Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

I vivo vurdering av Alveolære macrophage Efferocytosis etter ozon eksponering

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 2Research Triangle Park, National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å avgjøre om eksponering for ozon, et kriterium luftforurensning, svekker alveolære macrophage efferocytosis in vivo. Denne protokollen benytter ofte brukte reagenser og teknikker og kan tilpasses flere modeller av lungeskade for å bestemme effekter på alveolære macrophage efferocytosis.

Abstract

Ozon (O3) er et kriterium luft forurensende som forverrer og øker forekomsten av kroniske lungesykdommer. O3 eksponering er kjent for å indusere lungebetennelse, men lite er kjent om hvordan eksponeringen endrer prosesser viktig for oppløsningen av betennelse. Efferocytosis er en oppløsning prosess, der makrofager phagocytize apoptotisk celler. Formålet med denne protokollen er å måle alveolære macrophage efferocytosis etter O3-indusert lungeskade og betennelse. Flere metoder har blitt beskrevet for å måle efferocytosis; men de fleste krever ex vivo manipulasjoner. Beskrevet i detalj her er en protokoll for å måle in vivo alveolære macrophage efferocytosis 24 timer etter O3 eksponering, noe som unngår ex vivo manipulering av makrofager og fungerer som en enkel teknikk som kan brukes til å nøyaktig representere forstyrrelser i Denne løsningsprosessen. Protokollen er en teknisk ikke-intensiv og relativt rimelig metode som involverer hele kroppen O3 inhalasjon etterfulgt av orofaryngeal aspirasjon av apoptotisk celler (dvs. Jurkat T celler) mens under narkose. Alveolære macrophage efferocytosis måles deretter ved lys mikroskopi evaluering av makrofager som er samlet inn fra lunges (BAL-tømming). Efferocytosis måles til slutt ved å beregne en efferocytic indeks. Kollektivt, de skisserte metodene kvantifisere efferocytic aktivitet i lungene in vivo samtidig tjene til å analysere negative helseeffekter av O3 eller andre inhalert fornærmelser.

Introduction

Lunge er stadig utsatt for miljømessige fornærmelser, inkludert luft partikler, virus, bakterier, og oksiderende gasser som utløser lungebetennelse1,2,3. Disse fornærmelser kan kompromittere gassutveksling og indusere irreversible vevsskade4,5. Alveolære makrofager, som utgjør ca 95% av immunceller funnet i murine og menneskelige lunger ved homeostase, er kritiske regulatorer av lungebetennelse etter miljømessige fornærmelser1,2, 3,4,5. Alveolære makrofager er avgjørende i verts forsvaret ved å phagocytizing og eliminere patogener. Nylig, alveolære makrofager har vist å fremme vev homeostase og oppløsningen av betennelse gjennom efferocytosis6,7. Efferocytosis er en phagocytic prosess der makrofager sluker og eliminere apoptotisk celler8,9,10. Efferocytosis også resulterer i produksjon av meglere (dvs. Il-10, TGF-β, PGE2, og nitrogenoksid) som ytterligere utfylle prosessen, noe som resulterer i oppløsningen av betennelse9,10,11 ,12,16,18. Denne prosessen er nødvendig for å forebygge sekundær nekrose og fremme vev homeostase12,13,14. Flere studier har knyttet svekket efferocytosis med ulike kroniske lungesykdommer, inkludert astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, og idiopatisk pulmonal fibrose8,9,15, 16,17.

O3 er et kriterium luft forurensende som forverrer og øker forekomsten av kroniske lungesykdommer19,20,21. O3 induserer lungebetennelse og skade og er kjent for å svekke alveolære macrophage fagocytose av bakterielle patogener22,23. Det er imidlertid ukjent om O3 svekker alveolære macrophage efferocytosis. Gransker O3-indusert endringer i alveolære macrophage efferocytosis vil gi potensiell innsikt i hvordan eksponering kan føre til kroniske lungesykdom forekomst og forverring. Beskrevet nedenfor er en enkel metode for å evaluere alveolære macrophage efferocytosis i lungene av kvinnelige mus etter akutt O3 eksponering.

Den skisserte metoden disponerer flere fordeler fremfor andre efferocytosis protokoller som vanligvis brukes i feltet ved å eliminere bruken av kostbare fluorescerende fargestoffer, omfattende strømnings flowcytometri målinger og ex vivo-manipulering av alveolære makrofager24 ,25. I tillegg denne protokollen tiltak alveolære macrophage efferocytosis i sammenheng med lunge mikromiljøet, som kan påvirke macrophage funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av Øst Carolina universitet.

