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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/60122
Automatic Translation
1,2, 1
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.

Abstract

Die Definition des idealen Modells für eine In-vitro-Studie ist vor allem bei der Untersuchung physiologischer Prozesse wie der Zelldifferenzierung von entscheidender Bedeutung. Im Tumor stroma werden Wirtsfibroblasten von Krebszellen zur Differenzierung angeregt. So erwerben sie einen Phänotyp, der zur Tumormikroumgebung beiträgt und die Tumorprogression unterstützt. Mit Hilfe des Sphäroidmodells haben wir ein solches 3D-In-vitro-Modellsystem eingerichtet, in dem wir die Rolle von Laminin-332 und dessen Rezeptorintegrin 3-1 in diesem Differenzierungsprozess analysiert haben. Dieses Sphäroid-Modellsystem reproduziert nicht nur die Tumor-Mikroumgebungsbedingungen genauer, sondern ist auch ein sehr vielseitiges Modell, da es verschiedene nachgelagerte Studien ermöglicht, wie z. B. immunfluoreszierende Färbung ender intra- und extrazellulärer Marker sowie abgelagerte extrazelluläre Matrixproteine. Darüber hinaus können Transkriptionsanalysen durch qPCR, Durchflusszytometrie und zelluläre Invasion mit diesem Modell untersucht werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll eines Sphäroidmodells zur Bewertung der Rolle des INtegrins von CAFs und seines ektopisch abgelagerten Ligands Laminin-332 bei der Differenzierung und bei der Unterstützung der Invasion von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen.

Introduction

Die Tumormikroumgebung ist eine sehr komplexe Nische und extrem wichtig für die Erhaltung und Progression der Tumorzellen1. Es wird nicht nur von den Krebszellen, sondern auch von stromalen Fibroblasten gebildet. Die Tumorzellen sind von einem Stroma umgeben, der spezifisch ist und sich von den Stroma normaler Gewebe2unterscheidet. Laminin-332 ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das ektopisch im Stroma verschiedener Tumoren, wie z.B. des Pankreas-Adenokarzinoms3, exprimiert wird. Darüber hinaus verändern sich die biochemische Zusammensetzung des ECM und seine biophysikalischen Eigenschaften, wie Steifigkeit und Spannung, innerhalb der Tumormasse4. Dieser Tumor stroma, oder "reaktive se", wird durch eine Anpassung von Fibroblasten an die benachbarten Krebszellen und durch die Rekrutierung anderer sehr wichtiger Akteure verursacht, die ein günstiges und unterstützendes Umfeld für die Tumorprogression entwickeln. Die Differenzierung von stromalen Fibroblasten führt zu krebsassoziierten Fibroblasten (CAF). Diese Zellen können mit verschiedenen Markern identifiziert werden, wie z.B. mit dem glatten Muskelaktin (SMA)5 oder dem neuronalen/glialen Antigen 2 (NG2)6.

Das am besten geeignete In-vitro-Modell, um die Tumormikroumgebung (TME) mit CAFs zu rekapitulieren, ist schwer zu wählen. Die Methode, physiologische Parameter der TME kosteneffizient und reproduzierbar nachzuahmen, muss für ein solches Modellsystem in Betracht gezogen werden. Innerhalb der TME treten verschiedene Prozesse wie Proliferation, Differenzierung, Migration und Invasion der verschiedenen Zelltypen auf. Diese zellulären Prozesse können individuell mit unterschiedlichen Methoden durchgeführt werden. Die experimentellen Bedingungen müssen jedoch die zellulären Wechselwirkungen mit dem Tumor stroma ECM berücksichtigen, da die Steifigkeit des Substrats den CAF-Differenzierungsprozess beeinflusst. R.G. Wells kommentierte die Auswirkungen der Matrixsteifigkeit auf das Zellverhalten und betonte, dass die zytoskelettale Organisation und der Differenzierungsstatus, die in in vitro kultivierten Zellen beobachtet wurden, artefactual sein könnten7. Verschiedene Reize scheinen an der CAF-Differenzierung beteiligt zu sein, einschließlich mechanischer Spannung5,7. Um dies zu vermeiden, könnten 2D-weiche Substrate mögliche Ansätze für Differenzierungsstudien sein, da sie das Problem der steifen Kulturschale Kunststoff umgehen. Eine weiche 2D-Oberfläche, auf der Fibroblasten angebaut werden können, können kollagen-I-beschichtete Polyacrylamidgele sein, wobei die Gelsteifigkeit durch die Konzentration von Polyacrylamid und dem Gel-Verlinker manipuliert werden kann. Die Haftung und Bildung von SMA-reichen Spannungsfasern wird in Fibroblasten zusammen mit der Gelsteifigkeit8verstärkt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung weicher Substratgerüste für physiologischere In-vitro-Differenzierungsmodelle. In unseren Händen waren jedoch die experimentelle Reproduzierbarkeit und Bildgebung dieser Gele eine Herausforderung. Um diese Mängel zu überwinden, haben wir das 2D-Softsubstratsystem für ein 3D-Sphäroidmodell für Differenzierungs- und Invasionsstudien geändert. Dieses Modell ist klinisch relevanter und rekapituliert, ähnlich wie ein In-vitro-Organoid, in vivo Zell-Zell-Wechselwirkungen, ECM-Produktion und -Deposition sowie Zellverhalten9.

