Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 2Research Triangle Park, National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

Bu el yazması, hava kirletici bir kriter olan ozon maruziyetinin alveoler makrofaj efferositozisinin in vivo'yu bozup bozmadığını belirleyen bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol yaygın olarak kullanılan reaktifler ve teknikler kullanır ve alveoler makrofaj eferositoz üzerindeki etkilerini belirlemek için pulmoner yaralanma birden fazla modeladapte edilebilir.

Abstract

Ozon (O3),kronik akciğer hastalıklarının görülme sıklığını arttıran ve şiddetlendiren bir kriterdir. O3 maruziyetin pulmoner inflamasyonu tetiklemesi bilinmektedir, ancak maruz kalmanın inflamasyonun çözümü için önemli süreçleri nasıl değiştirdiği konusunda çok az şey bilinmektedir. Eferositoz, makrofajların apoptotik hücreleri fagositize ettiği bir çözüm sürecidir. Bu protokolün amacı O3-indüklenen akciğer hasarı ve inflamasyon aşağıdaki alveoler makrofaj eferositoz ölçmektir. Eferositozun ölçümü için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır; ancak, çoğu ex vivo manipülasyonlar gerektirir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan o3 pozlama dan sonra 24 saat in vivo alveolar makrofaj efferocytozis ölçmek için bir protokol, hangi makrofajlar ex vivo manipülasyon önler ve doğru pertürbations temsil etmek için kullanılabilecek basit bir teknik olarak hizmet vermektedir bu çözüm süreci. Protokol, genel anestezi altında yken tüm vücut O3 inhalasyonu ve ardından apoptotik hücrelerin orofatojiel aspirasyonu (jurkat T hücreleri) içeren teknik olarak yoğun olmayan ve nispeten ucuz bir yöntemdir. Alveoler makrofaj eferositoz bronkoalveoler (BAL) lavajından toplanan makrofajların ışık mikroskobu ile ölçülür. Eferositoz sonunda bir eferositik indeks hesaplanarak ölçülür. Topluca, ana hatlarıyla yöntemler in vivo akciğerde eferositik aktivite ölçmek de O3 veya diğer inhale hakaret olumsuz sağlık etkilerini analiz etmek için hizmet vermektedir.

Introduction

Akciğer sürekli hava partikülleri, virüsler, bakteriler ve akciğer iltihabı tetikleyen oksidan gazlar da dahil olmak üzere çevresel hakaretlere maruz kalmaktadır1,2,3. Bu hakaretler gaz değişimini tehlikeye atabilir ve geri dönüşü olmayan doku yaralanmasına neden olabilir4,5. Homeostazı'nda rürve insan akciğerlerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin yaklaşık %95'ini oluşturan alveoler makrofajlar, çevresel hakaretlerden sonra pulmoner inflamasyonun kritik düzenleyicileridir1,2, 3,4,5. Alveoler makrofajlar fagositosiyon ve patojenleri ortadan kaldırarak konak savunma sırasında esastır. Son zamanlarda, alveoler makrofajlar doku homeostazı ve eferositoz yoluyla inflamasyon çözünürlüğü teşvik gösterilmiştir6,7. Eferositoz hangi makrofajlar yutmak ve apoptotik hücreleri ortadan kaldırmak bir fagositiksüreçtir 8,9,10. Eferositoz aynı zamanda aracıların (il-10, TGF-β, PGE2ve nitrik oksit) üretimine de yol açar ve bu da süreci daha da güçlendirerek inflamasyonun çözülmesiyle sonuçlanır9,10,11 ,12,16,18. Bu süreç sekonder nekroz önlenmesi ve doku homeostaz teşvik etmek için gereklidir12,13,14. Çeşitli çalışmalar astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve idiyopatik pulmoner fibrozis8,9,15dahil olmak üzere çeşitli kronik akciğer hastalıkları ile bozulmuş eferositoz bağlantılı var, 16,17.

O3, kronik akciğer hastalıklarının görülme sıklığını arttıran ve artıran bir kriterdir19,20,21. O3 pulmoner inflamasyon ve yaralanma neden olur ve bakteriyel patojenlerin alveoler makrofaj fagositoz bozan bilinmektedir22,23. Ancak, O3 alveoler makrofaj eferositoz bozar olup olmadığı bilinmemektedir. Alveoler makrofaj eferositozda O 3-indüklenen değişikliklerin araştırılması, maruziyetin kronik akciğer hastalığı insidansına ve alevlenmeye nasıl yol açabileceği konusunda potansiyel bir fikir verecektir. Aşağıda açıklanan akut O3 maruziyeti sonrası kadın farelerin akciğerlerinde alveoler makrofaj eferositoz değerlendirmek için basit bir yöntemdir.

Ana hatlarıyla kullanılan yöntem, pahalı floresan boyaların, geniş akış sitometri ölçümlerinin ve alveoler makrofajların ex vivo manipülasyonunun ortadan kaldırılmasıyla bu alanda yaygın olarak kullanılan diğer eferositoz protokollerine göre çeşitli avantajlar sağlar24 ,25. Ayrıca, bu protokol, makrofaj fonksiyonunu etkileyebilen akciğer mikroçevre bağlamında alveoler makrofaj eferositozunu ölçer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntemler, Doğu Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ozon (O3)ve filtrelenmiş hava maruziyeti (Gün 1)

  1. 8-12 haftalık 12 dişi C57BL/6J fareyi, tel örgü kapaklı çelik bir kafese , O3 pozlama odasına yerleştirin.
  2. Sıcaklığı ve nemi doğru bir şekilde kaydetmek için termometreyi kafesle birlikte pozlama odasına yerleştirin.
  3. Cihaza bağlı oksijen ve ultraviyole (UV) ışığını açın.
    NOT: Kontrollü sıcaklık (22-23 °C) ve bağıl nem (%45-50) ile düzenlenmiş hava akımı (>30 hava değişimi/h) O3 aparatı ile elde edilir. O3 bir UV ışık jeneratörü ile% 100 oksijen yönlendirerek maruz kalma odasında sistem tarafından oluşturulur, daha sonra filtrelenmiş bir hava kaynağı ile karıştırma.
  4. O3 konsantrasyonu 1 ppm'e ayarlayın ve uv ışık fotometreli O3 konsantrasyonu gibi oda havasının sıcaklığını ve nemini sürekli olarak 3 saat boyunca her 10 dakikada bir O3 seviyelerini düzenli olarak kaydedin.
    NOT: Filtrelenmiş hava maruziyetleri benzer bir cihazda gerçekleştirilir ve sadece filtrelenmiş bir hava beslemesi maruz kalma odasından akar.
  5. O3/ filtrelenmiş hava maruz kalma 3 saat sonra yatak, gıda ve su reklam libitum ile kendi kafeslerine hayvanları iade edin.

2. Jurkat T hücre hattının hazırlanması (Gün 2)

NOT: Tüm prosedürler sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır.

  1. Kültür Jurkat T hücreleri 24 mL bazal hücre kültürü orta + 10% FBS + 5% penisilin / streptomisin 37 °C + 5% CO2 (Malzeme Tablosu). Jurkat T hücreleri, her 3 günde bir önceden ısıtılmış kültür ortamına 1:6-1:8 geçirerek muhafaza edilebilen bir süspansiyon hücresi hattıdır. Titrin.
  2. Apoptotik hücreleri hazırlamak için, her şişede % 90 birleşme onları büyümek (hangi passaging sonra ulaşmak için 3-4 gün sürer). Bu çalışma için, bu protokolde kullanılan yeterli sayıda hücre elde etmek için beş T75 şişesinden hücreleri kullanın.
    NOT: Bir confluent şişesi yaklaşık 20-24 milyon hücre içerir.
  3. Pipet kadar hücreleri (tüm şişe olan) her şişe (yaklaşık 24 mL) ve steril bir 50 mL konik tüp bir serolojik pipet kullanarak hücreleri aktarın. Birden fazla şişe için birden fazla konik tüpler kullanın.
  4. Hücreleri 50 mL konik tüpten 11 μL'lik bir hücre aliquot'u çıkararak sayın ve 11 μL trippan mavisi leke ve pipet 11 μL ile hemositometre slaytlarına karıştırın.
  5. Otomatik bir hücre sayacına slayt ekleyin ve her şişedeki toplam hücre sayısını hesaplamak için canlı hücre sayısını 24 ile çarparak, her şişe24 mL ortam içerdiğinden kaydedin.
  6. Hücre süspansiyonuna 271 x g'de 5 dakika oda sıcaklığında (RT) pelet hücrelerine santrifüj edin.
  7. Aspirasyon ile supernatant atın ve mL başına 3.0 x 106 hücre elde etmek için ortamda hücre pelet resuspend.
  8. Aliquot 100 mm x 20 mm doku kültürü yemeklerinde 5 mL hücre (yaklaşık dokuz tabak kullanılacaktır; her yemekteki toplam hücre miktarı ~15 x 106olmalıdır).
  9. Kontrol için/açığa çıkmak için bir tabak kullanın ve kalan yemekler UV'ye maruz kalacaktır.
  10. UV crosslinker'ı doğru enerji seviyesine ayarlayın, enerji düğmesine basın ve makinenin 600 μJ/cm2 x 100 olarak okuyacağı sayı pedini kullanarak "600" girin.
    NOT: UV çapraz bağlantı ünitesi μJ/cm2 x 100; bu nedenle, ulaşmak için 60 milijoules /cm2,UV crosslinker maç birimleri dönüştürmek.
  11. UV crosslinker kullanarak 60 milijoules (mJ)/cm2'de kontrol dahil olmak üzere tüm tabakları hücrelerle ışınla. UV ışığı plastik kapak nüfuz olmaz gibi, UV maruz kalma sırasında doku kültürü yemekleriüst kapağı çıkarın.
  12. Bir hücre kültürü kuluçka makinesindeki tüm tabakları, maruz kalmamış kontrol de dahil olmak üzere, 37 °C'de %5 CO2'de 4 saat kuluçkaya yatırın.
  13. Ek V ve propidium iyodür (PI) içeren bir apoptoz ispat algılama kiti kullanarak akış sitometri sitometri sitometri sitometri ile apoptoz onaylayın (apoptoz ve nekroz için belirteçler, sırasıyla) inkübasyon 4 saatsonra, üreticinin talimatları na göre26, 27. yıl.
    NOT: Jurkat T hücrelerinin UV çapraz linköründe 600 μJ/cm2enerji seviyesinde ışınlanması, 4 saat lik bir kuluçka dan sonra apoptotik (hem erken hem de geç) hücrelerin geç apoptotik fenotipten daha erken apoptotik fenotiplere sahip ≥75'ine yol açacaktır. Bu, alveoler makrofajların onları tanımasını ve membranları ödünsüz olduğu için yutmalarını kolaylaştırır, geç apoptotik hücrelerin aksine, bu çalışmada daha yüksek eferositik indeks ve alveoler makrofaj eferositozun daha doğru görüntülenmesi ne kadar önemlidir.
    1. Havuz 333 μL (1 x 106 hücreleri) Jurkat T hücrelerinin çeşitli yemekler (hem "uv" ve "UV maruz") birlikte tazminat analiz tüpleri için kullanmak.
    2. Aliquot 333 μL Jurkat T hücrelerinin lekesiz, annexin V tek leke, PI tek leke, UV kontrolü yok ve 600 μJ/cm2 UV'ye maruz kalan etiketli akış sitometri tüpleri.
    3. Sentrifüj tüpler i188 x g 5 dk RT ve supernatant decant.
    4. Hücreleri 500 μL soğuk, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden sulandırarak yıkayın.
    5. Sentrifüj ve pelet hücreleri 188 x g için 5 dk RT. Santrifüj den sonra supernatant atın.
    6. Hücreler santrifüj ederken 10x bağlayıcı tamponu distile sulandırarak akış tüpü başına 400 μL bağlayıcı tampon hazırlayın.
    7. Üreticinin talimatlarına göre V ve PI kuluçka reaktifini (numune/tüp başına 100 μL) hazırlayın.
    8. Santrifüjden sonra süpernatant'ı dekantlayın ve 400 μL 1x bağlayıcı tampondaki tüm tüpleri nazikçe askıya alın, ardından her numune tüpüne 100 μL ek V kuluçka reaktifi ekleyin. Son olarak, kendi tüplerine 100 μL ek v tek leke ve PI tek leke ekleyin, ancak lekesiz tüpe 1x bağlama tamponunun ötesine hiçbir şey eklemeyin.
    9. RT'de 15 dakika boyunca karanlıkta tüpler inkübasyon.
    10. Tüm hücreleri 188 x g'de 5 dk RT ve decant supernatant'ta santrifüj edin.
    11. Hücreleri 400 μL 1x bağlayıcı tampon da resuspend, sonra akış sitometri ile apoptoz için örnekleri analiz. Boyama doğru temsili sağlamak için tüp başına en az 10.000 olay toplamak.
  14. Yemeklerden gelen tüm ışınlanmış hücreleri 50 mL konik tüp ve pelet hücrelerini 271 x g'de 5 dakika boyunca senteksiyasyonla birleştirin.
  15. 24 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ve pelet hücrelerini oda sıcaklığında 5 dakika için 271 x g'da santrifüj ile aspirasyon ve resuspend hücreleri ile tüpten atın.
  16. IACUC tarafından onaylanan farelerin dosing için kullanılan PBS miktarında aspirasyon ve resuspend hücreleri tarafından tüpten supernatant atın. Kullanılan doz fare başına 5-10 x 106 hücre/50 μL arasındadır; bu nedenle, 10 fare için, 500 μL'de yeniden askıya alınır (her dozdaki hücre sayısı ışınlama için kaç hücrenin kültüre yönelik olduğuna bağlı olarak değişir).
    NOT: Pipet ucunun kenarlarına yapışarak hücre kaybına yol açabilecek sıvıyı hesaba katmak için en az iki ek doz makyaj.

3. Apoptotik hücrelerin murine orofajik instillasyonu (Gün 2)

  1. İşlemi hızlandırmak için fareleri anesteziden önce P200 pipetkullanarak apoptotik hücrelerin dosing inoculum hazırlayın. Kurumsal yönergelere göre, en iyi sonuçları elde etmek için orofarengeal (o.p.) instillasyonu için yaklaşık 5-10 x 106 hücre içeren 50°L'lik bir hacim kullanılmaktadır.
  2. 1 L/dk akış hızında veya kurumsal kurallara göre %2 isofluran ile berrak bir odada fareleri anesthetize edin. Bir seferde bir ila iki fare anestezik; sayı deneycinin konfor seviyesine göre belirlenir. Nefes alma düzenini gözlemleyin ve derin nefeslerin nefesler arasında 2-3 s sayısı ile görülebilen derin nefesleri doğrulayın. Parmak ucuna yanıt eksikliği ile anestezi derinliği ni kontrol edin.
  3. Fareyi yarı recumbent supine pozisyonunda yerleştirin. Maksiller kesici dişler tarafından askıya almak için eğimli akrilik levha levha üzerinde mandal lar arasında bağlı bir cerrahi dize kullanın.
  4. Bir çift künt çıkıntılı olmayan forceps kullanarak, fare dilini hafifçe yakalayın ve çekin. P200 pipetile apoptotik hücreleri ağız boşluğuna aşıla. Dozlama fareler dozu verdikten sonra 1-2 s çatırtı gürültü yapmak başarılı olur.
    NOT: Apoptotik hücre instillasyonundan önce dil veya orofarenkse travma ya da indüklememeye özen.
  5. Eldivenli bir parmakla, dil geri çekilirken fare nefes alana kadar burnu nazikçe kapatın. Ağız boşluğunda sıvı görünmeyene ve fare iki veya daha fazla teneffüs edilene kadar burnun kapağını kapatın.
    NOT: Fareler zorunlu burun solunum uğrama dığından, burnun kapaması farenin apoptotik hücreleri akciğerlere solumasını sağlamaya yardımcı olur.
  6. Fareyi aşı panosundan çıkarın ve anesteziden kurtulması için kafese geri verin. Devir sırasında yatak veya enkaz nares engelleme önlemek için sırtına fare yerleştirin.
  7. Fare anesteziden çıktıktan sonra 90 dakika bekleyin ve alveoler makrofajların tüm fareler anesteziden uyandıktan sonra apoptotik hücre akınının yutulmasını bekleyin. Tipik olarak, anestezi sonrası uyanış 1-2 dakika sürer, hangi instillasyon sonucu / zamanlama etkilememelidir.

4. Bronchoalveolar lavaj sıvı toplama ve işleme (Gün 2)

  1. Fare apoptotik hücrelerle dosing anestezi uyandıktan sonra kurumsal kurallar a90 dk başına her fare ötanazi. Burada öldürücü ketamin ve ksilazin enjeksiyonu (sırasıyla 90 mg/kg ve 10 mg/kg) ve ardından diyafram ın boşaltılabıdır.
    NOT: Bu zaman noktası alveoler makrofajlar için yeterli zaman sağlar anlamda ve apoptotik hücreleri yutmak38.
  2. Tüm fareleri (g) bir ölçekte tartın ve ağırlıkları kaydedin. BAL hacmini (26,25 mL/kg vücut ağırlığı) hesaplamak için vücut ağırlığını kullanın.
  3. Fareleri sırtlarına yerleştirin ve göğüs ve boyun bölgesini sterilize etmek için %70 etanol püskürtün.
  4. Cerrahi makas ile tüm ventral tarafı boyunca göğüs hemen altında 2 "uzunlamasına kesim olun, ve forceps ile sternum tutarken, akciğerlerin göğüs boşluğuna geri düşmesini sağlamak için diyafram nick.
  5. Göğüs kafesinin kenarları boyunca yanal olarak kesin ve akciğerlerin daha fazla yer genişletmesini sağlar, sonra göğüs boşluğunu forceps ile geriye katlayın.
  6. Trakea ortaya çıkarmak için boyun yoluyla vaskülature boyunca 1 " dikey kesilmiş olun.
  7. Trakeadan kas ve doku çekmek ve ortaya çıkarmak için iki forceps kullanın. Vaskülatür, uzunlamasına kaslar ve bağ dokusu ile çevrili olduğundan, ek potansiyel kanama ve nefes borusu kesme kaçının.
  8. Trakeada bir yarık yapmak için bir iğne kullanın (kafadan aşağı mesafenin yaklaşık dörtte biri) ve 1x PBS (26,25 mL/kg vücut ağırlığı, ~0,7-1,0 mL 8-10 haftalık kadın C57Bl/6J fare) caudally trac ile önceden yüklenmiş bir şırınga ile bir kanül (18 G x 1,25") ekleyin hea.
  9. PBS'nin hacmini yavaşça akciğerlere doğru iterek akciğerlerin daha sonra şişmesine izin verin, hacmi şırınganın içine geri çekin. Bu işlemi toplam 3 kez tekrarlayın.
  10. 15 mL'lik bir tüpte her bir fareden birleştirilmiş lavaj sıvısını toplayın.
  11. Bronkoalveolar lavajı 610 x g'de 4 °C'de 6 dakika ayırın ve 1,5 mL'lik bir tüpe supernatant toplayın ve -80 °C'de donun. Pelet bronkoalveolar uzaydan hücreleri temsil eder.
  12. Toplanan BAL sıvısındaki artık kırmızı kan hücrelerini hücre peletine 1 mL ACK RBC lysis tamponu ekleyerek çıkarın, sonra girdap iyi girdap ve 1 dakika buz üzerinde lyse. Daha sonra, lysis reaksiyonu durdurmak için 4 mL PBS ekleyin.
  13. Pelet hücreleri 610 x g 4 °C'de 6 dk santrifüj ile ve bir vakum aspiratör ile supernatant aspire.
  14. Her BAL numune tüpüne 1 mL 1x PBS + %10 FBS'lik hücreler yeniden askıya alın. Her örnekteki toplam hava sahası hücrelerinin sayısallaştırılması için hücreleri hemositometrede sayın (trypan mavisi yok). Orta ivme ve sitosantrifüj kullanarak, 3 dakika için 56 x g slaytlar üzerine her örnek 120 μL santrifüj. Slaytları bir gecede kurutun.

5. Alveoler makrofaj eferositik indeksinin hesaplanması (Gün 3)

  1. Her slayttan en az 200 hücre sayılan hematoksin ve eozin ile hematoksin ve eozin ile lekeler.
  2. Slaytları biyolojik bir mikroskopüzerinde parlak alan ayarı altında görüntüleyin (20x veya 40x hedefi en iyi şekilde çalışacaktır).
  3. Eferositik indeksi, apoptotik Jurkat T hücrelerini apoptotik jurkat T hücrelerini hücre diferansiyel slaytındaki toplam 200 makrofajdan apoptotik hücre alımı olmadan alveoler makrofajlara ayıran alveoler makrofajların sayısına göre hesaplayın. Veri girişi için oranı yüzdeye dönüştürün. Aşağıdaki denklemi kullanın:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

O3 maruz ilikanın pulmoner inflamasyon ve yaralanmaya neden olduğu bilinmektedir ve eferositoz doku homeostazını korumak için gereklidir. C57BL/6J dişi fareler, pulmoner inflamasyon ve yaralanmayı incelemek için filtrelenmiş hava (FA) veya 1 ppm O3'e 3 saat ve nekropsi 24 saat sonra maruz kalma ile maruz kaldı. O3-maruz fareler fa kontrol grubuna göre hava sahasında makrofajlar ve nötrofiller önemli bir artış gösterdi(Şekil 1A,B). Ayrıca, O3-maruz fareler BAL proteininde önemli bir artış vardı, alveoler epitel bariyer disfonksiyonu bir belirteç 24 saat post-pozlama (Şekil 1C).

O 3-indüklenen pulmoner inflamasyonun alveoler makrofaj eferositozdaki defektlerle ilişkili olup olmadığını belirlemek için, C57BL/6J dişi fareler orofarengeal aspirasyon 24 h post-FA veya post-O3 ile apoptotik Jurkat T hücreleri ile aşılandı. maruz kalma. Jurkat T hücrelerindeki apoptoz dozaj dan önce akış sitometrisi ile doğrulandı ve erken (ek V+ PI- ve geç (ek In V+ ve PI+) apoptotik hücrelerde anlamlı bir artış saptandı (Şekil 2A,B). Maruz kalma düzeyi ve kuluçka süresi ~75% apoptotik Jurkat T hücrelerinin tekrarlayan sonuçları ile sonuçlandı. Eferositik makrofaj olarak tanımlanan şeyin büyütülmüş bir görüntüsü Şekil 3A'dagösterilmiştir. Eferositik makrofajlar, normal alveoler makrofajlara (beyaz oklarla gösterilir) göre Jurkat T hücresini (siyah oklarla gösterilir) yutulmuş makrofajlar olarak tanımlanmıştır (Şekil 3B). Alveoler makrofaj eferositoz protokolü kullanılarak değerlendirildiğinde, O3-maruzkalan grubun eferositik indeksinde FA kontrollerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir azalma saptandı(Şekil 3B,C). Bu veriler,O 3-indüklenen pulmoner inflamasyon apoptotik hücrelerin azalmış açıklık ile ilişkili olduğunu göstermektedir, hangi akciğer hasarı ve iltihabı uzatabilir.