1. ozon (O3) og filtrert luft eksponering (dag 1)

  1. Plasser maksimalt 12 kvinnelige C57BL/6J mus, 8-12 uker gamle, i et stål bur (med 12 separate rom) med netting lokk i en O3 eksponerings kammer.
  2. Plasser termometeret i eksponerings kammeret med buret for å nøyaktig registrere temperatur og fuktighet.
  3. Slå på oksygen og ultrafiolett (UV) lys som er festet til apparatet.
    Merk: regulert luftstrøm (> 30 luft Skift/h) med kontrollert temperatur (22-23 ° c) og relativ luftfuktighet (45%-50%) oppnås ved O3 apparatet. O3 er generert av systemet i eksponeringen kammeret ved å dirigere 100% oksygen gjennom en UV-lys generator, deretter blande med en filtrert lufttilførsel.
  4. Juster O3 konsentrasjon til 1 ppm og regelmessig rekord O3 nivåer hver 10 min for 3 t. kontinuerlig overvåke temperatur og fuktighet i kammer luft, som er O3 konsentrasjon med en UV-lys fotometer.
    Merk: filtrerte luft eksponeringer utføres i et lignende apparat, med bare en filtrert lufttilførsel som strømmer gjennom eksponerings kammeret.
  5. Retur dyrene å deres respekt burene med bedding, næringen, og vann annonse lib etter 3 h av O3/filtered luften avsøring.

2. utarbeidelse av Jurkat T cellelinje (dag 2)

Merk: alle prosedyrer bør gjennomføres i en klasse II biologisk sikkerhetskabinett.

