Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

3D сфероидная модель как более физиологическая система для рака связанных фибробластов дифференциации и вторжения в vitro исследований

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/60122
Automatic Translation
1,2, 1
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

Summary

Целью этого протокола является создание 3D-модели in vitro для изучения дифференциации связанных с раком фибробластов (CAFs) в опухолевой оптоподобной среде, которая может быть решена в различных системах анализа, таких как иммунофлюоресценция, транскрипция анализ и визуализация клеток жизни.

Abstract

Определение идеальной модели для исследования in vitro имеет важное значение, главным образом при изучении физиологических процессов, таких как дифференциация клеток. В опухолевой стромы фибробласты-хозяина стимулируются раковыми клетками, чтобы дифференцироваться. Таким образом, они приобретают фенотип, который способствует микросреде опухоли и поддерживает прогрессирование опухоли. Используя сфероидную модель, мы создали такую 3D-модель in vitro, в которой мы проанализировали роль ламинина-332 и его рецептора и его рецептора в этом процессе дифференциации. Эта система сфероидной модели не только воспроизводит условия микроокружения опухоли более точным способом, но также является очень универсальной моделью, так как она позволяет различные исследования вниз по течению, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание как внутри-, так и внеклеточного маркеры, а также отложенные внеклеточные матричные белки. Кроме того, с помощью этой модели можно изучить транскрипционный анализ qPCR, цитометрию потока и клеточного вторжения. Здесь мы описываем протокол сфероидной модели для оценки роли интегрина ЦАФов No3 З1 и его эктопически отложенного лиганда, ламинина-332, в дифференциации и в поддержке вторжения раковых клеток поджелудочной железы.

Introduction

Микросреда опухоли является очень сложной нишей и чрезвычайно важно для поддержания и прогрессирования опухолевых клеток1. Он образуется не только раковыми клетками, но и стромальными фибробластами. Опухолевые клетки окружены стромы, которая специфична и отличается от стромы нормальных тканей2. Laminin-332 является внеклеточным матричным белком эктопически выражается в строми различных опухолей, таких как аденокарцинома поджелудочной железы3. Кроме того, биохимический состав ECM, а также его биофизические свойства, такиекак жесткость и напряжение, изменения в опухоли объем4 . Эта опухоль строма, или "реактивная строма", вызвана адаптацией фибробластов к соседним раковым клеткам и набором других очень важных игроков, которые разрабатывают благоприятную и благоприятную среду для прогрессирования опухоли. Дифференциация стромальных фибробластов приводит к раку связанных фибробластов (CAF). Эти клетки могут быть идентифицированы с помощью различных маркеров, таких как плавный мышечный актин (ЗСМА)5 или нервный/глиальный антиген 2 (NG2)6.

Наиболее подходящая модель in vitro для повторения микроокружения опухоли (TME) с помощью CAFs трудно выбрать. Для такой модельной системы необходимо рассмотреть метод имитации физиологических параметров ТМЭ экономически эффективным и воспроизводимым способом. В рамках ТМЭ происходят различные процессы, такие как распространение, дифференциация, миграция и вторжение различных типов клеток. Эти клеточные процессы могут выполняться индивидуально с различными методами. Тем не менее, экспериментальные условия должны учитывать клеточные взаимодействия с опухолевой стромы ECM, так как жесткость субстрата влияет на процесс дифференциации CAF. Р.Г. Уэллс прокомментировал влияние матричной жесткости на поведение клеток и подчеркнул, что цитоскелетная организация и дифференциация статуса, наблюдаемые в клетках in vitro, могут быть артемовстовыми7. Различные стимулы, кажется, участвуют в дифференциации CAF, в том числе механическое напряжение5,7. Чтобы избежать этого, 2D мягкие субстраты могут быть возможными подходами для дифференциации исследований, так как они обходят проблему жесткой культуры блюдо пластика. Мягкая 2D поверхность, на которой фибробласты могут быть выращены, может быть коллагена-I покрытием полякриламид гели, в котором гель жесткость может манипулировать концентрацией полиакриламид и гель поперечный-ссылки. Стегея и образование богатых SMA стрессовых волокон усиливаются в фибробластах вместе с гель жесткость8. Эти результаты подчеркивают важность мягких подсашных лесов субстрата для более физиологических моделей дифференциации in vitro. Тем не менее, в наших руках экспериментальной воспроизводимости и визуализации этих гелей были сложными. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы изменили 2D мягкую систему субстрата для 3D сфероидной модели для дифференциации и исследований вторжения. Эта модель является более клинически актуальной и, подобно органоиду in vitro, резюмирует взаимодействия в виво-клеточных клетках, производство и осаждение ECM, а также поведение клеток9.