Sphäroide entstehen, wenn zellenein Substrat fehlt, an dem sie haften können. Wenn die Zellen ohne Klebefläche verlassen werden, aggregieren sie sich zu einer mehr oder weniger kugelförmigen Struktur. Wenn die Sphäroide aus einem Zelltyp bestehen, werden sie Homosphäroide genannt; wenn sie aus zwei oder mehr verschiedenen Zelltypen bestehen, bilden sie Heterosphäride.

Unter den verschiedenen Methoden für die Sphäroid-Vorbereitung führen wir das Protokoll mit nicht haftenden runden 96-Well-Platten durch. Es ist sehr effektiv in Bezug auf die Kosten. Hier produzieren wir sowohl Homosphäoide von Fibroblasten, CAF oder CAFs ohne die Untereinheit integrin 3, um den Differenzierungsprozess und die Heterosphäroide von CAFs oder Integrin-KO-CAFs und Pankreaskanalkarzinomzellen (AsPC-I und PANC-I) zu untersuchen, um die Invasion zu untersuchen. in die umgebende Matrix.

Ziel dieser Studien war die Verwendung primärer CAFs, die aus biopsien humanen Pankreaskarzinomen isoliert wurden. Die Biopsien zur Gewinnung der Zellen sind jedoch knapp, und aus diesem Grund wurden die in diesen Studien verwendeten CAFs mit dem Lentivirus, das HTERT enthält, verewigt. Sie werden iCAFs genannt, und ihre normalen Gegenstücke, primäre menschliche Pankreas-Fibroblasten, werden als iNFs bezeichnet. Die menschlichen Pankreas-Fibroblasten und die Pankreaskanal-Karzinomzellen AsPC-I und PANC-I sind im Handel erhältlich.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Laminin-332-Integrin-Wechselwirkung im CAF-Differenzierungsprozess zu untersuchen. Um die Spezifität dieser Wechselwirkung und ihrer Funktion zu beweisen, wurden Inhibitorverbindungen verwendet: BM2, ein monoklonaler Antikörper, der die Integrin-Bindungsstelle die Laminin-332-Kette10oder Lebein 1 blockiert, eine von Schlangengift abgeleitete Verbindung, die die Laminin-Bindungs-Integrine , 3, 1, 11,12, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

Für den Invasionstest wurden Zellen mit Lentivirus transduziert, die cDNA-Codierung entweder mCherry (iCAFs und Integrin 3 KO iCAFs) oder GFP (AsPC-I und PANC-I) enthielten, um die verschiedenen Zelltypen in den Heterosphäroiden zu unterscheiden. Die Transduktion der Zellen, um sie zu verewigen und/oder sie mit fluoreszierender Proteinexpression (mCherry und GFP) zu kennzeichnen, wird in einer früheren Studie13beschrieben, die für weitere Informationen konsultiert werden sollte.

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Protocol

1. 3D-Sphäroide als In-vitro-Modell zur Fibroblasten-/CAF-Differenzierung unter Verwendung verschiedener TGF-1-Hemmverbindungen der Zell-Matrix-Wechselwirkung

  1. Mischen Sie 1 Teil von 6 mg/ml Methylcelluloselösung und 3 Teile der Zellkulturmedien, MEM ergänzt mit 1% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin, um die Sphäroidbildungslösung zu erhalten.
  2. Resuspend frisch aufgetaut verewigte normale Fibroblasten (iNFs), verewigte CAF (iCAFs) oder Integrin 3-1 KO iCAF (Durchgang bis zu 25) in der Sphäroid-Formationslösung. Wenn Sie eine 96-Well-Platte vorbereiten, bereiten Sie einen Überschuss an Sphäroid-Bildungslösung, 10 ml und fügen Sie 75.000 Zellen, wobei zu berücksichtigen, dass jedes Sphäroid aus 750 Zellen besteht, und dass 100 l pro Bohrkörper der Platte verteilt sind.
  3. Wenn Zytokine oder Integrin-Inhibitoren in der Studie enthalten sind, fügen Sie diese Verbindungen der Zellsuspension hinzu, um sie während ihrer Bildung in die Sphäroide einzubetten. Beachten Sie, dass iNFs mit 10 ng/mL TGF-Nr. 1 stimuliert werden, um eine Differenzierung auszulösen. Fügen Sie gegebenenfalls Inhibitorverbindungen zusammen mit TGF-1 hinzu, wie z. B. 20 g/ml BM2 oder 10 g/ml Lebein 1.
  4. Bereiten Sie CAF-Homosphäride auf die gleiche Weise vor, jedoch ohne den TGF-1-Stimulus, da sie bereits differenziert sind. Bereiten Sie die Integrin-Homosphäroide von KO CAF 3 vor, ohne dass eine Verbindung zukommt.
  5. Verteilen Sie die Sphäroid-Formationslösung auf eine runde 96-Platte mit mehreren Bohrscheiben, indem Sie in jedem Bohrwert 100 l der Lösung hinzufügen. Jedes Mal, wenn die Sphäroid-Lösung in den Brunnen verteilt wird, gut mischen, indem Sie auf und ab, mehrmals.
  6. Legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator für 24 h, damit ein Sphäroid in jedem Brunnen gebildet werden kann.
  7. Sammeln Sie die Sphäroide nach ca. 24 h und verwenden Sie sie für verschiedene nachgeschaltete Zwecke: immunfluoreszierende Färbung, Echtzeit (RT) q-PCR und Durchflusszytometrie. Um die Expression von intra- und extrazellulären Antigenen, einschließlich der Ablagerung von ECM-Proteinen im Sphäroid, zu detektieren, verwenden Sie immunfluoreszierende Färbung. Nach dem Zerfall von Sphäroiden in einzelne Zellen, quantifizieren Membran-verankerten Rezeptor durch Durchflusszytometrie. Um Genaktivierung und Transkriptionsänderungen zu erkennen, verwenden Sie RT q-PCR von mRNA isoliert aus den Sphäroidzellen.