  1. Kultur Jurkat T-celler i 24 mL basalcelle kultur medium + 10% FBS + 5% penicillin/Streptomycin ved 37 ° c + 5% CO2 (tabell av materiale). Jurkat T-celler er en suspensjon cellelinje som kan opprettholdes gjennom passaging 1:6-1:8 i pre-varmet dyrking Media hver 3 dager. Må ikke ristes.
  2. For å forberede apoptotisk celler, dyrke dem til 90% confluency i hver kolbe (som tar 3-4 dager å oppnå etter passaging). For denne studien, bruk celler fra fem T75 flasker for å få tilstrekkelig antall celler som brukes i denne protokollen.
    Merk: en confluent kolbe inneholder ca 20-24 millioner celler.
  3. Pipetter opp celler (som er hele flasken) fra hver kolbe (ca 24 mL) og overføre celler til en steril 50 mL konisk rør ved hjelp av en serologisk pipette. Bruk flere koniske rør for flere flasker.
  4. Count celler ved å fjerne en 11 μL alikvot av celler fra 50 mL konisk rør og bland med 11 μL av trypan blå flekk og pipette 11 μL på hemocytometer lysbilder.
  5. Sett inn lysbilde i en automatisert celle teller og registrere antall levende celler for å beregne den totale celle tellingen i hver kolbe ved å multiplisere antall levende celler med 24, som hver kolbe inneholder 24 mL medier.
  6. Sentrifuger celle fjæringen ved 271 x g i 5 min ved romtemperatur (RT) for pellets celler.
  7. Kast supernatanten ved aspirasjon og resuspend celle pellet i media for å oppnå 3,0 x 106 celler per ml.
  8. Alikvot 5 mL av cellene i 100 mm x 20 mm vevs kultur retter (omtrent ni retter vil bli brukt; den totale mengden av celler i hver rett bør være ~ 15 x 106).
  9. Bruk en rett for kontroll/ueksponerte, og de resterende rettene vil bli utsatt for UV.
  10. Sett UV-tverrbinder på riktig energi nivå, trykk på energi knappen, og skriv inn "600" ved hjelp av det numeriske tastaturet, som maskinen vil lese som 600 μJ/cm2 x 100.
    Merk: UV tverrbinder energi enheter er i μJ/cm2 x 100; Derfor, for å oppnå 60 millijoules/cm2, Konverter enheter til å matche UV-tverrbinder.
  11. Irradiate alle retter med celler, ikke inkludert kontroll, på 60 millijoules (mJ)/cm2 ved hjelp av UV-tverrbinder. Fjern toppdekselet på vevs kultur rettene under UV-eksponering, da UV-lys ikke vil trenge gjennom plastdekslet.
  12. Ruge alle rettene i en cellekultur inkubator, inkludert ueksponerte kontroll, ved 37 ° c ved 5% CO2 for 4 h.
  13. Bekreft apoptose ved å strømme flowcytometri ved hjelp av en apoptose som inneholder annexin V og propidium iodide (PI) (markører for apoptose og nekrose) etter 4 timer inkubasjons, i henhold til produsentens anvisninger26, 27i det.
    Merk: Irradiirujushhaja Jurkat T-celler i UV-tverrbinder på et energi nivå på 600 μJ/cm2, etter en 4 h inkubasjons vil føre til ≥ 75% av apoptotisk (både tidlig og sent) celler som har mer tidlig apoptotisk fenotype enn sent apoptotisk fenotype. Dette gjør det enklere for alveolære makrofager å gjenkjenne dem og sluker som deres membraner er kompromissløs, i motsetning til sent apoptotisk celler, som fører til en høyere efferocytic indeks og mer nøyaktig Imaging av alveolære macrophage efferocytosis i denne studien.
    1. Pool 333 μL (1 x 106 celler) av Jurkat T-celler fra flere retter (både "ingen UV" og "UV-eksponert") sammen for å bruke for kompensasjon analyse rør.
    2. Alikvot 333 μL av Jurkat T-celler i en unstained, annexin V enkelt flekk, PI enkelt flekk, ingen UV-kontroll, og 600 μJ/cm2 UV-eksponert merket flyt flowcytometri rør.
    3. Sentrifuger rør ved 188 x g i 5 min ved RT og Dekanter supernatanten.
    4. Vask celler ved blanding i 500 μL av kaldt, 1x fosfat-bufret saltvann (PBS).
    5. Sentrifuger og pellet celler ved 188 x g for 5 min ved RT. kast supernatanten etter sentrifugering.
    6. Forbered 400 μL av 1x bindings buffer per strømningsrør ved å fortynne 10x bindende buffer med destillert vann mens cellene er sentrifugering.
    7. Klargjør annexin V og PI inkubasjons reagens (100 μL per prøve/rør) i henhold til produsentens anvisninger.
    8. Dekanter supernatanten etter sentrifugering og forsiktig resuspend alle rør i 400 μL av 1x bindende buffer, legg deretter til 100 μL av annexin V inkubasjons reagens til hvert prøverør. Til slutt, tilsett 100 μL av annexin V enkelt flekk og PI enkelt flekk til sine respektive rør, men ikke Legg noe utover 1x bindende buffer til unstained røret.
    9. Ruge rør i mørket for 15 min ved RT.
    10. Sentrifuger alle celler på 188 x g for 5 min ved RT og Dekanter supernatanten.
    11. Resuspend celler i 400 μL av 1x bindende buffer, og deretter analysere prøvene for apoptose ved flyt flowcytometri. Samle minst 10 000 hendelser per rør for å tillate nøyaktig fremstilling av farging.
  14. Kombiner alle bestrålt celler fra retter til en 50 mL konisk rør og pellet celler ved sentrifugering ved 271 x g i 5 min ved RT.
  15. Kast supernatanten fra røret ved aspirasjon og resuspend celler i 24 mL av sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) og pellet celler ved sentrifugering ved 271 x g i 5 min ved romtemperatur.
  16. Kast supernatanten fra røret ved aspirasjon og resuspend celler i mengden PBS brukes til dosering mus godkjent av IACUC. Dosen som brukes er mellom 5-10 x 106 celler/50 μL per mus; Derfor, for 10 mus, resuspend i 500 μL (antall celler i hver dose varierer avhengig av hvor mange celler som er kultivert for bestråling).
    Merk: makeup minst to ekstra doser for å gjøre rede for væske som kan holde seg til sidene av pipette spissen resulterer i tap av celler.

3. murine orofaryngeal drypping av apoptotisk celler (dag 2)

  1. Forbered doserings inokulum av apoptotisk celler ved hjelp av en P200 pipette før anesthetizing mus for å fremskynde prosedyren. I henhold til de institusjonelle retningslinjene blir et volum på 50 μL som inneholder ca. 5-10 x 106 celler benyttet for orofaryngeal (o.p.) drypping for å sikre best mulig resultat.
  2. Bedøve mus i et klart kammer med 2% isoflurane med en strømningshastighet på 1 L/min eller i henhold til de institusjonelle retningslinjene. Bedøve en til to mus om gangen; nummeret bestemmes av eksperimentator komfort. Observer puste mønsteret og Bekreft dype åndedrag er synlige med 2-3 s teller mellom åndedrag. Sjekk for dybden av anestesi ved mangel på respons på tå knipe.
  3. Plasser musen i en semi-tilbakelent liggende posisjon. Bruk en kirurgisk streng knyttet mellom pinnene på en skråstilt akryl ark bord å suspendere av maksillære fortenner.
  4. Ved hjelp av et par sløv ikke-ridged tang, lett Grip og dra musen tungen. Innpode de apoptotisk cellene inn i munnhulen med en P200 pipette. Doseringen er vellykket når musene lager en sprakende lyd 1 – 2 s etter å ha gitt dosen.
    Merk: Pass på å unngå å indusere traumer enten til tungen eller oropharynx før apoptotisk cellen drypping.
  5. Med en hansker finger, forsiktig blokkere nesen til musen inhalerer mens tungen er trukket. Dekk til nesen til ingen væske er synlig i munnhulen og musen har tatt to eller flere inhalasjoner.
    Merk: som mus er forplikte nese breathers, som dekker nesen bidrar til å sikre at musen vil inhalere de apoptotisk cellene inn i lungene.
  6. Fjern musen fra inoculation bord og returnere den til buret for å tillate utvinning fra anestesi. Plasser musen på ryggen for å hindre at sengetøy eller rusk blokkerer nares under revovery.
  7. Vent 90 min etter at musen gjenoppretter fra anestesi å tillate alveolære makrofager å sluker tilstrømningen av apoptotisk celler etter at alle musene har vekket fra anestesi. Vanligvis vil oppvåkning etter anestesi ta 1 – 2 min, som ikke skal påvirke utfallet/tidspunktet for drypping.

4. Oppsamling og behandling av lunges av tømming (dag 2)

  1. Euthanize hver mus per institusjonelle retningslinjer 90 min etter at musen har våknet opp fra anestesi fra dosering med apoptotisk celler. Her brukes en dødelig injeksjon av ketamin og xylazine (henholdsvis 90 mg/kg og 10 mg/kg) etterfulgt av excising membranen.
    Merk: Dette tids punktet gir tilstrekkelig tid for alveolære makrofager til fornuft og sluker apoptotisk celler38.
  2. Veie alle mus (g) på en skala og rekord vekter. Bruk kroppsvekten til å beregne BAL-volum (26,25 mL/kg kroppsvekt).
  3. Plasser mus på ryggen og spray 70% etanol å sterilisere brystet og nakken området.
  4. Lag en 2 "langsgående kuttet rett under brystbenet langs hele ventrale side med kirurgisk saks, og mens du holder brystbenet med tang, Nick membranen for å tillate lungene å falle tilbake i brystet hulrom.
  5. Skjær sideveis langs sidene av ribbeinet buret slik at lungene mer plass til å ekspandere når lavaging, deretter brette brystet hulrommet tilbake med tang.
  6. Lag en 1 "vertikal kuttet opp langs blodkar gjennom nakken for å avdekke luftrøret.
  7. Bruk to tang for å trekke muskler og vev av luftrøret og utsett det. Unngå ytterligere potensielle blødninger og kutte luftrøret, siden det er omgitt av blodkar, langsgående muskler, og bindevev.
  8. Bruk en nål til å lage en spalte i luftrøret (omtrent en fjerdedel av avstanden ned fra hodet) og sett inn en kanyle (18 G x 1,25 ") med en sprøyte forhåndslastet med 1x PBS (26,25 mL/kg kroppsvekt, ~ 0,7-1,0 mL i en 8-10 uke gammel kvinnelig C57Bl/6J mus) caudally inn i Trac hea.
  9. Skyv volumet av PBS inn i lungene sakte å la lungene å blåse deretter trekke volumet ut igjen i sprøyten. Gjenta denne prosessen totalt 3 ganger.
  10. Samle inn den grupperte tømming væsken fra hver enkelt mus i en 15 mL tube.
  11. Sentrifuger den lunges tømming ved 610 x g for 6 min ved 4 ° c og samle supernatanten i et 1,5 ml rør og fryse ved-80 ° c. Pellet-en representerer celler fra lunges plass.
  12. Fjern rester av røde blodceller i innsamlede BAL Fluid ved å legge 1 mL av ACK RBC lyseringsbuffer til cellen pellet, deretter Vortex godt og lyse for 1 min på isen. Deretter legger du til 4 mL PBS for å stanse lyse Rings reaksjonen.
  13. Pellet celler ved sentrifugering ved 610 x g for 6 min ved 4 ° c og aspirer supernatanten med et vakuum aspirator.
  14. Resuspend celler i 1 mL 1x PBS + 10% FBS til hvert BAL prøverør. Count celler på en hemocytometer for kvantifisering av totalt luftrom celler fra hvert utvalg (ingen trypan blå). Sentrifuger 120 μL av hver prøve på lysbilder ved 56 x g i 3 min, ved hjelp av middels akselerasjon og en cytocentrifuge. Tørk lysbildene over natten.

5. beregning av alveolære macrophage efferocytic indeks (dag 3)

  1. Flekk det lysbilder med hematoksylin og eosin å regne med beregning av begge to efferocytic og differansen cellen teller, med det vil si 200 celler beregnet fra hver skyve.
  2. Vis lysbilder under en lys-felt innstilling på et biologisk mikroskop (en 20x eller 40x objektiv vil fungere best).
  3. Beregn efferocytic indeks basert på forholdet mellom antall alveolære makrofager som phagocytosed apoptotisk Jurkat T-celler til alveolære makrofager uten apoptotisk celle opptak av totalt 200 makrofager på en celle differensial lysbilde. Konvertere forholdet til en prosent for data input. Bruk følgende ligning:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

O3 eksponering er kjent for å indusere lungebetennelse og skade, og efferocytosis er nødvendig for å opprettholde vev homeostase. C57BL/6J kvinnelige mus ble utsatt for filtrert luft (FA) eller 1 ppm O3 for 3 h og obduksjon 24 h post-eksponering for å undersøke lungebetennelse og skade. O3-eksponert mus vist en betydelig økning i makrofager og nøytrofile i luftrom i forhold til FA kontrollgruppen (figur 1a, B). I tillegg, O3-eksponerte mus hadde en betydelig økning i Bal protein, en markør for alveolære epitel barriere dysfunksjon 24 h etter eksponering (figur 1C).

For å finne ut om O3-indusert lungebetennelse er forbundet med defekter i alveolære macrophage efferocytosis in vivo, C57BL/6J kvinnelige mus ble innpodet med apoptotisk Jurkat T-celler via orofaryngeal aspirasjon 24 h post-FA eller post-O3 eksponeringen. Apoptose i Jurkat T celler ble bekreftet av Flow flowcytometri før dosering, og det var en betydelig økning i tidlig (annexin V+ PI- og sent (ANNEXIN v+ og pi+) apoptotisk celler (figur 2a, B). Eksponeringsnivået og inkubasjonstiden resulterte i repeterende resultater av ~ 75% apoptotisk Jurkat T-celler. Et forstørret bilde av det som ble identifisert som en efferocytic macrophage er vist i Figur 3A. Efferocytic makrofager ble identifisert som makrofager som hadde omsluttet en Jurkat T-celle (indikert med svarte piler), sammenlignet med vanlige alveolære makrofager (indikert med hvite piler) (Figur 3B). Når alveolære macrophage efferocytosis ble vurdert å benytte protokollen, var det en statistisk signifikant reduksjon i efferocytic indeks for O3-eksponert gruppe SAMMENLIGNET med FA-kontroller (Figur 3B, C). Disse dataene tyder på at O3-indusert lungebetennelse er forbundet med redusert clearance av apoptotisk celler, som kan forlenge lungeskade og betennelse.

Figure 1
Figur 1: O3 eksponering induserer lungebetennelse og skade. C57BL/6J kvinnelige mus ble utsatt for filtrert luft (FA) eller 1 ppm O3 for 3 h. 24 h post-eksponering, mus ble obduksjon å analysere lungebetennelse og skade (n = 6 per gruppe). (A) lunges tømming (Bal) celle forskjeller ble beregnet, deretter epitel (Epi), eosinofile (EOS), lymfocytter (lymfe), makrofager (Mɸ), og NØYTROFILE (PMN) ble identifisert med minst 200 celler telles fra hvert lysbilde. (B) et representativt bilde av cellulære forskjeller. (C) totalt PROTEIN i Bal væsken. Data uttrykkes som ± SEM (* * p < 0,01). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: bekreftelse av UV-indusert apoptose i Jurkat T-celler. Jurkat T-celler ble eksponert for UV (60 mJ/cm2) ved hjelp av en UV-Tverrbinder (modell 1800). Etter UV eksponering, Jurkat T celler ble inkubert ved 37 ° c med 5% CO2 for 4 h. Etter inkubasjons var Jurkat T-celler farget med annexin V og propidium iodide (PI), og apoptose ble evaluert av strømnings flowcytometri. Tidlig apoptotisk, sen apoptotisk, og nekrotisk celler er identifisert som annexin V+/PI-, annexin v+/PI+, annexin v-/PI+, henholdsvis. Representative Flow flowcytometri scatter tomter (med 10 000 hendelser registrert) av (A) ueksponerte Jurkat t-celler og (B) UV-eksponert Jurkat T-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: O3 eksponering minsker alveolære macrophage efferocytosis. C57BL/6J kvinnelige mus ble utsatt for filtrert luft (FA) eller 1 ppm O3 for 3 h. 24 h post-eksponering, mus ble oropharyngeally innpodet med ca 5 x 106 apoptotisk Jurkat T celler. 1,5 h etter drypping, lunges tømming (BAL) ble utført, og efferocytic indeksen ble beregnet i BAL makrofager av lett mikroskopi etter telling 200 makrofager (n = 11 per gruppe). (A) representativt bilde av en efferocytic macrophage. (B) identifisering av alveolære makrofager (hvite piler) og efferocytic macrophage (svarte piler) etter FA eller O3 eksponering. (C) beregning av efferocytic indeks etter FA eller O3 eksponering (* * * p < 0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: suboptimal Jurkat T celle apoptose bruke 350 Nm frostet pærer. Jurkat T-celler ble bestrålt ved hjelp av UV-Tverrbinder i 10 min og inkubert ved 37 ° c ved 5% CO2 for 1 time. Etter UV eksponering, Jurkat T celler ble inkubert ved 37 ° c med 5% CO2 for 4 h. Etter inkubasjons ble Jurkat T celler farget med annexin V og propidium iodide (PI), deretter ble apoptose evaluert av strømnings flowcytometri. Tidlig apoptotisk, sen apoptotisk, og nekrotisk celler er identifisert som annexin V+/PI-, annexin v+/PI+, og annexin v-/PI+, henholdsvis. Representative Flow flowcytometri tomter (med 10 000 hendelser registrert) av UV-eksponert Jurkat T-celler med 350 Nm pærer vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efferocytosis er en anti-inflammatorisk prosess der makrofager Clear apoptotisk celler og rusk samt produsere flere anti-inflammatorisk meglere9,10,11,12,16 ,18. Flere modeller av efferocytosis har gitt innsikt i hvordan macrophage er en kritisk celle i oppløsningen av betennelse6,7. Nylig har progresjon av kroniske lungesykdommer er forbundet med defekter i efferocytosis8,9,15,16,17. Det er imidlertid foreløpig uklart om eksponering for luftforurensning som O3, resulterer i defekter i efferocytosis. Denne protokollen gjør det mulig å evaluere alveolære macrophage efferocytosis etter O3 eksponering. Det kvantifiserer også efferocytosis in vivo ved hjelp av lys mikroskopi og tillater måling av efferocytosis i sammenheng med lunge mikromiljøet, uten ex vivo-manipulasjoner eller kostbare fluorescerende fargestoffer. Selv om denne protokollen er utført i sammenheng med O3 eksponering, kan flere modeller av lungebetennelse og skade brukes med denne protokollen for å evaluere alveolære macrophage efferocytosis.

Fordelene med denne metoden over eksisterende metoder er dens evne til å analysere alveolære makrofager i sammenheng med fysiologisk miljø. Ex vivo-analyse av alveolære makrofager inkluderer plating og inkubasjons med apoptotisk celler. Plating alveolære makrofager kan indusere både fysiologiske og genomisk endringer som kan endre efferocytosis28,29,30. I tillegg, i lungene, alveolære makrofager finnes i en mikromiljøet som inneholder overflateaktivt middel og komponenter av lunge fôr væsken som er kjent for å påvirke macrophage funksjon31,32,33, 34,35. Vår metode tillater efferocytosis målinger i lungene uten ex vivo manipulasjoner, som er mer fysiologisk relevant. Fremtidige anvendelser av denne protokollen kan føre til mer dyptgående studier om hvordan lunge mikromiljøet kan endre alveolære macrophage efferocytosis.

En kritisk komponent i denne protokollen er generering av apoptotisk celler for evaluering av alveolære macrophage efferocytosis. Dette innebærer å optimalisere riktig UV eksponeringsnivå å indusere apoptose, ikke nekrose. Vår protokoll bruker UV-tverrbinder med 254 NM bølgelengde utslipps pærer og et eksponeringsnivå på 60 mJ/cm2. Den UV pære valgene er avgjørende i å produsere apoptose, ikke nekrose. 350 Nm UV pærer er utmerket for protein membran kryss-linking og sterilisering, men unnlater å indusere apoptose35,36,37. Et eksempel prikk plott av Jurkat T celler eksponert for 60 mJ/cm2 med 350 Nm pærer er vist i Figur 4 med en betydelig økning i slutten apoptotisk og nekrotisk celler. I tillegg bruker protokollen en 4 h inkubasjons etter UV eksponering. For å optimalisere denne delen av protokollen, har vi tidligere undersøkt ulike inkubasjons ganger og funnet ut at 1,5 og 2 h inkubasjons etter eksponering bare gitt ca 40% apoptose, med en efferocytic indeks på mindre enn 5% (data ikke vist). Basert på dagens litteratur, ~ 70%-80% totalt apoptotisk celler er tilstrekkelig for å måle efferocytosis38.

En begrensning til denne protokollen er at den undersøker efferocytic respons av alle makrofager i luftrom etter FA eller O3 eksponering og skiller ikke vev bosatt makrofager fra rekruttert makrofager. Den lunge bosatt macrophage kalles alveolære macrophage stammer fra fosterets leveren, mens rekruttert makrofager avledet fra en blod-båret embryonale opprinnelse. Ved skade kan lungene ha en svært heterogen macrophage befolkning med unik genetikk og uttrykk for celle overflate markører28,29,30,31,32, 33,34,35. Det er kjent at den immunologiske responsen og funksjonen til disse macrophage populasjoner er forskjellige; nyere studier har imidlertid indikert at vevet bosatt macrophage har en større efferocytic respons sammenlignet med rekruttert makrofager29,30,31. Fastsettelse av efferocytic respons av vev bosatt makrofager g. rekruttert makrofager kan vurderes med gjeldende protokoll; imidlertid må macrophage populasjoner renses ved FACS og belagt på lysbilder for analyse. I tillegg vurderer denne protokollen bare alveolære macrophage efferocytic funksjon i en stamme av innavlet, kommersielt tilgjengelige mus. Det har tidligere blitt rapportert at ulike stammer av mus viser ulike reaksjoner på O3 eksponering, inkludert lungebetennelse39,40. Derfor kan det være forskjeller i alveolære macrophage efferocytosis basert på belastningen undersøkt. Dette er en variabel som bør vurderes når du utfører denne in vivo-analysen.

Som konklusjon, protokollen beskrevet ovenfor tillater evaluering av alveolære macrophage efferocytosis in vivo. Denne protokollen er kostnadseffektiv og enkel, noe som gjør det til en analyse som kan bli mye utnyttet. Videre kan denne metoden brukes til mange modeller av lungeskade og/eller betennelse for å øke forståelsen av hvordan ulike lunge fornærmelser kan endre macrophage efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne studien er finansiert av Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award og NIEHS R01ES028829 (til K. M. G). Vi vil gjerne takke Dr. Dianne Walters (Department of fysiologi, ECU) for hennes hjelp med å skaffe representative bilder av alveolære makrofager.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
  2. Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
  3. Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
  4. Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
  5. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
  6. Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
  7. Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
  8. Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
  9. Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
  10. Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
  11. Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
  12. O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
  13. Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
  14. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  15. Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
  16. Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
  17. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
  18. Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
  19. Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
  20. Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
  21. Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
  22. Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
  23. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  24. Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
  25. Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
  26. Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
  27. Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
  28. Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
  29. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  30. Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
  31. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
  32. Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
  33. Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
  34. Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
  35. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  36. Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
  37. Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
  38. Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
  39. Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
  40. Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).

Tags

Immunologi og infeksjon luftforurensning ozon lunge betennelse alveolære macrophage efferocytosis
I vivo vurdering av Alveolære macrophage Efferocytosis etter ozon eksponering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hodge, M. X., Reece, S. W.,… More

Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter