühe apoptotische, späte apoptotische und nekrotische Zellen werden als Anhang V+/PI-, Annexin V+/PI+, Annexin V-/PI+identifiziert. Repräsentative Strömungszytometrie-Streudiagramme (mit 10.000 aufgezeichneten Ereignissen) von (A) nicht exponierten Jurkat-T-Zellen und (B) UV-exponierten Jurkat-T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: O3-Exposition verringert alveolare Makrophagenefferozytose. C57BL/6J weibliche Mäuse wurden gefilterter Luft (FA) oder 1 ppm O3 für 3 h ausgesetzt. 24 h nach der Exposition, Mäuse wurden oropharyngeal mit etwa 5 x 106 apoptotischen Jurkat-T-Zellen eingeflößt. 1,5 h nach der Instillation wurde eine Bronchoalveolario-Lavage (BAL) durchgeführt, und der efferozytische Index wurde in BAL-Makrophagen durch Lichtmikroskopie nach Zählung von 200 Makrophagen (n = 11 pro Gruppe) berechnet. (A) Repräsentatives Bild einer efferozytischen Makrophagen. (B) Identifizierung von Alveolarenmakrophagen (weiße Pfeile) und efferozytische Makrophagen (schwarze Pfeile) nach FA- oderO3-Exposition. (C) Berechnung des efferozytischen Index nach DER FA- oderO-3-Exposition (***p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Suboptimale Jurkat-T-Zell-Apoptose mit 350 nm Frostzwiebeln. Jurkat-T-Zellen wurden 10 min lang mit dem UV-Vernetzen bestrahlt und bei 37 °C bei 5%CO2 für 1 h inkubiert. Nach UV-Exposition wurden Jurkat-T-Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 4 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden Jurkat-T-Zellen mit Annexin V und Propidiumiodid (PI) gefärbt, anschließend wurde die Apoptose durch Durchflusszytometrie bewertet. Frühe apoptotische, späte apoptotische und nekrotische Zellen werden als Anhang V+/PI-, Annexin V+/PI+und Annexin V-/PI+bzw. Anhang identifiziert. Repräsentative Strömungszytometrie-Plots (mit 10.000 registrierten Ereignissen) von UV-exponierten Jurkat-T-Zellen mit 350 nm Glühbirnen werden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Efferozytose ist ein entzündungshemmender Prozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen und Ablagerungen reinigen sowie mehrere entzündungshemmendeMediatoren9,10,11,12,16 produzieren ,18. Mehrere Modelle der Efferozytose haben Einen Einblick gegeben, wie das Makrophagen eine kritische Zelle in der Auflösung von Entzündungenist 6,7. Kürzlich wurde das Fortschreiten der chronischen Lungenerkrankungen mit Defekten in der Efferozytose8,9,15,16,17in Verbindung gebracht. Derzeit ist jedoch unklar, ob die Exposition gegenüber Luftschadstoffen wie O3 zu Defekten bei der Efferozytose führt. Dieses Protokoll ermöglicht die Auswertung der alveolar Makrophagen-Efferozytose nach O3-Exposition. Es quantifiziert auch die Efferozytose in vivo mittels Lichtmikroskopie und ermöglicht die Messung der Efferozytose im Kontext der Lungenmikroumgebung, ohne Ex-vivo-Manipulationen oder teure Fluoreszenzfarbstoffe. Obwohl dieses Protokoll im Kontext der O3-Exposition durchgeführt wird, können mit diesem Protokoll mehrere Modelle von Lungenentzündungen und Verletzungen verwendet werden, um die Alveolarmakrophagenefferozytose zu bewerten.
Vorteile dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden sind ihre Fähigkeit, alveolare Makrophagen im Kontext der physiologischen Umgebung zu analysieren. Die Ex-vivo-Analyse von Alveolar-Makrophagen umfasst die Beschichtung und Inkubation mit apoptotischen Zellen. Die Beschichtung von Alveolar-Makrophagen kann sowohl physiologische als auch genomische Veränderungen induzieren, die die Efferozytose28,29,30verändern können. Darüber hinaus gibt es in der Lunge Alveolarmakrophagen in einer Mikroumgebung, die Tensid und Komponenten der Lungenfutterflüssigkeit enthält, die bekanntermaßen die Makrophagenfunktion31,32,33, 34,35. Unsere Methode ermöglicht Efferozytosemessungen in der Lunge ohne Ex-vivo-Manipulationen, was physiologisch relevanter ist. Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls können zu eingehenderen Studien darüber führen, wie die Mikroumgebung der Lunge die Alveolarmakrophagen-Efferozytose verändern kann.
Ein kritischer Bestandteil dieses Protokolls ist die Erzeugung von apoptotischen Zellen zur Bewertung der alveolar-Makrophagen-Efferozytose. Dies beinhaltet die Optimierung der richtigen UV-Exposition, um Apoptose zu induzieren, nicht Nekrose. Unser Protokoll verwendet den UV-Vernetzenmiten mit 254 nm Wellenlängen-Emissionslampen und einem Belichtungsgrad von 60 mJ/cm2. Die UV-Lampen-Auswahl ist entscheidend für die Herstellung von Apoptose, nicht Nekrose. 350 nm UV-Lampen eignen sich hervorragend für Proteinmembranvernetzung und Sterilisation, können aber keine Apoptose35,36,37induzieren. Ein Beispiel für ein Punktdiagramm von Jurkat-T-Zellen, die 60 mJ/cm2 mit 350 nm Glühbirnen ausgesetzt sind, ist in Abbildung 4 mit einer signifikanten Zunahme der späten apoptotischen und nekrotischen Zellen dargestellt. Darüber hinaus verwendet das Protokoll eine 4 h Inkubation nach der UV-Exposition. Um diesen Teil des Protokolls zu optimieren, haben wir zuvor verschiedene Inkubationszeiten untersucht und festgestellt, dass 1,5 und 2 h Inkubation nach der Exposition nur etwa 40% Apoptose mit einem efferozytischen Index von weniger als 5% ergab (Daten nicht gezeigt). Basierend auf aktueller Literatur reichen 70%-80% gesamtapoptotische Zellen aus, um die Efferozytose38zu messen.
Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass es die efferozytische Reaktion aller Makrophagen im Luftraum nach FA- oderO3-Exposition untersucht und geweberesidente Makrophagen nicht von rekrutierten Makrophagen unterscheidet. Die Lungen-Resident-Makrophagen, die als AlveolareMakrophagen bezeichnet wird, stammen aus der fetalen Leber, während rekrutierte Makrophagen von einem blutübertragenen embryonalen Ursprung stammen. Bei Verletzungen kann die Lunge eine sehr heterogene Makrophagenpopulation mit einzigartiger Genetik und Expression von Zelloberflächenmarkern28,29,30,31,32, 33,34,35. Es ist bekannt, dass die immunologische Reaktion und Funktion dieser Makrophagenpopulationen unterschiedlich sind; neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass die geweberesidente Makrophagen eine größere efferozytische Reaktion im Vergleich zu rekrutierten Makrophagen29,30,31haben. Die Bestimmung der efferozytischen Reaktion von geweberesidenten Makrophagen im Vergleich zu rekrutierten Makrophagen kann mit dem aktuellen Protokoll bewertet werden; Die Makrophagenpopulationen müssen jedoch durch FACS gereinigt und zur Analyse auf Dias plattiert werden. Darüber hinaus bewertet dieses Protokoll nur die alveolare Makrophagen-Efferozytik-Funktion in einem Stamm von inzuchtfähigen, kommerziell erhältlichen Mäusen. Es wurde bereits berichtet, dass verschiedene Stämme von Mäusen unterschiedliche Reaktionen auf O3-Exposition zeigen, einschließlich Lungenentzündung39,40. Daher kann es Unterschiede in der alveolarmakrophageefferozytose auf der Grundlage des untersuchten Stammes geben. Dies ist eine Variable, die bei der Durchführung dieses in vivo-Assays berücksichtigt werden sollte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das oben beschriebene Protokoll die Auswertung der alveolären Makrophagen-Efferozytose in vivo ermöglicht. Dieses Protokoll ist kostengünstig und einfach, so dass es ein Assay, der weit verbreitet werden kann. Darüber hinaus kann diese Methode auf zahlreiche Modelle von Lungenverletzungen und/oder Entzündungen angewendet werden, um das Verständnis dafür zu erhöhen, wie verschiedene Lungenbeleidigungen die Makrophagen-Efferozytose verändern können.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wird vom Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award und NIEHS R01ES028829 (nach K. M. G. gefördert). Wir danken Dr. Dianne Walters (Abteilung für Physiologie, ECU) für ihre Unterstützung bei der Beschaffung repräsentativer Bilder von alveolar Makrophagen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
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