Сфероиды образуются, когда клетки не хватает субстрата придерживаться. Когда клетки остаются без клейкой поверхности, они объединяются, образуя более или менее сферическую структуру. Если сфероиды состоят из одного типа клеток, они называются гомосфероидами; если состоит из двух или более различных типов клеток они образуют гетеросфероиды.

Среди различных методов подготовки сфероидов, мы выполняем протокол с использованием неадекнтных круглых нижних 96-колодцев. Он очень эффективен в отношении затрат. Здесь мы производим как гомосфероиды фибробластов, CAF или CAFs не хватает integrin No3 подразделение для изучения процесса дифференциации и гетеросфероидов CAFs или integrin No 3 KO CAFs и поджелудочной железы клетки карциномы (AsPC-I и PANC-I) для изучения вторжения в окружающую матрицу.

Целью этих исследований было использование первичных ЦАФов, изолированных от биопсии карциномы поджелудочной железы человека. Тем не менее, биопсии для получения клеток являются скудными, и по этой причине, CAFs, используемых в этих исследованиях были увековечены с использованием лентивирус, содержащий HTERT. Они называются iCAFs, и их нормальные аналоги, первичные человеческие фибробласты поджелудочной железы, называются iNFs. Фибробласты поджелудочной железы человека и клетки карциномы поджелудочной железы, AsPC-I и PANC-I, являются коммерчески доступными.

Этот протокол был использован для изучения влияния взаимодействия ламинина-332-итегрина в процессе дифференциации CAF. Чтобы доказать специфику этого взаимодействия и его функции, ингибиторные соединения были использованы: BM2, моноклональное антитело, которое блокирует место связывания интегрина ламинин-332 No3 цепи10, или lebein 1, змея яд производные соединения, которое блокирует ламинин-связывающие атегрины No3 Х1, No6 и 7 -111,12.

Для анализа вторжения, клетки были трансуминированы с лентивирусом, содержащим cDNA кодирования либо mCherry (iCAFs и integrin No 3 KO iCAFs) или GFP (AsPC-I и PANC-I), чтобы различать различные типы клеток в гетеросфероидах. Трансдукция клеток, чтобы увековечить их и / или пометить их флуоресцентным протением (mCherry и GFP) выражение описано в предыдущем исследовании13, которые следует проконсультироваться для получения дополнительной информации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 3D сфероиды как модель in vitro для дифференциации фибробластов/CAF с использованием различных ингибирующих соединений клеточной матрицы

  1. Смешайте 1 часть 6 мг/мл метилцеллюлозы раствор и 3 части клеточной культуры средств массовой информации, MEM дополнен 1% тепло-инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина для получения раствора образования сфероидов.
  2. Отрептить свежеоттая увековеченные нормальные фибробласты (iNFs), увековеченные CAF (iCAFs) или integrin No3'1 KO iCAF (проход до 25) в растворе образования сфероидов. При подготовке одной пластины 96 скважин, подготовить избыток сфероидов формирования раствора, 10 мл и добавить 75000 клеток, имея в виду, что каждый сфероид состоит из 750 клеток, и что 100 Л распространяются на каждый колодец пластины.
  3. Если цитокины или ингибиторы ингибирования ингибирования включены в исследование, добавить эти соединения в клеточной суспензии, для того, чтобы вставлять их в сфероиды во время их формирования. Обратите внимание, что iNF стимулируются с 10 нг/мл TGF-No1 для того, чтобы вызвать дифференциацию. При необходимости добавьте ингибиторные соединения вместе с TGF-No1, например, 20 мкг/мл BM2 или 10 мкг/мл лебейна 1.
  4. Подготовка CAF гомосфероидов таким же образом, но без tGF-No 1 стимул, так как они уже дифференцированы. Подготовка интегрин No 3 KO CAF homospheroids без добавления какого-либо соединения.
  5. Распределите раствор образования сфероидов на круглую нижнюю 96 многоколодцную пластину, добавив 100 л раствора в каждом колодце. Каждый раз, когда раствор сфероидов распределяется в скважинах, хорошо перемешайте, вставая вверх и вниз, несколько раз.
  6. Поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на 24 ч, чтобы один сфероид, чтобы быть сформированным в каждом колодце.
  7. Соберите сфероиды примерно через 24 ч и используйте их для различных целей вниз по течению: иммунофлуоресцентное окрашивание, в режиме реального времени (RT) q-PCR и цитометрии потока. Для обнаружения экспрессии внутриклеточных антигенов, включая осаждение белков ECM в сфероиде, используйте иммунофлуоресцентное окрашивание. После распада сфероидов в одиночные клетки, количественно мембранно-якорный рецептор по цитометрии потока. Для обнаружения активации генов и транскрипционных изменений используйте RT q-PCR мРНК, изолированный от сфероидных клеток.

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов

  1. Соберите сфероиды примерно через 24 ч в одну 1,5 мл реакционную трубку на экспериментальное состояние или на протеин, который необходимо проанализировать. Например, поместите сфероиды iNF, стимулируемые TGF-No1, в трубку, отличаемую от контрольных ИНН, которые не речатся. Чтобы избежать разрыва сфероидов из-за слишком сильных сил сдвига, вырежьте конец кончика пипетки, чтобы увеличить обита. Включите не менее 5-10 сфероидов в одну реакционную трубку, чтобы позволить репликации и принять во внимание возможные потери во время стирки шагов.
  2. Centrifuge сфероидов со скамейкой верхней центрифуги около 30-60 с на 1000 х г. Тщательно удалите метилцеллюлозы содержащие супернатант путем pipetting, не нарушая гранулы сфероидов.
  3. Вымойте 50 л 1x PBS. Повторите шаг центрифугации и тщательно удалите PBS путем пипетки, как описано в 2.2.
  4. В зависимости от белка, который будет окрашен, исправить с 50 qL 4% параформальдегида в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре (для ЗСМА, NG2 и атегрин No3 '1) или с 50 зл метанола в течение 10 мин при -20 КС (для ламина-332 субъединиц).
  5. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2.2-2.3.
  6. Пермяки клетки с 0,1% Triton-X в PBS в течение 4 мин при комнатной температуре.
  7. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2,2-2,3 три раза.
  8. Инкубировать сфероиды в PBS, содержащий 5% FBS и 2% BSA, для 1 ч на RT, чтобы блокировать неспецифические сайты взаимодействия белка.
  9. Инкубировать сфероиды с 30 qL первичных антител в PBS, 2,5% FBS и 1% BSA при 4 кв.м. Использовались следующие первичные антитела: анти-ЗСМА Cy-3 конъюгированные и анти-NG2 при 5 мкг/мл; BM2 анти-ламинин No3, 6F12 анти-ламин No3 и анти-ламинин No2 20 мкг/мл.
  10. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2,2-2,3 три раза.
  11. Инкубировать сфероиды с 30 зл вторичных антител в PBS, 2,5% FBS и 1% BSA на RT в течение 90 мин. Следующие вторичные антитела, используемые были: Alexa 488 анти-кролик и анти-мышь (5 мкг/мл).
  12. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2,2-2,3 три раза.
  13. Инкубировать клетки с 30 злитроду dAPI окрашивающий раствор в течение 4 мин при комнатной температуре.
  14. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2.2-2.3.
  15. Поместите сфероиды на стеклянную горку, в каплю PBS, используя стеклянный труба Пастер.
  16. Изображение сфероидов флуоресценцией микроскопии в лазерном сканирующем микроскопе с помощью увеличения 10x. Возьмите различные оптические поперечные сфероид на различных оптических плоскостях z-стек (15-20 стек самолетов). Для установления лазерных настроек в микроскопе используйте сфероид, состоящий из клеток, отрицательных для антигена интереса, или сфероида, окрашенного только вторичным антителом. Повторное использование одинаковых параметров для всех образцов, которые будут сравниваться.
  17. Проанализируйте микроскопические изображения с помощью программного обеспечения ImageJ, опубликованного ранее14. Шаги обобщены на дополнительной рисунке 1. В качестве фона определите плотность встроенного сигнала области, свободной от клеток (ROI). Рассчитайте общую скорректированную флуоресценцию клеток (TCCF) по следующим словам:
    Equation 1
  18. Определите общую исправленную флуоресценцию (TCF) сфероидов, поскольку TCCF нормализуется в области сфероидов и количество стеков.
    Equation 2

3. RT q-PCR гомосфероидов

  1. Для выполнения RT-qPCR, собрать по крайней мере 288 сфероидов (соответствующих трем 96-коловидных пластин) в 50 мл реакционную трубку. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 х г и тщательно удалить метилцеллюлозы содержащие супернатант путем pipetting, не нарушая гранулы сфероидов.
  2. Вымойте 1 мл 1x PBS и перенесите сфероиды в реакционную трубку 1,5 мл. Centrifuge сфероидов со скамейкой верхней центрифуги около 30-60 с на 1000 х г. Тщательно удалите PBS путем pipetting, не нарушая гранулированных сфероидов.
  3. Диссоциатив сфероидов с 250 мг/мл коллагеназа B, 50 мкг/мл DNase I, 2% BSA, 1 мМ CaCl2 в PBS при 37 C в течение 30-45 минут, мягко вихревой и пульсирующий с перерывом в течение нескольких секунд каждые 5 минут.
  4. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шаге 3.2.
  5. Изолировать общую РНК из клеток распавшиеся сфероиды с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК, в соответствии с инструкциями производителей.
  6. Обратный транскрибировать изолированные мРНК в кДНК с коммерческим комплектом, в соответствии с инструкциями производителей.
  7. Количественная оценка уровней транскрипции в репликациях в режиме реального времени PCR. Праймеры, используемые были: З-СМА: Fw 5 "-CCGACCGAATGCAGAAG ГА-3", Rev 5 "ACAGAGTTTTGCGCTCCGAA-3"15; Ламинин No 3 цепи: Fw 5 "-GCTCAGCTGTGTTGTGTGTTGTTTGA-3", Rev 5 "-TGTCTGCCTGCGCCAATAGC-3"16; Ламин No3 цепи: Fw 5 "-GGCAGATTAGGGCAGGCGAGGAGA-3" Rev 5 "-CGGACCTGCTGGGAGGAGGAGGT-3"17; Ламинин No 2 цепи: Fw 5 "-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3" Rev 5'-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 " 16; NG2: Fw 5'-CTGCAGGTCTATGTGTGTGTGTCGGTCA-3 "Rev 5"-TTGGCTTGACCCTACTATG-3" инегрин No3 подразделение: Fw 5'-AGGGGTTCAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3'19; ТОП-1: Fw 5"-CCAGACGGAAGCGCGGAAAC-3 "Rev 5"-GTCCAGGCCTATCTGAA-3"20.
  8. Исправьте значения Ct для Ct-значения эндогенного эталонного гена, такого как TOP-1, используя уравнение: 2- ЗСт. КТ (целевая выборка) - «Ct » (справочная выборка) и «Ct» Кт целевого гена или эталонного гена – TOP-I.

4. Анализ цитометрии потока экспрессии интегрина

  1. Для цитометрического анализа потока соберите не менее 288 сфероидов (соответствующих трем 96-колодульным пластинам) в реакционную трубку мощностью 50 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 х г и тщательно удалить метилцеллюлозы содержащего супернатант путем pipetting.
  2. Вымойте 1 мл 1x PBS и перенесите сфероиды в реакционную трубку 1,5 мл. Повторите шаг центрифугации и осторожно удалите PBS путем пипетки.
  3. Разъедините сфероиды, описанные в шаге 3.3.
  4. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шаге 4.2.
  5. Чтобы блокировать неспецифические места связывания и предотвратить привязку соответствующих к обнаружению антител к FC-рецепторам (CD16, CD32 и CD64), инкубировать клетки в 100 ЗЛ PBS, содержащих 2% лошадиной сыворотки (или сыворотки другого вида животных, антителакоторых которых не будут используется в эксперименте) и 0,1% BSA в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия с вращением.
  6. В случае окрашивания внутриклеточных маркеров, исправить / пермяки клетки, как описано под шагом 2.2-2.5.
  7. Инкубировать клетки с первичными антителами в 100 л PBS, содержащих 2% сыворотки лошади и 0,1% BSA в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия с вращением. Разбавить первичные антитела до 10 мкг/мл.
  8. Вымойте со 100 л PBS - 0,1% BSA три раза, с центрифуги шаги в верхней скамейке центрифуги на 1000 х г между ними.
  9. Инкубировать клетки вторичными антителами в 100 л PBS, содержащих 2% сыворотки лошади и 0,1% BSA в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия с вращением. Разбавить вторичные антитела до 10 мкг/мл.
  10. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шаге 4.7.
  11. Проанализируйте 2.0 x 104 окрашенных клетки в цитометре потока. Ворота для одиночных живых клеток через участок точки FSC-SSC и анализируют флуоресценцию закрытых клеток на канале, подходящем для выбранного флюорофора.

5. Вторжение ассси с использованием гетеросфероидов

  1. Подготовьте раствор образования сфероидов для гетеросфероидов, содержащих различные типы клеток и соответствующие среды, как обобщено в таблице 1. Клетки ранее были трансумцированы с лентивирусом, содержащим переносчики для выражения mCherry или GFP.
  2. Заполните 100 л раствора образования сфероидов в каждом колодце пластины и инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 ч, чтобы один сфероид образуется в каждом колодце.
  3. Приготовьте 60 мг/мл коллагена крысиного хвоста I, 30% коммерческой гелифицирующей матрицы и 2,5 мкг/мл ламинина-332 в реакционной трубке 1,5 мл. Быстро распределите 15 л в 3 скважинах камеры ангиогенеза. Вставлять по одному сфероиду в каждый колодец, уже содержащий гель.
  4. При необходимости быстро отрегулируйте расположение сфероида к центру колодца с помощью пипетки под микроскопом.
  5. Повторите шаги 5.2-5.3 для следующих гетеросфероидов и повторите еще раз для гомосфероидов.
  6. Инкубировать гели в инкубаторе на 1 ч, чтобы затвердеть, а затем аккуратно наложить гели с клеточной культуры среды.
  7. Изображение сфероидов флуоресценцией микроскопии в лазерном сканирующем микроскопе. Возьмите различные оптические поперечные сфероид на различных оптических плоскостях z-стека и в разное время точки вторжения (например, 0 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч).
  8. Проанализируйте изображения, подсчитывая количество вторгшихся раковых клеток. Вторжение клетки те, которые покинули сфероид и вошел в инвазивной области. Инвазивная область определяется как область кольца между внешними и внутренними периметрами, приведенными дальней вторгшейся клеткой, и сфероидной границей сфероида в начале экспериментов вторжения, соответственно, как указано на дополнительном рисунке 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты этого экспериментального проекта опубликованы в Martins Cavaco et al.13, который рекомендуется для дальнейшего прочтения выводов, которые были сделаны из этих экспериментов.

Рисунок 1, репрезентативное изображение иммунофлуоресцентного сфероида, показывает иммунофторинирование интегрина No3 субъединицы как увековеченных нормальных фибробластов, так и увековеченных ЦАФов(рисунок 1A),а также иммунофлуоресценции количественное четвея(рисунок 1B) и транскрипционные уровни гена субъединицы интегрина No3 qPCR (рисунок1С). Эта группа результатов показывает, что в цафре, по сравнению с обычным аналогом, интегрин No3 регулируется в цафятах. Это доказало, что интегрин No3 З1 можно считать маркером дифференциации фибробластов поджелудочной железы. Это было также продемонстрировано поток цитометрии исследований13.

Figure 1
Рисунок 1. Выражение субъединицы инегрина No3 по iNF и iCAFs. Интегрин No 3 подразделение upregulated iCAFs, отражая свой потенциал в качестве маркера дифференциации для поджелудочной железы CAFs. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание гомосфероидов нормальных фибробластов поджелудочной железы (iNFS) по сравнению с гомосфероидами iCAF показывает повышенный сигнал о субъединице истегрина No3 в дифференцированных клетках. (B) Сигнал флуоресценции клеток в сфероиде был количественно с изображениями 3D-сфероида, используя программное обеспечение ImageJ. Средства , SEM из трех независимых экспериментов показаны и сопоставлены t-тестом (яп. (C) Клетки, полученные из диссоциированных сфероидов были проанализированы на их транскрипционные уровни субъединицы интегрина No3. Средства - SEM из значения кВТ, как изменения в разовых данных из двух независимых экспериментов показаны и сравниваются t-тестом. Хотя это и не достигает уровня значимости 0,1, транскрипционные уровни интегрина No3-кодирования мРНК выше в iCAFs, чем в iNFs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Гетеросфероиды
Тип клеток (проход до 25) Количество ячеек Средний (1 часть метилцеллюлозы ...)
mCherry-iCAFs - GFP-AsPC-I 400 CAF 400 раковых клеток поджелудочной железы 1,5 части ячейки MEM с 10% FBS и 1% перо /strep - 1,5 части RPMI с 10% FBS и 1% пером/strep
mCherry-No3KO-iCAFs - GFP-AsPC-I
mCherry-iCAFs - GFP-PANC-I 1,5 части ячейки MEM с 10% FBS и 1% перо /strep - 1,5 части DMEM с 10% FBS и 1% пером/strep
mCherry-No3KO-iCAFs - GFP-PANC-I
Гомосфероиды
Тип ячейки (проход до 25) Количество ячеек Средний (1 часть метилцеллюлозы ...)
mCherry-iCAFs 400 ячеек 3 части MEM дополнены 10% FBS и 1% ручкой/strep
mCherry-No3KO-iCAFs
GFP-AsPC-I 3 части RPMI с 10% FBS и 1% пером/strep
GFP-PANC-I 3 части DMEM с 10% FBS и 1% пером/стрептом

Таблица 1. Клеточная композиция гетеро- и гомосфероидов. Количество клеток, необходимых для сборки гетеро- и гомосфероидов, а также соответствующая среда, которая должна быть использована для решения образования сфероидов, обобщаются в следующей таблице.

Дополнительная рисунок 1. Последовательные шаги для количественной оценки иммунофлуоресцентного окрашивания белка, интересующего сфероидов, с использованием ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная рисунок 2. Последовательные шаги для количественной оценки числа вторжений раковых клеток во время исследования вторжения, используя ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разработка соответствующей модели in vitro для изучения дифференциации CAF является сложной задачей. После использования различных подходов, мы пришли к выводу, что 3D сфероидная модель является более практичной, физиологической и клинически актуальной моделью, в которой взаимодействие между клетками карциномы поджелудочной железы с увековеченными CAFs могут быть изучены. Эта модель предотвратила спонтанную дифференциацию фибробластов, из-за artefactual stressors such as stiffness пластмассы клетки пластмассы, по крайней мере в недолгосрочных условиях культуры (до 48 h). Хотя точная жесткость сфероида, используемого в этих исследованиях, не была измерена, Ito et al. оценивали жесткость эндотелиальных клеток пуповины человека и мезенхимальных гетеросфероидов стволовых клеток с помощью роботизированного интегрированного микрофлюидного чипа22. Средний фистрайственность-индекс гетеросфероидов была измерена через 1 и 3 дня после сборки. Размер сфероидов был разным, MSC, казалось, увеличить их агрегации потенциала, что привело к уменьшению размера с течением времени (от 135,5 мкм до 99,8 мкм)21,22. Следовательно, жесткость сфероида также увеличилась с 5,0 х 10-3 до 7,5 х 10-3 Па22. Тем не менее, жесткость сфероидов, состоящих из гетеротипической популяции CAFs и AsPC-I может обладать механическими свойствами и значениями жесткости, отличающимся от значений гомосфероидов, изготовленных из одной популяции фибробластов/CAFs. Это до сих пор неизвестно и может отличаться от того, что было описано Ито и др.22. Жесткость также зависит от количества и перекрестного соединения клеточного производства и осажденного ECM, от различных взаимодействий клеток в сфероиде, от количества клеток в сфероиде или от продолжительности культуры.

Как и любая другая модель, экспериментальный дизайн включает в себя некоторые переменные, которые нуждаются в оптимизации, такие как количество клеток, необходимых для формирования сфероидов, временные точки лечения и микроскопические изображения. Описанный экспериментальный дизайн был оптимизирован с целью иметь сфероидный размер, который будет иметь минимальное влияние на распространение питательных веществ и кислорода, так как существует предел диффузии из-за ограничений массового транспорта9. Например, значительно влияет транспортировка кислорода в сфероиды размером более 150-200 мкм, а также диффузия глюкозы и лактата, в агрегатах больше 300 мкм9,18. Сфероиды диаметром более 400-500 мкм обычно представляют собой концентрически слоистую структуру, состоящую из некротического ядра, окруженного жизнеспособным слоем тихих клеток и внешним ободком размножающихся клеток9,24. Чтобы избежать ограниченного распространения соединений, и устранить проблему недоступного сфероидного ядра, клетки лечились TGF-No1, BM2 и lebein-1 до образования сфероидов, когда клетки индивидуально подвешены в растворе образования сфероидов. Кроме того, чтобы обеспечить доступность кислорода и питательных веществ для большинства клеток сфероида и предотвратить образование некротического ядра, количество клеток на сфероид было сокращено до 750-1000 клеток, которые образуют сфероиды диаметром 140-200 мкм.

Важно тщательно смешивать различные типы клеток в растворе образования сфероидов, поэтому сфероиды состоят примерно из одинакового количества клеток, избегая значительных различий в размерах между сфероидами. Тем не менее, иногда некоторые сфероиды могут быть немного больше, чем другие, и что приведет к более- стеки, приобретенные в микроскоп. Некоторые сфероиды могут также отклоняться от идеально сферической формы, но это также учитывается, когда рентабельность сфероидов очеркирована. Эти различия в размерах и форме учитываются в нормализованных значениях количественной оценки, как это объясняется в следующем пункте. Другим важным фактором, касающимся формы сфероида, является тип клеток. Например, фибробласты и ЦАФы образуют сфероиды с почти сферической формой, в то время как клетки AsPC-I и PANC-I образуют более рассеянный агрегат клеток.

Для визуализации сфероидов, криосекции фиксированных сфероидов также могут быть использованы, однако целостность сфероида может быть скомпрометирована при разделе, в зависимости от типа клетки и иммунодефицита протокола. Кроме того, окрашивание всего сфероида в его 3D-структуре оказалось более простым вариантом. Приобретение микроскопических стеканных изображений сфероида в виде 3D-структуры занимает в среднем 5-15 мин на сфероид.

Иммунофлуоресцентные сигналы на изображениях сфероидов трудно поддаются количественной оценке, поскольку они представляют собой плоскости 3D-структур. Используемый метод был основан на ранее описанном, где авторы экстраполировали и считали сфероид ячейкой14. Таким образом, сигнал флуоресценции корректируется с помощью equation 1.

В качестве фона была определена интегрированная плотность сигнала в зоне, не представляющих интереса для клеток (ROI). Измеренная плотность интегрированного сигнала — это сумма значений интенсивности пикселей в выбранной рентабельности инвестиций. Поскольку сфероиды являются 3D структурами, приобретаются конфокальные изображения из разных стеков. Для обработки таких изображений можно измерить флуоресцентный сигнал в каждом стеке по отдельности или использовать сумму всех стеков в проекцию. Все количественные оценки могут быть выполнены с помощью ImageJ. Общая исправленная флуоресценция (ТФФ) сфероидов определяется как нормализованный TCCF, учитывая площадь сфероидов и количество стеков, используя Уравнение 2. Это объясняет различные размеры сфероидов и расхождение в сферической форме. Анализ иммунофлуоресцентного окрашивания сфероидов с помощью этого метода может занять до 5 мин на сфероид.

Аналогичным образом, вторжение клеток из сфероидов в окружающую стромальную матрицу может быть проанализировано различными алгоритмами. Простой метод был ранее описан Nowicki и др., в котором инвазивные раковые клетки были подсчитаны23. Для того, чтобы дискриминировать инвазивные клетки от тех, которые не вторгаются, важно установить пространственный предел, за которым клетки считаются покинули структуру сфероидов. Таким образом, отправной точкой является предел, который соответствует периметру сфероидных изображений, приобретенных в начальную точку времени (время 0), когда сфероиды были встроены в гель. Клетка, которая вторгается в гель дальше всего считается максимальное расстояние инвазивной клетки может достичь, и, таким образом, он определяет внешний край региона вторжения. Этот метод подсчитывает инвазивные раковые клетки, которые присутствуют в области вторжения, используя инструмент подсчета от ImageJ, и рентабельность инвестиций, соответствующая сфероиду в то время 0 ч добавляется к менеджеру рентабельности инвестиций, а затем транспонируется к изображению того же точного сфероида, приобретенного 48 h или 72 ч позже. По этой причине, важно, чтобы сфероид остается как можно ближе к центру плоскостей, как это возможно, в разное время приобретения. Подсчет количества клеток может занять до 5 мин на сфероид.

Другим важным соображением является различение различных типов клеток в гетеросфероид. Это может быть выполнено с помощью живых клеточных флуоресцентных красителей, которые могут быть проблематичными, когда тип клетки имеет высокую скорость деления клеток или если эксперимент должен быть выполнен в течение длительных периодов времени. Более надежный и надежный способ отличить две разные популяции заключается в разработке клеточных линий, выражающих флуоресцентные белки, такие как mCherry и GFP. Доставка векторов экспрессии может осуществляться с помощью лентивируса, что приводит к стабильному выражению этих белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов. Этот материал отражает только мнения автора, и Европейский союз не несет ответственности за любое использование информации, содержащейся в нем.

Acknowledgments

Мы признаем помощь Барбары Шеддинг в подготовке BM2 и lebein-1. Мы признательны Огнес Ноэль за то, что она поделилась своим опытом в сфероидных анализах. Мы благодарим Соню Шелхаас и Михаэля Шефера за помощь в обработке трансфекции лентивирвейра в условиях S2. Мы признаем помощь Сабины фон Рорден в подготовке ЦАФов из ткани рака поджелудочной железы.

Исследования, приведившие к этим результатам, получили финансирование от Программы «Люди» (Marie Curie Actions) Седьмой рамочной программы Европейского союза FP7/2017-2013/ в соответствии с соглашением о предоставлении грантов REA (316610) J.A.E. Кроме того, J.A.E. и A.C.M.C. оказывали финансовую поддержку Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках кластера передового опыта «Клетки в движении» (EXC 1003-CiM). Этот проект также был поддержан Вильгельмом Сандером Стифтунгом (грант: 2016.113.1 до J.A.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) SIGMA-ALDRICH D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
Acetone SIGMA-ALDRICH 32201
Albumin Fraction V - BSA AppliChem A1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse Invitrogen A11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit Invitrogen A11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) Santa Cruz sc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 Millipore AB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) SIGMA-ALDRICH C6198
AsPC-1 cell line ATCC Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifuge Fisher Scientific 50-589-620 Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2) Fluka 21074
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mL Corning 430290
Collagenase B Roche 11088831001
Collagen-I, rat tail Gibco A10483-01
Confocal microscope Zeiss LSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L) Lonza BE12-604F
Dnase I Roche 10104159001
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCaliburTM
Gelifying matrix ThermoFisher Scientific A1413202 Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotype DAKO X 0907
Horse Serum SIGMA-ALDRICH 12449-C
Human Primary Pancreatic Fibroblasts PELOBiotech PB-H-6201
Incubator Heraeus B6060
Laminin-332 Biolamina LN332
MEM SIGMA-ALDRICH M4655
Microplate, 96 wells, U-bottom Greiner Bio-One 650101
Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Mouse IgG, isotype SIGMA-ALDRICH I8765
Multi axle rotating mixer CAT RM5 80V
PANC-I ATCC Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
Paraformaldehyde Riedel-de Haën 16005
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
QuantiTect Reverse Transcription Kit Qiagen 205310
Rat IgG, isotype Invitrogen 10700
Reaction tubes, 1.5 mL Greiner Bio-One 616201
Real-time PCR cycler Qiagen Rotor-Gene Q
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074
RPMI Lonza BE12-702F Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100 SIGMA-ALDRICH X100RS
Vórtex Scientific Industries Vortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoated Ibidi 81501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

Tags

Исследования рака выпуск 150 сфероиды CAF 3D-модель дифференциация иммунофлуоресцентное окрашивание qPCR цитометрия потока вторжение внеклеточный матричного геля
3D сфероидная модель как более физиологическая система для рака связанных фибробластов дифференциации и вторжения в vitro исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D… More

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (150), e60122, doi:10.3791/60122 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter