Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per determinare se l'esposizione all'ozono, un criterio di inquinante dell'aria, imponga l'efferocitosi alveolar in vivo. Questo protocollo utilizza reagenti e tecniche di uso comune e può essere adattato a più modelli di lesione polmonare per determinare gli effetti sull'efferocitosi del macrofagio alveolar.
Abstract
L'ozono (O3)è un criterio di inquinamento atmosferico che esacerba e aumenta l'incidenza di malattie polmonari croniche. O3 esposizione è noto per indurre infiammazione polmonare, ma poco si sa per quanto riguarda come l'esposizione altera i processi importanti per la risoluzione dell'infiammazione. L'efferocitosi è un processo di risoluzione, in cui i macrofagi fagagocitizzano le cellule apoptotiche. Lo scopo di questo protocollo è quello di misurare l'efferocitosi del macrofago alveolare in seguito a una lesione polmonare e un'infiammazione polmonari indotta da O3. Sono stati descritti diversi metodi per misurare l'efferocitosi; tuttavia, la maggior parte richiede manipolazioni ex vivo. Descritto in dettaglio qui è un protocollo per misurare in vivo alveolare macrophage efferocytosis 24 h dopo l'esposizione O3, che evita la manipolazione ex vivo di macrofagi e serve come una semplice tecnica che può essere utilizzata per rappresentare con precisione le questo processo di risoluzione. Il protocollo è un metodo tecnicamente non intensivo e relativamente poco costoso che coinvolge l'inalazione di tutto il corpo O3 seguita dall'aspirazione orofanginale delle cellule apoptotiche (cioè, cellule T Jurkat) durante l'anestesia generale. L'efferocitosi del macrofago alveolar viene quindi misurata mediante la valutazione della microscopia leggera dei macrofagi raccolti dalla lavanda bronchoalveolar (BAL). L'efferocitosi viene infine misurata calcolando un indice efferocitico. Collettivamente, i metodi delineati quantificano l'attività efferocitica nel polmone in vivo, servendo anche per analizzare gli effetti negativi sulla salute di O3 o di altri insulti inalati.
Introduction
Il polmone è costantemente esposto a insulti ambientali, tra cui particolato d'aria, virus, batteri e gas ossidanti che innescano l'infiammazione polmonare1,2,3. Questi insulti possono compromettere lo scambio di gas e indurre lesioni vissutali irreversibili4,5. I macrofagi alveolar, che costituiscono circa il 95% delle cellule immunitarie presenti nei polmoni murini e umani all'omeostasi, sono regolatori critici dell'infiammazione polmonare dopo gli insulti ambientali1,2, 3,4,5. I macrofagi alveolar sono essenziali durante la difesa dell'ospite facendo agoccitizzando ed eliminando gli agenti patogeni. Recentemente, i macrofagi alveolar hanno dimostrato di promuovere l'omeostasi dei tessuti e la risoluzione dell'infiammazione attraverso l'efferocitosi6,7. L'efferocitosi è un processo fagocitico in cui i macrofagi inghiottiscono ed eliminano le cellule apoptotiche8,9,10. L'efferocitosi si traduce anche nella produzione di mediatori (ad es. IL-10, TGF-z, PGE2e ossido nitrico) che aumentano ulteriormente il processo, con conseguente risoluzione di infiammazione9,10,11 ,12,16,18. Questo processo è necessario per prevenire la necrosi secondaria e promuovere l'omeostasi dei tessuti12,13,14. Diversi studi hanno collegato l'efferocitosi alterata con varie malattie polmonari croniche, tra cui asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, e fibrosi polmonare idiopatica8,9,15, 16,17.
O3 è un criterio di inquinante atmosferico che esacerba e aumenta l'incidenza delle malattie polmonari croniche19,20,21. O3 induce infiammazione polmonare e lesioni ed è noto per compromettere la fagocitosi del macrofago alveo di patogeni batterici22,23. Tuttavia, non è noto se O3 imponga l'efferocitosi del macrofago alveolar. Lo studio delle alterazioni indotte da O3nell'efferocitosi del macrofalo alveo fornirà una possibile comprensione di come l'esposizione possa portare all'incidenza e all'esacerbazione delle malattie polmonari croniche. Descritto di seguito è un metodo semplice per valutare l'efferocitosi del macrofago alveolare nei polmoni dei topi femminili dopo l'esposizione acuta di O3.
Il metodo delineato possiede diversi vantaggi rispetto ad altri protocolli di efferocitosi comunemente utilizzati sul campo eliminando l'uso di costosi coloranti fluorescenti, misurazioni di citometria a flusso estese e manipolazione ex vivo di macrofagi alveolar24 ,25. Inoltre, questo protocollo misura l'efferocitosi del macrofago alveolare nel contesto del microambiente polmonare, che può influenzare la funzione del macrofago.
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Protocol
Tutti i metodi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della East Carolina University.
1. Ozono (O3)e esposizioni all'aria filtrate (giorno 1)
- Collocare un massimo di 12 topi C57BL/6J femminili, di 8-12 settimane, in una gabbia d'acciaio (con 12 scomparti separati) con coperchi a rete metallica in una camera di esposizione O3.
- Posizionare il termometro nella camera di esposizione con la gabbia per registrare con precisione la temperatura e l'umidità.
- Accendere la luce dell'ossigeno e degli ultravioletti (UV) collegata all'apparato.
NOTA: Flusso d'aria regolamentato (>30 cambi d'aria/h) con temperatura controllata (22-23 gradi centigradi) e umidità relativa (45%-50%) è ottenuto dall'apparecchio O3. O3 è generato dal sistema nella camera di esposizione dirigendo 100% ossigeno attraverso un generatore di luce UV, quindi mescolando con un alimentatore di aria filtrata. - Regolare la concentrazione di O3 a 1 ppm e registrare regolarmente O3 livelli ogni 10 min per 3 h. Monitorare continuamente la temperatura e l'umidità dell'aria della camera, così come la concentrazione di O3 con un fotometro luce UV.
NOTA: Le esposizioni filtrate dell'aria vengono eseguite in un apparato simile, con solo una fornitura di aria filtrata che scorre attraverso la camera di esposizione. - Riportare gli animali alle rispettive gabbie con biancheria da letto, cibo e acqua al libitum dopo 3 h di O3/ esposizione all'aria filtrata.
2. Preparazione della linea cellulare Jurkat T (Giorno 2)
NOTA: tutte le procedure devono essere condotte in un mobile di sicurezza biologica di classe II.
- Coltura Jurkat T cellule in 24 mL di coltura cellulare basale medio - 10% FBS - 5% penicillina / streptomiacina a 37 s C - 5% CO2 (Tabella dei Materiali). Le cellule Jurkat T sono una linea cellulare di sospensione che può essere mantenuta passando 1:6-1:8 in supporti di coltura preriscaldati ogni 3 giorni. Non scuotere.
- Per preparare le cellule apoptotiche, farle crescere fino al 90% di confluenza in ogni fiaschetta (che richiede 3-4 giorni per raggiungere dopo il passaggio). Per questo studio, utilizzare cellule da cinque flaconi T75 per ottenere il numero sufficiente di cellule utilizzate in questo protocollo.
NOTA: Una fiaschetta confluente contiene circa 20-24 milioni di cellule. - Pipetta up cellule (che è l'intero flacone) da ogni fiaschetta (circa 24 mL) e trasferire le cellule a uno sterile 50 mL tubo conico utilizzando una pipetta sierologica. Utilizzare più tubi conici per più flaconi.
- Contare le cellule rimuovendo un 11 ll di cellule dal tubo conico da 50 mL e mescolare con 11 l di macchia blu trypan e pipetta 11 su vetrini emocitometri.
- Inserire una diapositiva in un contatore di celle automatizzate e registrare il numero di celle vive per calcolare il numero totale di celle in ogni pallone moltiplicando il numero di celle vive per 24, poiché ogni pallone contiene 24 mL di supporti.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 271 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) a cellule pellet.
- Eliminare il supernatante per aspirazione e risospendere il pellet cellulare nei media per ottenere 3,0 x 106 celle per mL.
- Aliquota 5 mL di cellule in piatti di coltura tissutale 100 mm x 20 mm (saranno utilizzati circa nove piatti; la quantità totale di cellule in ogni piatto dovrebbe essere di 15 x 106).
- Utilizzare un piatto per il controllo / non esposto, e i piatti rimanenti saranno esposti ai raggi UV.
- Impostare il parassa UV al livello di energia corretto, premere il pulsante di energia e immettere "600" utilizzando il tastierino numerico, che la macchina leggerà come 600 j/cm2 x 100.
NOTA: Le unità di energia del paralinker UV sono in formato J/cm2 x 100; quindi, per ottenere 60 millijoule/cm2,convertire le unità in modo che corrispondano al parassa UV. - Irradiare tutti i piatti con celle, escluso il controllo, a 60 millijoule (mJ)/cm2 utilizzando il parassa UV. Rimuovere il coperchio superiore dei piatti di coltura dei tessuti durante l'esposizione ai raggi UV, poiché la luce UV non penetra nel coperchio di plastica.
- Incubare tutti i piatti in un'incubatrice a coltura cellulare, compreso il controllo non esposto, a 37 gradi centigradi al 5% di CO2 per 4 h.
- Confermare l'apoptosi per citometria di flusso utilizzando un kit di rilevamento dell'apposte di apoptosi contenente annessione V e propidium iodide (PI) (marcatori per apoptosi e necrosi, rispettivamente) dopo 4 h di incubazione, secondo le istruzioni del produttore26, 27.
NOTA: irradiare cellule Jurkat T nel crosslinker UV a un livello di energia di 600 J/cm2, dopo un'incubazione di 4 h porterà al 75% delle cellule apoptotiche (sia precoce che tardive) che hanno più fenotipo apoptotico precoce rispetto al fenotipo apoptotico tardivo. Questo rende più facile per i macrofagi alveolini riconoscerli e inghiottire come le loro membrane sono senza compromessi, a differenza delle cellule apoptotiche tardive, che porta ad un indice efferocitico più alto e più accurata imaging di efferocitosi macrofalo alveare in questo studio.- Piscina 333 L (1 x 106 celle) di cellule T Jurkat da diversi piatti (sia "senza UV" che "UV-esposti") insieme da utilizzare per tubi di analisi retributiva.
- Aliquota 333 - L di cellule Jurkat T in una macchia singola non macchiata, annessa V singola macchia, PI singola macchia, nessun controllo UV, e 600 tubi di citometria a flusso con esposizioneai raggi UV.
- Centrifuga tubi a 188 x g per 5 min a RT e decant il supernatante.
- Lavare le cellule risuspendendo in 500 - L di freddo, 1x salina tramite buffer di fosfato (PBS).
- Centrifuga e pellet a 188 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante dopo la centrifugazione.
- Preparare 400 luna di 1x buffer di legame per tubo di flusso diluindo 10x buffer di legame con acqua distillata mentre le cellule sono centrifugate.
- Preparare il reagente di incubazione dell'annessione V e PI (100 l per campione/tubo) in base alle istruzioni del produttore.
- Decant il supernatante dopo la centrifugazione e resospendere delicatamente tutti i tubi in 400 ll di 1x tampone di rilegatura, quindi aggiungere 100 l di annessina V incubazione reagente ad ogni tubo campione. Infine, aggiungere 100 L di macchia singola di annessa V e pi singola macchia ai rispettivi tubi, ma non aggiungere nulla oltre il buffer di legatura 1x al tubo incontaminato.
- Incubare tubi al buio per 15 min a RT.
- Centrifugare tutte le cellule a 188 x g per 5 min a RT e decant supernatant.
- Risospendere le celle in un buffer di rilegatura di 400 , quindi analizzare i campioni per l'apoptosi per citometria di flusso. Raccogliere almeno 10.000 eventi per tubo per consentire una rappresentazione accurata della colorazione.
- Unire tutte le celle irradiate da piatti in un tubo conico da 50 ml e cellule di pellet con centrifugazione a 271 x g per 5 min a RT.
- Eliminare il supernatante dal tubo per aspirazione e risospendere le cellule in 24 mL di salina tampina tamponata sterile (PBS) e pellet cellule per centrifugazione a 271 x g per 5 min a temperatura ambiente.
- Eliminare il supernatante dal tubo per aspirazione e risospendere le cellule nella quantità di PBS utilizzata per il dosso dei topi approvati da IACUC. La dose utilizzata è compresa tra 5-10 x 106 cellule/50 -L per topo; pertanto, per 10 topi, la sospensione in 500 :L (il numero di cellule in ogni dose varia a seconda del numero di cellule coltivate per l'irradiazione).
NOTA: Trucco almeno due dosi aggiuntive per tenere conto di qualsiasi liquido che può attaccare ai lati della punta pipetta con conseguente perdita di cellule.
3. Instillazione orofilingale murina di cellule apoptotiche (Giorno 2)
- Preparare l'inoculum di dosing delle cellule apoptotiche utilizzando una pipetta P200 prima di anestetizzare i topi per accelerare la procedura. Secondo le linee guida istituzionali, un volume di 50 ,L contenente circa 5-10 x 106 cellule viene utilizzato per l'instillazione orofatrale (o.p.) per garantire i migliori risultati.
- Anestesizza i topi in una camera limpida con 2% di isoflurane ad una portata di 1 L/min o secondo le linee guida istituzionali. Anestesizzare da uno a due topi alla volta; il numero è determinato dal livello di comfort dello sperimentatore. Osservare il modello respiratorio e confermare respiri profondi sono visibili con 2-3 s conteggi tra i respiri. Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di risposta al pizzico della punta.
- Posizionare il mouse in una posizione supina semi-recumbent. Utilizzare una stringa chirurgica legata tra pioli su una scheda di foglio acrilico inclinato per sospendere dagli incisivi mascellari.
- Utilizzando un paio di pinze smussate non smussate, afferrare leggermente e tirare la lingua del mouse. Instillare le cellule apoptotiche nella cavità orale con una pipetta P200. Dosaggio è successo quando i topi fanno un rumore scoppiettante 1–2 s dopo aver dato la dose.
NOTA: Fare attenzione a evitare di indurre traumi alla lingua o all'oropharynx prima dell'instillazione delle cellule apoptotiche. - Con un dito guantato, bloccare delicatamente il naso fino a quando il mouse inspira mentre la lingua viene ritratta. Coprire il naso fino a quando nessun liquido è visibile nella cavità orale e il topo ha preso due o più inalazioni.
NOTA: Poiché i topi sono respiratori del naso obbligati, coprire il naso aiuta a garantire che il mouse inalerà le cellule apoptotiche nei polmoni. - Rimuovere il mouse dalla scheda di inoculazione e riportarlo alla gabbia per consentire il recupero dall'anestesia. Posizionare il mouse sulla schiena per evitare che biancheria da letto o detriti blocchino le nares durante il rivoglio.
- Attendere 90 min dopo che il topo si riprende dall'anestesia per consentire ai macrofagi alveolari di inghiottire l'afflusso di cellule apoptotiche dopo che tutti i topi si sono svegliati dall'anestesia. Tipicamente, il risveglio dopo l'anestesia prenderà 1–2 min, che non dovrebbe influenzare l'esito / tempistica dell'instillazione.
4. Raccolta e lavorazione del fluido lavandino Bronchoalveolar (giorno 2)
- Eutanasia ogni topo per linee guida istituzionali 90 min dopo che il topo si è svegliato dall'anestesia da dosing con cellule apoptotiche. Qui, viene utilizzata un'iniezione letale di ketamina e xilanina (rispettivamente 90 mg/kg e 10 mg/kg) seguita dall'eccitatura del diaframma.
NOTA: Questo punto temporale consente ai macrofagi alveolar di percepire e inghiottire le cellule apoptotiche38. - Pesare tutti i topi (g) su una scala e registrare i pesi. Utilizzare il peso corporeo per calcolare il volume BAL (26,25 mL/kg di peso corporeo).
- Posizionare i topi sulla schiena e spruzzare 70% etanolo per sterilizzare la zona del torace e del collo.
- Fare un taglio longitudinale di 2" appena sotto lo sterno lungo l'intero lato ventrale con forbici chirurgiche, e mentre si tiene lo sterno con pinze, nick il diaframma per consentire ai polmoni di cadere nella cavità toracica.
- Tagliare lateralmente lungo i lati della gabbia toracica per consentire ai polmoni più spazio per espandersi durante la lavatura, quindi piegare la cavità toracica indietro con pinze.
- Fare un taglio verticale di 1" lungo la vascolatura attraverso il collo per esporre la trachea.
- Utilizzare due pinze per tirare il muscolo e il tessuto dalla trachea ed esporlo. Evitare ulteriori potenziali sanguinamento e tagliare la trachea, dal momento che è circondato da vascolatura, muscoli longitudinali, e tessuto connettivo.
- Utilizzare un ago per fare una scollatura nella trachea (circa un quarto della distanza dalla testa) e inserire una cannula (18 G x 1,25") con una siringa precaricata con 1x PBS (26,25 mL /kg di peso corporeo, 0,7-1,0 mL in una femmina di 8-10 settimane femmina C57/6J) Hea.
- Spingere il volume di PBS nei polmoni lentamente per consentire ai polmoni di gonfiarsi, quindi tirare il volume di nuovo nella siringa. Ripetere questo processo per un totale di 3 volte.
- Raccogliere il fluido di lavage in pool da ogni topo specifico in un tubo da 15 mL.
- Centrifugare la lavanda bronchoalveolar a 610 x g per 6 min a 4 gradi centigradi e raccogliere il supernatante in un tubo da 1,5 mL e congelare a -80 gradi centigradi. Il pellet rappresenta cellule dello spazio bronchoalveolar.
- Rimuovere i globuli rossi residui nel fluido BAL raccolto aggiungendo 1 mL di tampone di lisi ACK RBC al pellet cellulare, quindi vortice e lis per 1 min sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 4 mL di PBS per arrestare la reazione di lisi.
- Cellule di Pellet per centrifugazione a 610 x g per 6 min a 4 gradi centigradi e aspirano il supernatale con un aspiratore sottovuoto.
- Risospendere le cellule in 1 mL di 1x PBS - 10% FBS per ogni tubo campione BAL. Contare le cellule su un emocitometro per quantificare le cellule dello spazio aereo totale da ogni campione (nessun blu trypan). Centrifuga 120 L di ogni campione su vetrini a 56 x g per 3 min, utilizzando un'accelerazione media e una citocentriera. Asciugare i vetrini durante la notte.
5. Calcolo dell'indice efferocitico del macrofago alveolare (giorno 3)
- Macchiare i vetrini con ematossialina ed eosina per consentire il calcolo del conteggio cellulare sia efferocitico che differenziale, con almeno 200 celle contate da ogni diapositiva.
- Visualizza le diapositive sotto un'impostazione a campo luminoso su un microscopio biologico (un obiettivo 20x o 40x funzionerà meglio).
- Calcolare l'indice efferocitico in base al rapporto tra il numero di macrofagi alveolar che fagocitosamente hanno fatto il falange cellule T apoptotiche ai macrofagi alveolari senza l'assorbimento delle cellule apoptotiche su un totale di 200 macrofagi su una diapositiva differenziale cellulare. Convertire il rapporto in una percentuale per l'immissione di dati. Utilizzare l'equazione seguente:
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Representative Results
O3 esposizione è noto per indurre infiammazione polmonare e lesioni, ed efferocitosi è necessaria per mantenere l'omeostasi dei tessuti. I topi femminili C57BL/6J sono stati esposti all'aria filtrata (FA) o 1 ppm O3 per 3 h e necropsie 24 h post-esposizione per esaminare l'infiammazione polmonare e le lesioni. O3-bambiniesposti hanno mostrato un aumento significativo dei macrofagi e neutrofili nello spazio aereo rispetto al gruppo di controllo FA (Figura 1A,B). Inoltre, i topi esposti a O3avevano un aumento significativo della proteina BAL, un marcatore della disfunzione epiteliale alveolare 24 h dopo l'esposizione (Figura 1C).
Per determinare se l'infiammazione polmonare indotta da O3è associata a difetti nell'efferocitosi del macrofagio alveo in vivo, i topi femminili C57BL/6J sono stati instillati con cellule T di Jurkat apoptotiche tramite aspirazione orofarofetale 24 h post-FA o post-O3 l'esposizione. L'apoptosi nelle cellule Di Jurkat T è stata confermata dalla citometria di flusso prima del dosso, e c'è stato un aumento significativo nelle prime fasi (annessina V- PI- e in ritardo (annessione Ve PI) cellule apoptotiche ( Figura2A,B). Il livello di esposizione e il tempo di incubazione hanno portato a risultati ripetitivi delle cellule Jurkat T apoptiche del 75% . Un'immagine ingrandita di ciò che è stato identificato come un macrofago efferocitico è illustrata nella Figura 3A. I macrofagi efferocitici sono stati identificati come macrofagi che avevano inghiottito una cellula Jurkat T (indicata da frecce nere), rispetto ai macrofagi alveolar regolari (indicati da frecce bianche) (Figura 3B). Quando è stata valutata l'efferocitosi del macrofago alveolare utilizzando il protocollo, si è esistata una diminuzione statisticamente significativa dell'indice efferocitico del gruppo esposto a O3rispetto ai controlli FA (Figura 3B,C). Questi dati indicano che l'infiammazione polmonare indotta da O3è associata a una diminuzione della distanza delle cellule apoptotiche, che può prolungare lesioni polmonari e infiammazione.
Figura 1: L'esposizione A3 provoca infiammazione polmonare e lesioni. I topi femminili C57BL/6J sono stati esposti all'aria filtrata (FA) o a 1 ppm O3 per 3 h. 24 h dopo l'esposizione, i topi sono stati necrolizzati per analizzare l'infiammazione polmonare e le lesioni (n - 6 per gruppo). (A) Sono stati calcolati i differenziali di lavanda delle cellule Bronchoalveolar (BAL), poi epiteliali (epiteliali), eosinofili (eos), linfociti (linfomph), macrofagi (M) e neutrofili (PMN) con almeno 200 cellule conteggiate da ogni diapositiva. (B) Un'immagine rappresentativa dei differenziali cellulari. (C) Proteina totale nel fluido BAL. I dati sono espressi come SEM (-p < 0,01). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Conferma dell'apoptosi indotta dai raggi UV nelle cellule T Jurkat. Le cellule Jurkat T sono state esposte ai raggi UV (60 mJ/cm2)utilizzando un crosslinker UV (Modello 1800). In seguito all'esposizione ai raggi UV, le cellule Jurkat T sono state incubate a 37 gradi centigradi, con il 5% di CO2 per 4 h. Dopo l'incubazione, le cellule Jurkat T sono state macchiate con annessa V e iodide propidio (PI), e l'apoptosi è stata valutata dalla citometria di flusso. Le cellule apoptotiche, apoptotiche e necrotiche iniziali sono identificate rispettivamente come allegato V-/PI-, annexin V-PI,annexin V-/PI. Grafici a dispersione di citometria di flusso rappresentativi (con 10.000 eventi registrati) di cellule Jurkat T non esposte(A)non esposte e(B)cellule Jurkat T esposte ai raggi UV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: O3 esposizione diminuisce l'efferocitosi del macrofago alveolare. I topi femminili C57BL/6J sono stati esposti all'aria filtrata (FA) o a 1 ppm O3 per 3 h. 24 h dopo l'esposizione, i topi sono stati instillati orofariamente con circa 5 x 106 cellule Apoptotiche Jurkat T. 1,5 h dopo l'instillazione, è stato eseguito il bronchoalveolar lavage (BAL) e l'indice efferocitico è stato calcolato in macrofagi BAL mediante microscopia leggera dopo aver contato 200 macrofagi (n - 11 per gruppo). (A) Immagine rappresentativa di un macrofago efferocitico. (B) Identificazione dei macrofagi alveolar (frecce bianche) e del macrofago efferocitico (frecce nere) dopo l'esposizione a FA o O3. (C) Calcolo dell'indice efferocitico dopo l'esposizione a FA o O3 (sezione < 0,0001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Apoptosi cellulare Jurkat T subottimale utilizzando lampadine smerigliate 350 nm. I cellule Jurkat T sono state irradiate utilizzando il crosslinker UV per 10 min e incubate a 37 gradi centigradi al 5% di CO2 per 1 h. In seguito all'esposizione ai raggi UV, le cellule Jurkat T sono state incubate a 37 gradi centigradi, con il 5% di CO2 per 4 h. Dopo l'incubazione, le cellule Jurkat T sono state macchiate con annessa V e iodide propidio (PI), quindi l'apoptosi è stata valutata dalla citometria di flusso. Le celle apoptotiche, apoptotiche e necrotiche iniziali sono identificate rispettivamente come allegato V-/PI-, annexin V,/PIe annexin V-/PI. Vengono mostrati i grafici di citometria di flusso rappresentativi (con 10.000 eventi registrati) di cellule T Jurkat esposte ai raggi UV con lampadine da 350 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'efferocitosi è un processo antinfiammatorio in cui i macrofagi eliminano le cellule apoptotiche e i detriti, nonché producono più mediatori antinfiammatori9,10,11,12,16 ,18. Diversi modelli di efferocitosi hanno fornito informazioni su come il macrofago sia una cellula critica nella risoluzione dell'infiammazione6,7. Recentemente, la progressione delle malattie polmonari croniche è stata associata a difetti nell'efferocitosi8,9,15,16,17. Tuttavia, al momento non è chiaro se l'esposizione a inquinanti atmosferici come O3 comanda difetti nell'efferocitosi. Questo protocollo consente la valutazione dell'efferocitosi del macrofago alveolare dopo l'esposizione a O3. Quantifica anche l'efferocitosi in vivo utilizzando la microscopia luminosa e consente la misurazione dell'efferocitosi nel contesto del microambiente polmonare, senza manipolazioni ex vivo o costosi coloranti fluorescenti. Anche se questo protocollo viene eseguito nel contesto dell'esposizione a O3, più modelli di infiammazione polmonare e lesioni possono essere utilizzati con questo protocollo per valutare l'efferocitosi del macrofago alveolar.
I vantaggi di questo metodo rispetto ai metodi esistenti sono la sua capacità di analizzare i macrofagi alveolar nel contesto dell'ambiente fisiologico. L'analisi ex vivo dei macrofagi alveolare include placcatura e incubazione con cellule apoptotiche. Placcare macrofagi alveolar possono indurre cambiamenti sia fisiologici che genomici che possono alterare l'efferocitosi28,29,30. Inoltre, nel polmone, i macrofagi alveolari esistono in un microambiente che contiene i componenti surrogati e componenti del fluido di rivestimento polmonare che sono noti per influenzare la funzione macrofagia31,32,33, 34,35. Il nostro metodo consente misurazioni dell'efferocitosi nel polmone senza manipolazioni ex vivo, il che è più fisiologicamente rilevante. Le future applicazioni di questo protocollo possono portare a studi più approfonditi su come il microambiente polmonare può alterare l'efferocitosi del macrofago alveolar.
Una componente fondamentale di questo protocollo è la generazione di cellule apoptotiche per la valutazione dell'efferocitosi dei macrofafi alveolar. Ciò comporta l'ottimizzazione del corretto livello di esposizione ai raggi UV per indurre l'apoptosi, non la necrosi. Il nostro protocollo utilizza il parassaio UV con lampadine a lunghezza d'onda da 254 nm e un livello di esposizione di 60 mJ/cm2. Le scelte delle lampadine UV sono fondamentali nella produzione di apoptosi, non necrosi. Le lampadine UV da 350 nm sono eccellenti per il cross-linking e la sterilizzazione della membrana proteica, ma non riescono a indurre l'apoptosi35,36,37. Un esempio di grafico a punti di cellule Jurkat T esposte a 60 mJ/cm2 con lampadine da 350 nm è illustrato nella Figura 4 con un aumento significativo delle celle apoptotiche e necrotiche tardive. Inoltre, il protocollo utilizza un'esposizione post-UV di incubazione di 4 h. Per ottimizzare questa parte del protocollo, in precedenza abbiamo esaminato vari tempi di incubazione e abbiamo scoperto che 1,5 e 2 h di incubazione post-esposizione produceva solo circa il 40% di apoptosi, con un indice efferocitico inferiore al 5% (dati non mostrati). Sulla base della letteratura attuale, le cellule apoptotiche totali di 70%-80% sono sufficienti per misurare l'efferocitosi38.
Una limitazione a questo protocollo è che esamina la risposta efferocitica di tutti i macrofagi nello spazio aereo dopo l'esposizione a FA o O3 e non distingue i macrofagi residenti in tessuto dai macrofagi reclutati. Il macrofago residente nel polmone chiamato macrofago alveolare proviene dal fegato fetale, mentre i macrofagi reclutati derivano da un'origine embrionale trasmessa dal sangue. Dopo un infortunio, il polmone può avere una popolazione di macrofaghi altamente eterogenea con genetica unica ed espressione dei marcatori di superficie cellulare28,29,30,31,32, 33,34,35. È noto che la risposta immunologica e la funzione di queste popolazioni di macrofaci sono diverse; tuttavia, studi recenti hanno indicato che i macrofagi residenti in tessuto hanno una maggiore risposta efferocitica rispetto ai macrofagi reclutati29,30,31. Determinare la risposta efferocitica dei macrofagi residenti dei tessuti rispetto ai macrofagi reclutati può essere valutato con il protocollo attuale; tuttavia, le popolazioni di macrofaghi devono essere purificate dal FACS e placcate su vetrini per l'analisi. Inoltre, questo protocollo valuta solo la funzione efferocitica del macrofago alveolare in un ceppo di topi inbred disponibili in commercio. In precedenza è stato riferito che diversi ceppi di topi mostrano risposte diverse all'esposizione a O3, tra cui l'infiammazione polmonare39,40. Pertanto, ci possono essere differenze nell'efferocitosi del macrofago alveolare in base al ceppo esaminato. Questa è una variabile che dovrebbe essere considerata quando si esegue questo saggio in vivo.
In conclusione, il protocollo sopra descritto consente la valutazione dell'efferocitosi del macrofago alveolare in vivo. Questo protocollo è conveniente e semplice, rendendolo un saggio che può essere ampiamente utilizzato. Inoltre, questo metodo può essere applicato a numerosi modelli di lesioni polmonari e/o infiammazione per aumentare la comprensione di come vari insulti polmonari possono alterare l'efferocitosi del macrofago.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è finanziato dal premio Walter A. Rosenblith Award e dal NIEHS R01ES028829 (a K. M. G). Ringraziamo la dott.ssa Dianne Walters (Dipartimento di Fisiologia, ECU) per la sua assistenza nell'ottenere immagini rappresentative dei macrofagi alveolar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
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