2. Immunfluoreszierende Färbung von Sphäroiden

  1. Sammeln Sie die Sphäroide nach ca. 24 h in einem 1,5 ml Reaktionsröhrchen pro Versuchszustand oder pro zu analysierendem Protein. Platzieren Sie z. B. die Sphäroide von iNFs, die mit TGF-1 stimuliert wurden, in ein Rohr, das sich von den Kontroll-iNFs unterscheidet, die nicht behandelt wurden. Um einen Bruch der Sphäroide durch zu starke Scherkräfte zu vermeiden, schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze, um die Öffnung zu vergrößern. Fügen Sie mindestens 5-10 Sphäroide in ein Reaktionsrohr ein, um Replikationen zu ermöglichen und die möglichen Verluste während der Waschschritte zu berücksichtigen.
  2. Zentrifugieren Sie die Sphäroide mit einer Tischzentrifuge für ca. 30-60 s bei 1.000 x g. Entfernen Sie den Methylcellulose-haltigen Überstand vorsichtig durch Pipettieren, ohne die pelletierten Sphäroide zu stören.
  3. Waschen Sie mit 50 l von 1x PBS. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Pipettieren, wie in 2.2 beschrieben.
  4. Je nach zu färbendem Protein mit 50 l 4% Paraformaldehyd in PBS 20 Minuten bei Raumtemperatur (für SMA, NG2 und Integrin 3,1) oder mit 50 l Methanol für 10 min bei -20 °C (für Laminin-332-Untereinheiten) fixieren.
  5. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 erläutert.
  6. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% Triton-X in PBS für 4 min bei Raumtemperatur.
  7. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 dreimal erläutert.
  8. Inkubieren Sie die Sphäroide in PBS, die 5% FBS und 2% BSA enthalten, für 1 h bei RT, um unspezifische Protein-Interaktionsstellen zu blockieren.
  9. Inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 L Primärantikörpern in PBS, 2,5% FBS und 1% BSA bei 4 °C über Nacht. Es wurden folgende primäre Antikörper verwendet: Anti-SMA Cy-3 konjugiert und Anti-NG2 bei 5 g/ml; BM2 Anti-Laminin 3, 6F12 Anti-Laminin 3 und Anti-Laminin-Nr. 2 20 g/ml.
  10. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 dreimal erläutert.
  11. Inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 l sekundären Antikörpern in PBS, 2,5% FBS und 1% BSA bei RT für 90 min. Die folgenden sekundären Antikörper wurden verwendet: Alexa 488 Anti-Kaninchen und Anti-Maus (5 g/ml).
  12. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 dreimal erläutert.
  13. Inkubieren Sie die Zellen mit 30 l DAPI-Färbelösung für 4 min bei Raumtemperatur.
  14. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 erläutert.
  15. Legen Sie die Sphäroide auf eine Glasrutsche, in einem Tropfen PBS, mit einer Glas Pasteur Pipette.
  16. Stellen Sie die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie in einem Laserscanmikroskop mit einer Vergrößerung von 10x ab. Nehmen Sie den unterschiedlichen optischen Querschnitt des Sphäroids auf verschiedenen optischen Ebenen eines Z-Stacks (15-20 Stapelebenen). Um die Lasereinstellungen im Mikroskop festzulegen, verwenden Sie ein Sphäroid, das aus Zellen besteht, die negativ für das Antigen von Interesse sind, oder ein Sphäroid, das nur mit dem sekundären Antikörper gefärbt ist. Verwenden Sie dieselben Einstellungen für alle Zusnmuster wieder, die verglichen werden.
  17. Analysieren Sie die mikroskopischen Bilder mit ImageJ Software, wie zuvor veröffentlicht14. Die Schritte sind in Ergänzender Abbildung 1zusammengefasst. Bestimmen Sie als Hintergrund die integrierte Signaldichte einer zellfreien Interessenregion (ROI). Berechnen Sie die gesamte korrigierte Zellfluoreszenz (TCCF) wie:
    Equation 1
  18. Bestimmen Sie die gesamte korrigierte Fluoreszenz (TCF) der Sphäroide, da sich der TCCF auf den Sphäroidbereich und die Anzahl der Stapel normalisiert.
    Equation 2

3. RT q-PCR von Homosphäroiden

  1. Um RT-qPCR durchzuführen, sammeln Sie mindestens 288 Sphäroide (entsprechend drei 96-Well-Platten) in ein 50 ml Reaktionsrohr. Zentrifugieren Sie 5 min bei 1.000 x g und entfernen Sie den methylcellulosehaltigen Überstand sorgfältig durch Pipettieren, ohne die pelletierten Sphäroide zu stören.
  2. Mit 1 ml 1x PBS waschen und die Sphäroide in ein 1,5 ml Reaktionsrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Sphäroide mit einer Tischzentrifuge für ca. 30-60 s bei 1.000 x g. Entfernen Sie die PBS vorsichtig durch Pipettieren, ohne die pelletierten Sphäroide zu stören.
  3. Dissoziieren Sie die Sphäroide mit 250 l von 4 mg/ml Kollagenase B, 50 g/ml DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2 in PBS bei 37 °C für ca. 30-45 min, indem sie alle 5 Minuten sanft alle 5 Minuten sanft wirbeln und pulsieren.
  4. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in Schritt 3.2 erläutert.
  5. Isolieren Sie die gesamte RNA aus den Zellen zerfallener Sphäroide mit einem kommerziellen RNA-Isolationskit, gemäß den Anweisungen der Hersteller.
  6. Transkribieren Sie die isolierte mRNA mit einem kommerziellen Kit nach Herstelleranweisungen in cDNA.
  7. Quantifizieren Sie die Transkriptionsebenen in Replikationen durch Echtzeit-PCR. Die verwendeten Primer waren: '-SMA: Fw 5'-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3', Rev 5' ACAGAGTATGCGCTCCGAA-3'15; Laminin 3 Kette: Fw 5-GCTCCTGTTTGTGGTTGA-3, Rev 5-TGTCTGCCTCTGCCAATAGC-3"16; Laminin 3 Kette: Fw 5-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3- Rev 5-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3-17; Laminin -Kette Nr. 2: Fw 5-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3' Rev 5'-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3' 16; NG2: Fw 5-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 Rev 5-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 Untereinheit integrin 3: Fw 5'-AGGGGGGACCTTCAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTTACTAC-3'19; TOP-1: Fw 5-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3" Rev 5-GTCCAGGCGCTCCTCTTGAA-3"20.
  8. Korrigieren Sie die Ct-Werte für den Ct-Wert eines endogenen Referenzgens wie TOP-1 mit der Gleichung: 2- .Ct. Ct = Ct (Zielprobe) – Ct (Referenzprobe) und Ct= Ct des Zielgens oder Referenzgens – TOP-I.

4. Durchflusszytometrieanalyse der Integrinexpression

  1. Für die zytometrische Durchflussanalyse sammeln Sie mindestens 288 Sphäroide (entsprechend drei 96-Well-Platten) in ein 50 ml Reaktionsrohr. Zentrifugieren Sie 5 min bei 1.000 x g und entfernen Sie den methylcellulosehaltigen Überstand vorsichtig durch Pipettieren.
  2. Mit 1 ml 1x PBS waschen und die Sphäroide in ein 1,5 ml Reaktionsrohr übertragen. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Pipettieren.
  3. Dissoziieren Sie die Sphäroide, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
  4. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in Schritt 4.2 erläutert.
  5. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren und die Bindung nachweisrelevanter Antikörper an Fc-Rezeptoren (CD16, CD32 und CD64) zu verhindern, inkubieren Sie die Zellen in 100 l PBS, die 2 % Pferdeserum (oder Serum einer anderen Tierart, deren Antikörper nicht im Experiment) und 0,1% BSA für 20 min bei 4 °C mit Rotation.
  6. Bei der Färbung intrazellulärer Marker, fix/permeabilisieren Sie die Zellen wie unter Schritt 2.2-2.5 beschrieben.
  7. Inkubieren Sie die Zellen mit den primären Antikörpern in 100 l PBS, die 2% Pferdeserum und 0,1% BSA für 30 min bei 4 °C mit Rotation enthalten. Verdünnen Sie den primären Antikörper auf 10 g/ml.
  8. Waschen Sie mit 100 l PBS + 0,1% BSA dreimal, mit Zentrifugationsschritten in der oberen Bankzentrifuge bei 1.000 x g dazwischen.
  9. Inkubieren Sie die Zellen mit den sekundären Antikörpern in 100 l PBS, die 2% Pferdeserum und 0,1% BSA für 30 min bei 4 °C mit Rotation enthalten. Sekundärantikörper auf 10 g/ml verdünnen.
  10. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in Schritt 4.7 erläutert.
  11. Analysieren Sie 2,0 x 104 gebeizte Zellen in einem Durchflusszytometer. Tor für einzelne lebende Zellen über das FSC-SSC-Punktdiagramm und analysieren die Fluoreszenz der Gated-Zellen auf dem Kanal, der für das ausgewählte Fluorophor geeignet ist.

5. Invasionstest mit Heterosphäroiden

  1. Bereiten Sie die Sphäroidbildungslösung für Heterosphäoide vor, die die verschiedenen Zelltypen und die entsprechenden Medien enthalten, wie in Tabelle 1zusammengefasst. Die Zellen waren zuvor mit Lentivirus-haltigen Vektoren für mCherry oder GFP-Expression transduziert worden.
  2. Füllen Sie 100 l der Sphäroid-Bildungslösung in jedem Brunnen der Platte und inkubieren Sie die Platte im Zellkultur-Inkubator für 24 h, damit in jedem Brunnen ein Sphäroid gebildet werden kann.
  3. Bereiten Sie 60 l gelatinöse Smatrixmischung vor, die 2 mg/ml Rattenschwanzkollagen I, 30 % der kommerziellen Gelifiermatrix und 2,5 g/ml Laminin-332 in einem 1,5 ml Reaktionsröhrchen enthält. Verteilen Sie schnell 15 l in 3 Brunnen der Angiogenesekammer. Einbetten Eines Sphäroids in jeden Brunnen, der bereits das Gel enthält.
  4. Bei Bedarf stellen Sie die Position des Sphäroids mit einer Pipette unter dem Mikroskop schnell auf die Mitte des Brunnens ein.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.3 für die nächsten Heterosphäroide und wiederholen Sie die Stolefürstoiden erneut für die Homsroide.
  6. Inkubieren Sie die Gele im Inkubator für 1 h, um zu erstarren und dann die Gele mit Zellkulturmedium sanft zu überlagern.
  7. Bildn die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie in einem Laserscanmikroskop. Nehmen Sie unterschiedliche optische Nutzprofile des Sphäroids auf verschiedenen optischen Ebenen eines Z-Stacks und zu verschiedenen Zeitpunkten der Invasion (z. B. 0 h, 24 h, 48 h und 72 h).
  8. Analysieren Sie die Bilder, indem Sie die Anzahl der eindringenden Krebszellen zählen. Eindringende Zellen sind diejenigen, die das Sphäroid verlassen haben und in den invasiven Bereich eingedrungen sind. Der invasive Bereich ist definiert als der Ringbereich zwischen dem äußeren und inneren Umfang, der durch die am weitesten eingedrungene Zelle und durch die Sphäroidgrenze des Sphäroids zu Beginn der Invasionsexperimente angegeben wird, wie in der ergänzenden Abbildung 2 beschrieben. .

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Representative Results

Die Ergebnisse dieses experimentellen Entwurfs werden in Martins Cavaco et al.13veröffentlicht, was für die weitere Lektüre der Schlussfolgerungen, die aus diesen Experimenten gezogen wurden, empfohlen wird.

Abbildung 1, ein repräsentatives Bild eines immunfluoreszierenden Sphäroids, zeigt die Immunfärbung der Integrin-Untereinheit 3 von sowohl verewigten normalen Fibroblasten als auch verewigten CAFs (Abbildung 1A), sowie der Immunfluoreszenz Quantifizierung (Abbildung 1B) und die Transkriptionsniveaus des Integrin-Untereinheitsgens 3 durch qPCR (Abbildung 1C). Dieses Ergebnisfeld zeigt, dass Integrin Nr. 3 in iCAFs im Vergleich zum normalen Pendant hochreguliert ist. Dies bewies, dass Integrin 3x1 als Marker für die Differenzierung von Pankreas-Fibroblasten angesehen werden kann. Dies wurde auch durch Strömungszytometrie-Studien13gezeigt.

Figure 1
Abbildung 1. Expression der Integrin-Untereinheit 3 durch iNFs und iCAFs. Die Integrin-Untereinheit Nr. 3 wird durch iCAFs hochreguliert, was ihr Potenzial als Differenzierungsmarker für Bauchspeicheldrüsen-CAFs widerspiegelt. (A) Immunfluoreszenzfärbung von Homosphäriden normaler Pankreas-Fibroblasten (iNFS) im Vergleich zu den Homospheroiden von iCAF zeigt ein erhöhtes Signal der Integrin-Untereinheit 3 in den differenzierten Zellen. (B) Das Fluoreszenzsignal der Zellen im Sphäroid wurde mit den Z-Stack-Bildern des 3D-Sphäroids mit der ImageJ-Software quantifiziert. Bedeutet- SEM von drei unabhängigen Experimenten werden gezeigt und durch t-Test verglichen (*, p < 0.1). (C) Die aus den dissoziierten Sphäroiden gewonnenen Zellen wurden auf ihre Transkriptionsniveaus der Integrin-Untereinheit 3 analysiert. Bedeutet- von -SEM-Werten als Faltänderungen aus zwei unabhängigen Experimenten werden gezeigt und mit t-test verglichen. Obwohl die Signifikanz von 0,1 nicht erreicht wird, sind die Transkriptionsniveaus der integrinen mRNA bei iCAFs höher als bei iNFs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Heterosphäride
Zelltyp (Durchgang bis 25) Anzahl der Zellen Mittel (1 Teil Methylcellulose +...)
mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-I 400 CAF + 400 Bauchspeicheldrüsenkrebszellen 1,5 Teile Zelle MEM mit 10% FBS und 1% Pen/Strep + 1,5 Teile rpMI mit 10% FBS und 1% Stift/Strep
mCherry-3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I
mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I 1,5 Teile Zelle MEM mit 10% FBS und 1% Pen/Strep + 1,5 Teile DMEM mit 10% FBS und 1% Stift/Strep
mCherry-3KO-iCAFs + GFP-PANC-I
Homosphäride
Zelltyp (Durchgang bis 25) Anzahl der Zellen Mittel (1 Teil Methylcellulose +...)
mCherry-iCAFs 400 Zellen 3 Teile MEM ergänzt mit 10% FBS und 1% Stift/Strep
mCherry-3KO-iCAFs
GFP-AsPC-I 3 Teile RPMI mit 10% FBS und 1% Stift/Strep
GFP-PANC-I 3 Teile DMEM mit 10% FBS und 1% Stift/Strep

Tabelle 1. Zellzusammensetzung von Hetero- und Homosphäriden. Die Anzahl der Zellen, die zur Montage der Hetero- und Homospheroide erforderlich sind, sowie das entsprechende Medium, das für die Sphäroidbildungslösung verwendet werden soll, sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Ergänzende Abbildung 1. Sequenzielle Schritte zur Quantifizierung der immunfluoreszierenden Färbung eines Proteins von Interesse in Sphäroiden, mit ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2. Sequenzielle Schritte zur Quantifizierung der Anzahl der eindringenden Krebszellen im Invasionstest mit ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Entwicklung eines geeigneten In-vitro-Modells zur Untersuchung der CAF-Differenzierung ist eine schwierige Aufgabe. Nach der Anwendung verschiedener Ansätze kamen wir zu dem Schluss, dass ein 3D-Sphäroidmodell das praktischere, physiologischere und klinisch relevantere Modell ist, bei dem das Zusammenspiel von Pankreaskarzinomzellen mit verewigten CAFs untersucht werden kann. Dieses Modell verhinderte eine spontane Differenzierung von Fibroblasten aufgrund artefakter Stressoren wie Steifigkeit des Zellkulturkunststoffs, zumindest bei kurzfristigen Kulturbedingungen (bis zu 48 h). Obwohl die genaue Steifigkeit des in diesen Studien verwendeten Sphäroids nicht gemessen wurde, bewerteten Ito et al. die Steifigkeit menschlicher Nabelvenenenenen-Endothelzellen und mesenchymaler Stammzellheterosphäroide mit Hilfe eines Roboters, der einen mikrofluidischen Chip22. Der durchschnittliche Steifigkeitsindex der Heterosphäroide wurde 1 und 3 Tage nach der Montage gemessen. Die Größe der Sphäroide war unterschiedlich, die MSC schien ihre Aggregationskapazität zu erhöhen, was im Laufe der Zeit zu einer Abnahme der Größe führte (von 135,5 m auf 99,8 m)21,22. Folglich erhöhte sich auch die Steifigkeit des Sphäroids von 5,0 x 10-3 auf 7,5 x 10-3 Pa22. Die Steifigkeit der Sphäroide, die aus einer heterotypischen Population von CAFs und AsPC-I bestehen, kann jedoch mechanische Eigenschaften und Steifigkeitswerte aufweisen, die sich von den Werten von Homosphäroiden unterscheiden, die aus einer einzigen Population von Fibroblasten/CAFs bestehen. Dies ist noch unbekannt und könnte sich von dem unterscheiden, was von Ito et al22beschrieben wurde. Die Steifigkeit hängt auch von der Menge und Vernetzung des zellproduzierten und abgelagerten ECM, von den verschiedenen Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des Sphäroids, von der Anzahl der Zellen innerhalb des Sphäroids oder von der Dauer der Kultur ab.

Wie jedes andere Modell umfasst das experimentelle Design einige Variablen, die optimiert werden müssen, wie z. B. die Anzahl der Zellen, die zur Bildung der Sphäroide erforderlich sind, die Zeitpunkte der Behandlung und die mikroskopische Bildgebung. Das beschriebene versuchsweise Design wurde mit dem Ziel optimiert, eine Sphäroidgröße zu haben, die minimalen Einfluss auf die Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff haben würde, da es aufgrund von Massentransportbeschränkungen eine Diffusionsgrenze gibt9. Zum Beispiel wird der Sauerstofftransport in Sphäroiden mit einer Größe von mehr als 150-200 m signifikant beeinflusst, sowie die Diffusion von Glukose und Laktat, in Aggregaten größer als 300 'm9,18. Sphäroide mit Durchmessern von mehr als 400-500 m bilden in der Regel eine konzentrisch geschichtete Struktur, die aus einem nekrotischen Kern besteht, der von einer lebensfähigen Schicht aus ruhestillenden Zellen und einem äußeren Rand von sich ausbreitenden Zellen9,24umgeben ist. Um die begrenzte Diffusion von Verbindungen zu vermeiden und das Problem des unzugänglichen Sphäroidkerns zu beseitigen, wurden die Zellen vor der Sphäroidbildung mit TGF-1, BM2 und Lebein-1 behandelt, wenn die Zellen einzeln in der Sphäroid-Formationslösung suspendiert werden. Um die Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen für die meisten Zellen im Sphäroid zu ermöglichen und die Bildung eines nekrotischen Kerns zu verhindern, wurde die Anzahl der Zellen pro Sphäroid auf 750-1000 Zellen reduziert, die Sphäroide mit einem Durchmesser von 140-200 m bilden.

Es ist wichtig, die verschiedenen Zelltypen in der Sphäroid-Bildungslösung gründlich zu mischen, so dass die Sphäroide aus ungefähr der gleichen Anzahl von Zellen bestehen, wodurch signifikante Größenunterschiede zwischen den Sphäroiden vermieden werden. Dennoch können manchmal einige Sphäroide etwas größer sein als die anderen und das führt zu mehr Z-Stacks, die im Mikroskop erworben werden. Einige Sphäroide können auch von der perfekt kugelförmigen Form abweichen, aber dies wird auch berücksichtigt, wenn der ROI des Sphäroids abgegrenzt wird. Diese Größen- und Formunterschiede werden in den normalisierten Quantifizierungswerten berücksichtigt, wie im nächsten Absatz erläutert. Ein weiterer wichtiger Faktor in Bezug auf die Form des Sphäroids ist der Zelltyp. Beispielsweise bilden Fibroblasten und CAFs Sphäroide mit einer fast sphärischen Form, während AsPC-I- und PANC-I-Zellen ein disperseres Aggregat von Zellen bilden.

Für die Abbildung der Sphäroide können auch Kryosections von festen Sphäroiden verwendet werden, jedoch kann die Integrität des Sphäroids beim Schnitt beeinträchtigt werden, abhängig vom Zelltyp und dem Immunstainierungsprotokoll. Alternativ erwies sich die Färbung des gesamten Sphäroids in seiner 3D-Struktur als einfachere Option. Die Erfassung mikroskopisch-z-gestapelter Bilder des Sphäroids als 3D-Struktur dauert durchschnittlich 5-15 min pro Sphäroid.

Die immunfluoreszierenden Signale in Bildern von Sphäroiden sind schwer zu quantifizieren, da sie Ebenen von 3D-Strukturen darstellen. Die verwendete Methode basierte auf einer zuvor beschriebenen Methode, bei der die Autoren das Sphäroid extrapolierten und als Zelle14betrachteten. Auf diese Weise wird das Fluoreszenzsignal mit Gleichung 1korrigiert.

Als Hintergrund wurde die integrierte Signaldichte einer zellfreien Interessenregion (ROI) ermittelt. Die gemessene integrierte Signaldichte ist die Summe der Intensitätswerte der Pixel innerhalb des ausgewählten ROI. Da Sphäroide 3D-Strukturen sind, werden konfokale Bilder aus verschiedenen Stapeln erfasst. Um solche Bilder zu verarbeiten, kann man das fluoreszierende Signal in jedem Stapel einzeln messen oder die Summe aller Stapel in einer Z-Projektion verwenden. Alle Quantifizierungen können mit ImageJ durchgeführt werden. Die gesamte korrigierte Fluoreszenz (TCF) der Sphäroide wird unter Berücksichtigung der Sphäroidfläche und der Anzahl der Stapel unter Verwendung von Gleichung 2als normalisiertes TCCF bestimmt. Dies erklärt die unterschiedlichen Größen von Sphäroiden und die Diskrepanz in der kugelförmigen Form. Die Analyse der immunfluoreszenten Färbung der Sphäroide mit dieser Methode kann bis zu 5 min pro Sphäroid dauern.

In ähnlicher Weise kann die Invasion von Zellen aus Sphäroiden in die umgebende Stromalmatrix mit verschiedenen Algorithmen analysiert werden. Eine einfache Methode wurde zuvor von Nowicki et al. beschrieben, bei der die invasiven Krebszellen23gezählt wurden. Um die invasiven Zellen von denen zu unterscheiden, die nicht eindringen, ist es wichtig, eine räumliche Grenze festzulegen, über die die Zellen als die Sphäroidstruktur verlassen haben. Daher ist der Ausgangspunkt der Grenzwert, der dem Umfang der Sphäroidbilder entspricht, die zum Anfangszeitpunkt (Zeitpunkt 0) aufgenommen wurden, als die Sphäroide in das Gel eingebettet wurden. Die Zelle, die am weitesten in das Gel eindringt, gilt als die maximale Entfernung, die eine invasive Zelle erreichen kann, und definiert somit den äußeren Rand des Invasionsbereichs. Diese Methode zählt die invasiven Krebszellen, die im eindringenden Bereich vorhanden sind, mit dem Zählwerkzeug von ImageJ, und der ROI, der dem Sphäroid zum Zeitpunkt 0 h entspricht, wird dem ROI-Manager hinzugefügt und dann auf das Bild desselben exakten Sphäroids übertragen, das 48 h oder 72 h später. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass das Sphäroid während der verschiedenen Zeiten der Erfassung so nah wie möglich am Zentrum der Flugzeuge bleibt. Das Zählen der Anzahl der Zellen kann bis zu 5 min pro Sphäroid dauern.

Eine weitere wichtige Überlegung ist die Unterscheidung der verschiedenen Zelltypen im Heterosphäroid. Dies kann mit Live-Zell-Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt werden, was problematisch sein kann, wenn der Zelltyp eine hohe Zellteilungsrate hat oder wenn das Experiment über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden soll. Die robustere und zuverlässigere Möglichkeit, die beiden verschiedenen Populationen zu unterscheiden, besteht darin, Zelllinien zu entwickeln, die fluoreszierende Proteine wie mCherry und GFP exezieren. Die Abgabe der Expressionsvektoren kann mit lentivirus durchgeführt werden, was zu einer stabilen Expression dieser Proteine führt.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. Dieses Material spiegelt nur die Ansichten des Autors wider, und die Europäische Union haftet nicht für jegliche Verwendung der darin enthaltenen Informationen.

Acknowledgments

Wir würdigen Barbara Scheddings Hilfe bei der Vorbereitung des BM2 und lebein-1. Wir würdigen, dass er ihre Expertise in Sphäroid-Assays geteilt hat. Wir danken Sonja Schelhaas und Michael Schäfers für ihre Hilfe beim Umgang mit lentiviraler Transfektion unter S2-Bedingungen. Wir würdigen Sabine von Rüdens Unterstützung bei der Vorbereitung von CAFs aus Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe.

Die Zu diesem Ergebnis führten Forschungsarbeiten wurden aus dem People-Programm (Marie-Curie-Maßnahmen) des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union RP7/2007-2013/ im Rahmen der REA-Zuschussvereinbarung n. (316610) an J.A.E. finanziert. Darüber hinaus wurden J.A.E. und A.C.M.C. von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Exzellenzclusters Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM) finanziell unterstützt. Dieses Projekt wurde auch von der Wilhelm Sander Stiftung unterstützt (Zuschuss: 2016.113.1 an J.A.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) SIGMA-ALDRICH D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
Acetone SIGMA-ALDRICH 32201
Albumin Fraction V - BSA AppliChem A1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse Invitrogen A11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit Invitrogen A11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) Santa Cruz sc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 Millipore AB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) SIGMA-ALDRICH C6198
AsPC-1 cell line ATCC Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifuge Fisher Scientific 50-589-620 Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2) Fluka 21074
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mL Corning 430290
Collagenase B Roche 11088831001
Collagen-I, rat tail Gibco A10483-01
Confocal microscope Zeiss LSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L) Lonza BE12-604F
Dnase I Roche 10104159001
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCaliburTM
Gelifying matrix ThermoFisher Scientific A1413202 Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotype DAKO X 0907
Horse Serum SIGMA-ALDRICH 12449-C
Human Primary Pancreatic Fibroblasts PELOBiotech PB-H-6201
Incubator Heraeus B6060
Laminin-332 Biolamina LN332
MEM SIGMA-ALDRICH M4655
Microplate, 96 wells, U-bottom Greiner Bio-One 650101
Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Mouse IgG, isotype SIGMA-ALDRICH I8765
Multi axle rotating mixer CAT RM5 80V
PANC-I ATCC Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
Paraformaldehyde Riedel-de Haën 16005
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
QuantiTect Reverse Transcription Kit Qiagen 205310
Rat IgG, isotype Invitrogen 10700
Reaction tubes, 1.5 mL Greiner Bio-One 616201
Real-time PCR cycler Qiagen Rotor-Gene Q
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074
RPMI Lonza BE12-702F Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100 SIGMA-ALDRICH X100RS
Vórtex Scientific Industries Vortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoated Ibidi 81501

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References

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Krebsforschung Ausgabe 150 Sphäroide CAF 3D-Modell Differenzierung immunfluoreszierende Färbung qPCR Durchflusszytometrie Invasion extrazelluläres Matrixgel
Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien
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Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D… More

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (150), e60122, doi:10.3791/60122 (2019).

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