Figure 1
Şekil 1: O3 maruziyeti pulmoner inflamasyon ait ve yaralanmaya neden olur. C57BL/6J dişi fareler 3 saat 24 saat maruz ilerler ler için filtrelenmiş havaya (FA) veya 1 ppm O3'e maruz kalmış, fareler pulmoner inflamasyon ve hasarı analiz etmek için nekropsied (grup başına n = 6). (A)Bronkoalveolar lavaj (BAL) hücre diferansiyelleri hesaplandı, daha sonra epitel (epi), eozinofiller (eos), lenfositler (lenf), makrofajlar (M) ve nötrofiller (PMN) her slayttan sayılan en az 200 hücre ile tanımlandı. (B) Hücresel diferansiyellerin temsili bir görüntüsü. (C) BAL sıvısındaki toplam protein. Veriler ± SEM (**p < 0.01) olarak ifade edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Jurkat T hücrelerinde UV kaynaklı apoptoz onayı. Jurkat T hücreleri UV Crosslinker (Model 1800) kullanılarak UV 'ye (60 mJ/cm2)maruz kalmıştır. UV ışınlarına maruz kaldıktan sonra Jurkat T hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 4 saat kuluçkaya yatırıldı. İnkübasyon sonrası Jurkat T hücreleri ek V ve propidium iyodür (PI) ile boyandı ve apoptoz akış sitometrisi ile değerlendirildi. Erken apoptotik, geç apoptotik ve nekrotik hücreler sırasıyla Ek V+/PI-, ek inV+/PI+, ek - /PI+olarak tanımlanır. Temsili akış sitometri sitometri sitometri sitometri saçılma plots (10.000 olaylar kaydedildi) (A) maruz kalmamış Jurkat T hücreleri ve (B) UV-maruz Jurkat T hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: O3 pozlama alveoler makrofaj eferositoz azaltır. C57BL/6J dişi fareler 3 saat 24 saat maruz kalmak için filtrelenmiş havaya (FA) veya 1 ppm O3'e maruz kalmıştır, fareler orofarenk olarak yaklaşık 5 x 106 apoptotik Jurkat T hücreleri ile aşılandı. İnstillasyondan 1.5 saat sonra bronkoalveoler lavaj (BAL) uygulandı ve bal makrofajlarında 200 makrofaj sayıldıktan sonra (grup başına n = 11) ışık mikroskobu ile eferositik indeks hesaplandı. (A) Eferositik makrofajın temsili görüntüsü. (B) FA veya O3 pozlama sonrası alveoler makrofajların (beyaz oklar) ve eferositik makrofajın (siyah oklar) tanımlanması. (C) Fa veya O3 pozlama sonrası eferositik indeksin hesaplanması (***p < 0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Suboptimal Jurkat T hücre apoptosis kullanarak 350 nm buzlu ampuller. Jurkat T hücreleri UV Crosslinker kullanılarak 10 dk ışınlandı ve 37 °C'de %5 CO2 ile 1 saat boyunca inkübe edildi. UV ışınlarına maruz kaldıktan sonra Jurkat T hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile 4 saat kuluçkaya yatırıldı. İnkübasyon sonrası Jurkat T hücreleri ek V ve propidium iyodür (PI) ile boyandı, daha sonra apoptoz akış sitometrisi ile değerlendirildi. Erken apoptotik, geç apoptotik ve nekrotik hücreler sırasıyla Ek V+/PI-, ek v+/PI+ve ek -/PI+olarak tanımlanır. 350 nm ampuller ile UV maruz Jurkat T hücrelerinin Temsili akış sitometri arsalar (10.000 olaylar kaydedildi) gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efferocytosis hangi makrofajlar apoptotik hücreleri ve enkaz temizlemek yanı sıra birden fazla anti-inflamatuar mediatör 9 üretmek bir anti-inflamatuar süreçtir9,10,11,12,16 ,18. Eferositoz birden fazla model nasıl makrofaj inflamasyon çözünürlüğünde kritik bir hücre nasıl içgörü sağlamıştır6,7. Son zamanlarda, kronik akciğer hastalıklarının ilerlemesi eferositoz kusurları ile ilişkili olmuştur8,9,15,16,17. Ancak, O3 gibi hava kirleticilerine maruz kalmanın eferositozda kusurlara yol açıp açmayacağı henüz bilinmemektedir. Bu protokol O3 pozlama sonrası alveoler makrofaj eferositozun değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca ışık mikroskobu kullanarak in vivo eferositoz ölçer ve eksvivo manipülasyonlar veya pahalı floresan boyalar olmadan, akciğer mikroortamda eferositoz ölçümü sağlar. Bu protokol O3 maruziyeti bağlamında gerçekleştirilse de, alveoler makrofaj eferositozun değerlendirilmesinde bu protokol ile birden fazla akciğer iltihabı ve yaralanma modeli kullanılabilir.

Bu yöntemin mevcut yöntemlere göre avantajları, alveoler makrofajları fizyolojik çevre bağlamında analiz edebilme yeteneğidir. Alveoler makrofajların ex vivo analizi apoptotik hücrelerle kaplama ve kuluçka içerir. Kaplama alveoler makrofajlar eferositoz28,29,30değiştirebilirsiniz hem fizyolojik hem de genomik değişiklikler neden olabilir. Ayrıca, akciğerde, alveoler makrofajlar makrofaj fonksiyonu31,32,33etkilediği bilinen yüzey aktif ve akciğer astar sıvısı bileşenleri içeren bir mikroortamda var 34,35. Yöntemimiz, fizyolojik olarak daha uygun olan ex vivo manipülasyonları olmadan akciğerde eferositoz ölçümleri sağlar. Bu protokolün gelecekteki uygulamaları akciğer mikroortamının alveoler makrofaj eferositozisini nasıl değiştirebileceği konusunda daha derinlemesine çalışmalara yol açabilir.

Bu protokolün önemli bir bileşeni alveoler makrofaj eferositozdisi değerlendirilmesi için apoptotik hücrelerin üretimidir. Bu apoptosis değil, nekroz indüklemek için doğru UV maruzkalma düzeyi optimize içerir. Protokolümüz 254 nm dalga boyu emisyon ampulleri ve 60 mJ/cm2pozlama seviyesi ile UV crosslinker kullanır. UV ampul seçenekleri apoptosis üretiminde kritik, nekroz değil. 350 nm UV ampulleri protein membran çapraz bağlama ve sterilizasyon için mükemmel ama apoptosis neden başarısız35,36,37. 350 nm ampulile 60 mJ/cm2'ye maruz kalan Jurkat T hücrelerinin örnek bir nokta çizimi Şekil 4'te geç apoptotik ve nekrotik hücrelerde önemli bir artış ile gösterilmiştir. Ayrıca, protokol uv sonrası 4 saat kuluçka kullanır. Protokolün bu bölümünü optimize etmek için, daha önce çeşitli kuluçka sürelerini incelemiş tikvektiz ve maruz kalma sonrası 1,5 ve 2 saatlik kuluçka süresinin sadece yaklaşık %40 apoptoz, %5'in altında bir eferkositik indeks (veri gösterilmemiştir) olduğunu bulduk. Mevcut literatüre göre , ~70%-80% total apoptotik hücreler eferositoz ölçümü için yeterlidir38.

Bu protokoliçin bir sınırlama fa veya O3 maruz kaldıktan sonra hava sahasında tüm makrofajların eferositik yanıt inceler ve işe makrofajlar doku yerleşik makrofajlar ayırt etmez olmasıdır. Akciğer deresi makrofaj olarak adlandırılan alveoler makrofaj fetal karaciğerden kaynaklanırken, işe alınan makrofajlar kan yoluyla bulaşan embriyonik kökenden kaynaklanır. Yaralanma üzerine, akciğer benzersiz genetik ve hücre yüzey belirteçleri28,29,30,31,32ifade ile son derece heterojen makrofaj nüfus alabilirsiniz, 33,34,35. Bu makrofaj popülasyonlarının immünolojik yanıtı ve işlevinin farklı olduğu bilinmektedir; ancak, son çalışmalar doku yerleşik makrofaj işe makrofajlar29,30,31göre daha büyük bir eferositik yanıt olduğunu göstermiştir. Doku yerleşik makrofajlar ve işe alınan makrofajlar eferositik yanıt belirlenmesi mevcut protokol ile değerlendirilebilir; ancak, makrofaj popülasyonlarının FACS tarafından arındırılması ve analiz için slaytlara kapılması gerekir. Ayrıca, bu protokol sadece inbred, ticari olarak kullanılabilir farelerin bir suş alveoler makrofaj efferositik fonksiyonu değerlendirir. Daha önce farelerin farklı suşları O3 maruz kalma farklı tepkiler göstermek bildirilmiştir, pulmoner inflamasyon da dahil olmak üzere39,40. Bu nedenle incelenen suşa bağlı olarak alveoler makrofaj eferositozda farklılıklar olabilir. Bu in vivo tsay yaparken göz önünde bulundurulması gereken bir değişkendir.

Sonuç olarak, yukarıda açıklanan protokol alveoler makrofaj eferositozin in vivo değerlendirilmesi sağlar. Bu protokol maliyet-etkin ve basit, yaygın olarak kullanılabilir bir test yapma. Ayrıca, bu yöntem çeşitli pulmoner hakaretlerin makrofaj eferositozunu nasıl değiştirebileceğini anlamak için akciğer hasarı ve/veya inflamasyon modellerinde uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgments

Bu çalışma Sağlık Etkileri Enstitüsü Walter A. Rosenblith Ödülü ve NIEHS R01ES028829 (K. M. G için) tarafından finanse edilmektedir. Dr. Dianne Walters'a (Fizyoloji Bölümü, ECU) alveoler makrofajların temsili görüntülerini elde etmedeki yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
  2. Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
  3. Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
  4. Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
  5. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
  6. Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
  7. Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
  8. Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
  9. Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
  10. Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
  11. Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
  12. O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
  13. Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
  14. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  15. Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
  16. Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
  17. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
  18. Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
  19. Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
  20. Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
  21. Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
  22. Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
  23. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  24. Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
  25. Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
  26. Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
  27. Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
  28. Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
  29. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  30. Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
  31. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
  32. Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
  33. Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
  34. Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
  35. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  36. Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
  37. Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
  38. Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
  39. Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
  40. Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 152 hava kirliliği ozon akciğer inflamasyon alveoler makrofaj eferositoz
Ozon Maruziyetinden Sonra Alveoler Makrofaj Eferositozun Vivo Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hodge, M. X., Reece, S. W.,… More

Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter