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Immunology and Infection

オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 2Research Triangle Park, National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

この原稿は、大気汚染物質であるオゾンへの曝露が生体内の肺胞マクロファージエフェロサイト症を損なうかどうかを決定するためのプロトコルを記述する。このプロトコルは、一般的に使用される試薬および技術を利用し、肺胞マクロファージエフェロサイトシスへの影響を決定するために肺損傷の複数のモデルに適応することができる。

Abstract

オゾン(O3)は、慢性肺疾患の発生率を悪化させ、増加させる基準である。O3暴露は肺炎症を誘発することが知られているが、暴露が炎症の解決に重要なプロセスをどのように変化させるかについてはほとんど知られていない。エフェロサイト症は、マクロファージがアポトーシス細胞を食細胞化する分解能プロセスである。このプロトコルの目的は、O3誘発性肺損傷および炎症に続く肺胞マクロファージエフェロサイト症を測定することである。エフェロサイトアシスを測定するためのいくつかの方法が記載されています。ただし、ほとんどの場合、ex vivo 操作が必要です。ここでは詳細に説明するO3暴露後の生体内肺胞マクロファージエフェロサイトシス24hで測定するプロトコルであり、マクロファージの排外操作を回避し、摂動を正確に表現するために使用できる簡単な技術として機能する。この解決プロセス。このプロトコルは、全身O3吸入に続いて、全身麻酔下でアポトーシス細胞(すなわち、Jurkat T細胞)の口腔咽頭吸引を伴う技術的に非集中的で比較的安価な方法である。次いで、気管支アルフェオール(BAL)洗浄剤から採取したマクロファージの光顕微鏡検査評価により、肺胞マクロファージエフェロサイト症を測定する。エフェロサイトシスは、最終的に発泡性指数を計算することによって測定される。概説された方法は、生体内の肺における発泡性活性を定量化する一方で、O3または他の吸入された侮辱の負の健康影響を分析するのに役立つ。

Introduction

肺は常に肺の炎症を引き起こす空気微粒子、ウイルス、細菌、および酸化性ガスを含む環境侮辱にさらされている1、2、3。これらの侮辱は、ガス交換を危険にさらし、不可逆的な組織損傷4、5を誘発することができます。恒常性におけるマウスおよびヒト肺に見られる免疫細胞の約95%を構成する肺胞マクロファージは、環境侮辱1、2後の肺炎症の重要な調節薬である。3,4,5.肺胞マクロファージは、病原体を食器化および排除することにより宿主防御中に不可欠である。最近、肺胞マクロファージは、組織恒常性および発泡細胞症6、7を介した炎症の解決を促進することが示されている。エフェロサイト症は、マクロファージがアポトーシス細胞8、9、10を巻き込み、排除する食細胞プロセスである。エフェロサイトーシスはまた、プロセスをさらに増強するメディエーター(すなわち、IL-10、TGF-β、PGE2、および一酸化窒素)の産生をもたらし、炎症9、10、11の解決をもたらす ,12,16,18.このプロセスは、二次壊死を予防し、組織恒常性を促進するために必要です12,13,14.いくつかの研究は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、および特発性肺線維症8、9、15を含む様々な慢性肺疾患と損なわれた肺細胞症をリンクしています。 16、17.

O3は、慢性肺疾患19、20、21の発生率を悪化させ、増加させる基準大気汚染物質である。O3は肺炎症および損傷を誘発し、細菌病原体22,23の肺胞マクロファージ性細胞症を損なう知られている。しかし、O3が肺胞マクロファージエフェロサイトーシスを損なうかどうかは不明である。O3-誘導性の肺マクロファージエフェロサイトーシスの改変を調べると、暴露が慢性肺疾患の発生率および悪化につながる方法についての潜在的な洞察を提供する。以下に説明する急性O3曝露後の雌マウスの肺における肺胞マクロファージエフェロサイト症を評価する簡単な方法である。

概説された方法は、高価な蛍光色素、広範なフローサイトメトリー測定、および肺胞マクロファージ24の外生操作の使用を排除することにより、この分野で一般的に使用される他のエフェロサイトーシスプロトコルに対していくつかの利点を有する。 、25.さらに、このプロトコルは、マクロファージ機能に影響を与える可能性のある肺微小環境のコンテキストで肺胞マクロファージエフェロサイトシスを測定します。

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Protocol

すべての方法は、イーストカロライナ大学の機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. オゾン(O3)とろ過空気暴露(1日目)

  1. 最大12匹のメスC57BL/6Jマウス(生後8~12週齢)を、金網蓋付きのスチールケージ(12個の別々のコンパートメント付き)に入れ、O3露光室に入れます。
  2. 温度と湿度を正確に記録するために、ケージと露出室に温度計を置きます。
  3. 装置に取り付けられている酸素と紫外線(UV)光をオンにします。
    注:制御された温度(22-23 °C)および相対湿度(45%-50%)との調節された気流(>30空気変化/h)O3装置によって得られる。O3は、UV光発生器を介して100%酸素を指示し、濾過された空気供給と混合することによって、露光室内のシステムによって生成されます。
  4. O3濃度を1ppmに調整し、定期的に3時間毎に10分ごとにO3レベルを記録し、紫外線光量計でO3濃度と同様に、チャンバー空気の温度と湿度を継続的に監視します。
    注:ろ過された空気の露出は、露出室を流れるろ過された空気供給だけを使用して、同様の装置で行われます。
  5. O3/ろ過された空気暴露の3時間後に寝具、食べ物、水のアドリビタムとそれぞれのケージに動物を返します。

2. ユルカットT細胞株の調製(2日目)

注:すべての手順は、クラスIIの生物学的安全キャビネットで行われるべきです。

  1. 基底細胞培地培地24mLにおけるジュルカットT細胞+10%FBS+5%ペニシリン/ストレプトマイシン37°C+5%CO2(材料表)。Jurkat T細胞は、3日ごとに予温められた培養培地に1:6-1:8を通過して維持することができる懸濁細胞株である。揺らさないで
  2. アポトーシス細胞を調製するには、各フラスコで90%の合流性に成長させる(通過後3〜4日かかります)。この研究では、5つのT75フラスコの細胞を使用して、このプロトコルで使用される十分な数の細胞を得る。
    注:コンフルエントフラスコには約20〜2400万個の細胞が含まれています。
  3. 各フラスコ(約24mL)からピペットアップセル(フラスコ全体)を上げ、血清ピペットを用いて無菌50mL円錐管に細胞を移します。複数のフラスコには複数の円錐管を使用します。
  4. 50 mL円錐管から細胞の11 μLアリコートを除去して細胞を数え、11 μLのトリパンブルーステインとピペット11μLをヘモサイトメータースライドに混ぜます。
  5. 自動セル カウンタにスライドを挿入し、各フラスコに 24 mL のメディアが含まれているため、ライブ セルの総数を 24 で乗算して、各フラスコの合計セル数を計算します。
  6. 細胞懸濁液を室温(RT)で5分間271xgでペレット細胞に遠心分離する。
  7. 吸引によって上清を廃棄し、培養中の細胞ペレットを再懸濁し、mL当たり3.0 x 106細胞を得る。
  8. 100mm x 20mm組織培養皿中の細胞のアリコート5 mL(約9皿が使用され、各皿の細胞の総量は〜15 x 106)である必要があります。
  9. コントロール/露出なしの1つの料理を使用し、残りの料理は紫外線にさらされます。
  10. UVクロスリンカーを正しいエネルギーレベルに設定し、エネルギーボタンを押し、マシンが600 μJ/cm2 x 100として読み取る数字パッドを使用して「600」と入力します。
    注:UV架リンカーエネルギーユニットはμJ/cm2 x 100です。したがって、60ミリジュール/cm2を達成するために、UV架リンカーに一致するように単位を変換します。
  11. UV架化機を使用して、60ミリジュール(mJ)/cm2で、コントロールを含まない細胞ですべての料理を照射します。紫外線がプラスチックカバーに浸透しないので、紫外線暴露中に組織培養皿の上部カバーを取り外します。
  12. 非露光制御を含む細胞培養インキュベーター内のすべての料理を、5%CO2で4時間37°Cでインキュベートします。
  13. インキュベーションの4時間後にアネキシンVとヨウ化プロピジウム(PI)を含むアポトーシスアッセイ検出キットを用いたフローサイトメトリーによるアポトーシスを確認し、メーカーの指示26に従って、27.
    注:600 μJ/cm2のエネルギーレベルでUVクロスリンカーにJurkat T細胞を照射すると、4時間インキュベーションに続くと、後期アポトーシス表現型よりも早期アポトーシス表現型を有するアポトーシス(早期および後期の両方)細胞の≥75%が導き起こされます。これにより、肺胞マクロファージは、後期アポトーシス細胞とは異なり、それらを認識し、その膜が妥協されないので巻き込むのが容易になり、この研究では、より高い発泡性指数と肺胞マクロファーゲフェゲエフェロサイト症のより正確なイメージングにつながります。
    1. 複数の料理からジュルカットT細胞のプール333 μL(1 x 106細胞)を一緒に補償分析チューブに使用します。
    2. 無染色、アネキシンV単一染色、PI単一染色、UVコントロールなし、および600 μJ/cm2 UV露光標識流量細胞メトリーチューブ中のJurkat T細胞のAliquot 333 μL。
    3. RTで5分間188 x gの遠心管および上清をデカントする。
    4. 500μLの冷たい、1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で再中断して細胞を洗浄します。
    5. 遠心分離機とペレット細胞はRTで188 x gで5分間、遠心分離後に上清を廃棄する。
    6. 細胞が遠心分離している間に蒸留水で10x結合バッファーを希釈することにより、フローチューブあたりの1x結合バッファーの400 μLを調製します。
    7. 製造元の指示に従って、アネキシンVおよびPIインキュベーション試薬(サンプル/チューブあたり100μL)を準備します。
    8. 遠心分離後に上清をデカントし、1x結合バッファーの400 μLですべてのチューブを穏やかに再中断し、各サンプルチューブに100 μLの附属Vインキュベーション試薬を追加します。最後に、それぞれのチューブに100 μLのアネキシンV単一染色とPI単一染色を追加しますが、1x結合バッファーを超えて汚れていないチューブに何も追加しないでください。
    9. RTで15分間暗闇の中でチューブをインキュベートします。
    10. RTおよびデカント上清で5分間188 x gですべての細胞を遠心分離する。
    11. 1x結合バッファーの400 μLで細胞を再中断し、フローサイトメトリーによってアポトーシスのサンプルを分析します。染色の正確な表現を可能にするために、チューブごとに少なくとも10,000のイベントを収集します。
  14. 皿から照射されたすべての照射された細胞を50 mL円錐管およびペレット細胞に271 x gの遠心分離によってRTで5分間結合する。
  15. 吸引によってチューブから上清を廃棄し、室温で5分間271 x gの遠心分離により無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)およびペレット細胞の24mLで細胞を再懸濁する。
  16. 吸引によってチューブから上清を廃棄し、IACUCによって承認されたマウスの剤用に使用されるPBSの量で細胞を再懸濁する。使用される用量は、マウスあたり5-10 x 106細胞/50 μLの間です。したがって、10匹のマウスについて、500μLで再中断する(各用量の細胞数は、照射のために培養される細胞の数によって異なる)。
    注:細胞の損失をもたらすピペット先端の側面に固執する可能性のある液体を説明するために、少なくとも2つの追加用量をメイクアップ。

3. アポトーシス細胞のマウスオリンパ管刺激(2日目)

  1. 手順を促進するためにマウスを麻酔する前にP200ピペットを使用してアポトーシス細胞の剤の接種を準備する。制度ガイドラインに通じ、約5-10 x 106細胞を含む50μLの体積を、最良の結果を確実にするために、眼咽頭(o.p.)の浸入に利用します。
  2. 2%のイソルランを有する透明なチャンバー内のマウスを1 L/minの流量で、または制度ガイドラインに基づいた。一度に1~2匹のマウスを麻酔する。数は実験者の慰めのレベルによって決まる。呼吸パターンを観察し、深呼吸が呼吸間の2〜3のカウントで見であることを確認します。つま先のピンチに対する応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
  3. マウスを半リカンベントのスポイン位置に配置します。上顎切開器によって中断するために傾斜したアクリルシートボード上のペグの間に結ばれた外科糸を使用する。
  4. 鈍い非隆起のペアを使用して、軽くつかんで、マウスの舌を引っ張ります。P200ピペットを使用して口腔内にアポトーシス細胞を注入します。投与量を与える後、マウスがクラックノイズ1-2sを作るとき、投与は成功する。
    注:アポトーシス細胞の浸透前に舌または口腔咽頭のいずれかに外傷を誘発しないように注意してください。
  5. 手袋をした指で、舌が引き込まれる間、マウスが吸い込むまで鼻をそっとブロックします。口腔に液体が見えなくなるまで鼻を覆い、マウスは2回以上吸入した。
    注:マウスは鼻呼吸を義務付けているので、鼻を覆う場合、マウスが肺にアポトーシス細胞を吸入することを確実にするのに役立ちます。
  6. 接種ボードからマウスを取り出し、麻酔からの回復を可能にするためにケージに戻します。取り消し中に寝具や破片がナレを塞ぐのを防ぐために、マウスを背中に置きます。
  7. マウスが麻酔から回復してから90分待って、すべてのマウスが麻酔から目覚めた後、肺胞マクロファージがアポトーシス細胞の流入を巻き込むことを可能にする。通常、麻酔後の目覚めは1-2分かかりますが、これは着着込の結果/タイミングに影響を与えるべきではありません。

4. 気管支体洗浄液の回収と処理(2日目)

  1. 組織ガイドラインごとに各マウスを安楽死させる 90 分後にマウスがアポトーシス細胞を用いることを麻酔から目覚めた後に.ここで、ケタミンとキシラジンの致死的注射(それぞれ90mg/kgおよび10mg/kg)を使用し、その後に横隔膜を取り除く。
    注:この時点では、肺胞マクロファージがアポトーシス細胞38を感知し、巻き込むのに十分な時間を可能にする。
  2. すべてのマウス(g)をスケールで計量し、体重を記録する。本体重量を使用して BAL 体積 (26.25 mL/kg 体重) を計算します。
  3. マウスを背中に置き、70%のエタノールをスプレーして胸部と頸部を殺菌します。
  4. 外科はさみで腹部側全体に沿って胸骨のすぐ下に2"縦方向のカットを行い、鉗子で胸骨を保持しながら、肺が胸腔に戻るように横隔膜をニック。
  5. 肋骨ケージの側面に沿って横に切断して、肺が溶岩を開くときに膨張する余地を増やしてから、胸腔を鉗子で折りたたみます。
  6. 気管を露出させるために首を通して血管に沿って1"垂直カットを作ります。
  7. 気管から筋肉や組織を引っ張り出し、それを露出させるために2つの鉗子を使用してください。血管系、縦筋、結合組織に囲まれているため、追加の潜在的な出血や気管の切断は避けてください。
  8. 針を使って気管(頭部から約4分の1の距離)を作り、1x PBS(体重26.25mL/kg、体重約0.7-1.0mL)をあらかじめ装填したカニューレ(18G x 1.25インチ)を8-10週齢のメスC5Bに挿入します。ヘア。
  9. PBSの体積をゆっくりと肺に押し込み、肺が膨張し、そのボリュームを注射器に引き戻します。このプロセスを合計 3 回繰り返します。
  10. 15 mLチューブ内の各特定のマウスからプールされた洗浄液を収集します。
  11. 気管支藻胞洗浄を610 x gで6分間4°Cで遠心分離し、上清を1.5mLチューブに集め、-80°Cで凍結します。ペレットは気管支肺胞空間からの細胞を表す。
  12. 収集したBAL液中の残留赤血球を細胞ペレットに1mLのACK RBCリシスバッファーを加えて除去し、その後、よく渦を加え、氷上で1分間lyseします。その後、4mLのPBSを添加してリシス反応を止める。
  13. ペレット細胞を4°Cで6分間610xgで遠心分離し、真空吸引器で上清を吸引する。
  14. 各BALサンプルチューブに1x PBS + 10% FBSの1 mLで細胞を再中断します。各サンプルからの総空域細胞の定量のためにヘモサイトメーター上の細胞を数えます(トリパンブルーはありません)。各サンプルの遠心分離機 120 μL は、中程度の加速度とサイトセントリフュージを使用して、56 x gのスライドに 3 分間使用します。スライドを一晩乾かします。

5. 肺胞マクロファージ発血指数の計算(3日目)

  1. ヘマトキシリンとエオシンでスライドを染色し、各スライドから少なくとも200個の細胞を数え、発泡細胞数と差動細胞数の両方を計算できるようにします。
  2. 生体顕微鏡で明視野設定の下でスライドを表示します(20倍または40倍の目的が最適です)。
  3. 細胞差スライド上の合計200個のマクロファージからアポトーシス細胞取り込みなしでアポトーシスのJurkat T細胞を肺胞マクロファージにファゴサイトスを投与した肺胞マクロファージの数の比率に基づいて、発泡性指数を計算する。比率をデータ入力のパーセンテージに変換します。次の式を使用します。

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Representative Results

O3暴露は肺の炎症および傷害を誘発することが知られており、組織恒常性を維持するためにはエフェロサイトーシスが必要である。C57BL/6J雌マウスを濾過空気(FA)または1ppmO3を3時間曝露し、24時間曝露後に肺炎症および損傷を調べた。O3-露出マウスは、FA対照群と比較して空域におけるマクロファージおよび好中球の有意な増加を示した(図1A,B)。さらに、O3-曝露マウスはBALタンパク質の有意な増加を有し、肺胞上皮バリア機能障害24h後暴露のマーカーである(図1C)。

O3-誘導肺炎症が生体内の肺胞マクロファージエフェロサイト症の欠陥と関連しているかどうかを調べるために、C57BL/6J雌マウスは、口腔内吸引24hポストFAまたはポストO3を介してアポトーシスJurkat T細胞を植留した。露出。Jurkat T細胞におけるアポトーシスは、薬を摂取する前にフローサイトメトリーによって確認され、早期(アネキシンV+PI-および後期(アネキシンV+およびPI+)アポトーシス細胞(図2A、B)において有意な増加があった。曝露レベルおよびインキュベーション時間は、約75%のアポトーシス・ユルカットT細胞の反復的な結果をもたらした。発泡性マクロファージとして識別されたものの拡大画像を図3Aに示す。発血性マクロファージは、通常の肺胞マクロファージ(白色矢印で示される)と比較して、Jurkat T細胞(黒い矢印で示される)を含むマクロファージとして同定された(図3B)。このプロトコルを用いて肺胞マクロファージエフェロサイト症を評価した場合、FA対照と比較してO3-曝露群の発泡性指数が統計的に有意に減少した(図3B,C)。これらのデータは、O3-誘発性肺炎症がアポトーシス細胞のクリアランスの低下に関連していることを示しており、これは肺損傷および炎症を延長する可能性がある。

Figure 1
図1:O3暴露は肺の炎症および傷害を誘発する。 C57BL/6J雌マウスを濾過空気(FA)または1ppmO3に曝露し、3h.24h曝露後、マウスを壊死させ、肺の炎症および傷害を分析した(n=6群)。(A)気管支アルベオラー洗浄剤(BAL)細胞差分を算出し、次いで上皮(エピ)、好酸球(eos)、リンパ球(リンパ球)、マクロファージ(M)、および好中球(PMN)を各スライドから少なくとも200個の細胞で同定した。(B)細胞差の代表的な画像。(C)BAL流体中の全タンパク質。データは±SEM(**p <0.01)として表されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ユルカットT細胞におけるUV誘導アポトーシスの確認Jurkat T細胞をUV架化機(モデル1800)を用いてUV(60mJ/cm2)に曝露した。紫外線曝露後、Jurkat T細胞を37°Cでインキュベートし、5%CO2を4時間用とした。インキュベーション後、Jurkat T細胞をアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、アポトーシスをフローサイトメトリーにより評価した。初期アポトーシス、後期アポトーシス、および壊死細胞は、それぞれアネキシンV+/PI-、アネキシンV+/PI+、アネキシンV-/PI+として同定される。代表的なフローサイトメトリー散布図(10,000イベントが記録された)の未暴露のJurkat T細胞および(B)UV露出ジュルカットT細胞。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:O3暴露は肺胞マクロファージエフェロサイト症を減少させる。 C57BL/6J雌マウスを濾過空気(FA)または1ppmO3に曝露し、3時間24時間後露光後、マウスを約5 x 106アポトーシスのJurkat T細胞で口腔咽頭に浸透させた。1.5時間のインスポット化後、気管支藻胞洗浄(BAL)を行い、200マクロファージ(n=11群)をカウントした後、光顕微鏡検査によりBALマクロファージでエフェロサイチック指数を算出した。(A)発泡性マクロファージの代表的な画像。(B)FAまたはO3曝露後の肺胞マクロファージ(白色矢印)および発泡性マクロファージ(黒色矢印)の同定。(C)FAまたはO3暴露後の発泡性指数の計算(***p < 0.0001)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:350nmの曇った球根を用いた最適でないJurkat T細胞アポトーシス。Jurkat T細胞をUVクロスリンカーを用いて10分間照射し、1時間5%CO2で37°Cでインキュベートした。紫外線曝露後、Jurkat T細胞を37°Cでインキュベートし、5%CO2を4時間用とした。インキュベーション後、Jurkat T細胞をアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、次いで、アポトーシスをフローサイトメトリーにより評価した。初期アポトーシス、後期アポトーシス、および壊死細胞は、それぞれアネキシンV+/PI-、アネキシンV+/PI+、およびアネキシンV-/PI+として同定される。350 nmの球根を有するUV曝露Jurkat T細胞の代表的なフローサイトメトリープロット(10,000イベントが記録された)が示されている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

エフェロサイトーシスは、マクロファージがアポトーシス細胞や破片をクリアし、複数の抗炎症メディエーター9、10、11、12、16を産生する抗炎症プロセスです。 、18.エフェロサイトシスの複数のモデルは、マクロファージが炎症6、7の分解能における重要な細胞である方法についての洞察を提供している。最近、慢性肺疾患の進行は、エフェロサイト症8、9、15、16、17の欠損と関連している。しかし、O3などの大気汚染物質への曝露が、エフェロサイトーシスの欠陥をもたらすかどうかは現時点では不明である。このプロトコルは、O3曝露後の肺胞マクロファージエフェロサイトシスの評価を可能にする。また、光顕微鏡を用いて生体内のエフェロサイトーシスを定量化し、肺微小環境のコンテキストでエフェロサイトーシスの測定を可能にします。このプロトコルはO3暴露の文脈で行われるが、肺炎症および損傷の複数のモデルは、肺胞マクロファージエフェロサイト症を評価するためにこのプロトコルで使用することができる。

既存の方法に対するこの方法の利点は、生理学的環境のコンテキストで肺胞マクロファージを分析する能力である。肺胞マクロファージの外生分析には、アポトーシス細胞によるめっきおよびインキュベーションが含まれる。めっき肺胞マクロファージは、エフェロサイトーシス28、29、30を変化させる可能性のある生理学的およびゲノム変化の両方を誘発することができる。さらに、肺には、マクロファージ機能31、32、33に影響を与えることが知られている肺内層液の界面活性剤および成分を含む微小環境に肺胞マクロファージが存在する。 34、35。我々の方法は、より生理学的に関連する生体操作なしで肺のエフェロサイトーシス測定を可能にする。このプロトコルの将来の応用は、肺微小環境が肺胞マクロファージエフェロサイトーシスをどのように変化させるかについてのより詳細な研究につながる可能性がある。

このプロトコルの重要な構成要素は、肺胞マクロファージエフェロサイト症の評価のためのアポトーシス細胞の生成である。これは、壊死ではなく、アポトーシスを誘発するために正しい紫外線暴露レベルを最適化することを含みます。私たちのプロトコルは、254 nm波長発光電球と60 mJ/cm2の露出レベルを持つUV架リンカーを使用しています。紫外線球の選択は壊死ではなくアポトーシスを作り出すのに重要である。350 nm UV球根は、タンパク質膜架橋および殺菌に優れているが、アポトーシス35、36、37を誘導することができない。350 nm球根を持つ60mJ/cm2に曝露されたJurkat T細胞のドットプロットの例を図4に示し、後期アポトーシスおよび壊死細胞の有意な増加を示す。 さらに、プロトコルは4時間のインキュベーション後のUV露光を使用する。プロトコルのこの部分を最適化するために、我々は以前に様々なインキュベーション時間を調べ、1.5および2hインキュベーション後露光は約40%のアポトーシスしか得られ、5%未満の発泡性指数を有することがわかった(データは示されていない)。現在の文献に基づいて、〜70%〜80%の総アポトーシス細胞は、エフェロサイトシス38を測定するのに十分である。

このプロトコルの制限は、FAまたはO3暴露後に空域内のすべてのマクロファージの発泡性応答を調べ、組織常駐マクロファージと募集されたマクロファージを区別しないことである。肺胞マクロファージと呼ぶ肺胞マクロファージは胎児の肝臓に由来するが、募集されたマクロファージは血液媒介性胚起源に由来する。傷害時に、肺は、細胞表面マーカー28、29、30、31、32、および独特の遺伝学および発現を有する非常に不均一なマクロファージ集団を有することができる。33、34、35.これらのマクロファージ集団の免疫学的応答と機能が異なることは知られている。しかし、最近の研究は、組織常駐マクロファージが募集されたマクロファージ29、30、31と比較して、より大きな発泡性反応を有することを示している。組織常駐マクロファージと募集マクロファージの発泡性応答の決定は、現在のプロトコルで評価することができる。しかし、マクロファージ集団はFACSによって精製され、分析のためにスライド上にめっきされる必要があります。さらに、このプロトコルは、生まれつき、市販のマウスの1株において肺胞マクロファージの発血機能を評価するだけです。マウスの異なる株は、肺炎症39、40を含むO3暴露に対して異なる応答を示することが以前に報告されている。従って、調べた株に基づいて肺胞マクロファージエフェロサイトシスに違いが生じてもよい。これは、インビボアッセイでこれを実行する際に考慮すべき変数です。

結論として、上記のプロトコルは、生体内での肺胞マクロファージエフェロサイト症の評価を可能にする。このプロトコルは費用対効果が高く、シンプルで、広く利用できるアッセイです。さらに、この方法は、様々な肺の侮辱がマクロファージの発泡性症を変化させる方法の理解を高めるために、肺損傷および/または炎症の多数のモデルに適用することができる。

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Disclosures

著者は利益相反を宣言しない。

Acknowledgments

この研究は、健康効果研究所ウォルターA.ローゼンブリス賞とNIEHS R01ES028829(K.M.Gに)によって資金提供されています。肺胞マクロファージの代表的な画像を得る支援をいただいたダイアン・ウォルターズ博士(ECU生理学科)に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

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オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価
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Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

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