Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/60122
Automatic Translation
1,2, 1
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל 3D בתחום החוץ כדי ללמוד את הבידול של סרטן הקשורות בגידולים סרטניים (CAFs) בסביבה בצובר כמו גידול, אשר ניתן לטפל במערכות ניתוח שונות, כגון immunofluorescence ההמרה ניתוח והדמיה של תאי החיים.

Abstract

הגדרת המודל האידיאלי למחקר בתחום החוץ היא חיונית, בעיקר אם לומדים תהליכים פיזיולוגיים כגון הבחנה של תאים. ב הגידול משתית, מארח פיברותקיעות מגורה על ידי תאים סרטניים כדי להבדיל. כך, הם רוכשים פנוטיפ שתורם לסביבת הגידול מיקרו ותומך התקדמות הגידול. באמצעות מודל ספרואיד, יש לנו להגדיר כזה 3D במערכת מודל מבחנה, שבו ניתחנו את התפקיד של למינציה-332 ואת הקולטן שלה אינטגרציה α3β1 בתהליך זה בידול. זו מערכת מודל ספרואיד לא רק מתרבה את התנאים מיקרוסביבה הגידול באופן מדויק יותר, אבל גם הוא מודל תכליתי מאוד מאז הוא מאפשר מחקרים שונים במורד הזרם, כגון immunofluorescent כתמים של שני פנים ומסחטות סמנים, כמו גם הופקד מטריקס חלבונים מטריצות. יתר על כן, ניתוח ההמרה על ידי qPCR, הזרימה cy, לנסות הפלישה התאית ניתן ללמוד עם המודל הזה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול של מודל ספרואיד כדי להעריך את התפקיד של CAFs ' אינטגרin α3β1 ו שלה הופקד למריחה, למינציה ב-332, בידול ותמיכה בפלישה של תאים סרטניים בלבלב.

Introduction

מיקרוסביבה הגידול הוא נישה מורכבת מאוד חשוב מאוד עבור תחזוקה והתקדמות של תאים סרטניים1. הוא נוצר לא רק על ידי התאים הסרטניים אלא גם על ידי סטרומה פיברופיצוצים. התאים הסרטניים מוקפים משתית כי הוא ספציפי ושונה מסטרומה של רקמות נורמלי2. למינציה-332 הוא חלבון מטריצות מטריתאי המתבטאת בסטרומה של גידולים שונים, כגון הלבלב אדנוקרצינומה3. יתר על כן, ההרכב הביוכימי של ECM וגם המאפיינים הביופיסיים שלה, כגון קשיחות ומתח, שינוי בתוך הגידול בצובר4. זה הגידול משתית, או "משתית תגובתי", נגרמת על ידי עיבוד של פיברותקיעות לתאים סרטניים השכנה ועל ידי גיוס של שחקנים חשובים מאוד אחרים המפתחים סביבה חיובית ותומכת עבור התקדמות הגידול. הבידול של סטרומה התוצאות התרופות הקשורות לסרטן (בקפה). תאים אלה יכולים להיות מזוהים באמצעות סמנים שונים כגון α-שריר החלקה אקטין (αSMA)5 או עצביים/גליאל אנטיגן 2 (NG2)6.

המתאים ביותר במודל החוץ גופית כדי ללכוד את מיקרואת הסביבה הגידול (tme) עם cafs קשה לבחור. השיטה לחקות את הפרמטרים הפיזיולוגיים של TME בדרך חסכונית וניתנים לקריאה חייב להיחשב עבור מערכת מודל כזו. בתוך TME, תהליכים שונים, כגון התפשטות, בידול, הגירה ופלישה של סוגי תאים שונים מתרחשים. ניתן לבצע תהליכים סלולריים אלה באופן אינדיבידואלי עם שיטות שונות. עם זאת, התנאים הניסיוניים חייבים לשקול את האינטראקציות הסלולריות עם הגידול משתית ECM, מאז הנוקשות של הרובד התחתי משפיע על תהליך הבידול. Rg. וולס הגיב על ההשפעה של נוקשות מטריקס על התנהגות התא מודגש כי ארגון השלד הציטוזה הבחין בתאים מחוץ לגוף מתורבת יכול להיות ארטעובדתית7. גירויים שונים נראים מעורבים בבידול קפה, כולל מתח מכני5,7. כדי למנוע זאת, 2D מצעים רכים יכול להיות גישות אפשריות ללימודי בידול, כפי שהם לעקוף את הבעיה של פלסטיק תבשיל התרבות הנוקשה. משטח דו-ממדי רך, שבו ניתן לגדל את הפיברותקיעות, יכול להיות קולגן-אני מצופה ג'ל פוליאקרילמיד, לפיה קשיות ג'ל יכול להיות מניפולציות על ידי ריכוז של פוליאקריל ו ג'ל חוצה-מקשר. הדבקה והיווצרות של סיבי סטרס αSMA-עשיר משופרים בתוך פיברובפיצוצים יחד עם נוקשות ג'ל8. תוצאות אלו מדגישים את החשיבות של המצע הרך פיגומים על מודלים פיזיולוגיים יותר של בידול מתורבת. עם זאת, בידינו את השגות הניסיוני הדמיה של ג'לים אלה היו מאתגרת. כדי להתגבר על החסרונות האלה, שינינו את מערכת המצע הרכה 2D למודל ספרואיד תלת-ממדי לבידול ולימודי פלישה. מודל זה הוא רלוונטי יותר קלינית, ובדומה לאורגנואיד, הvivo באינטראקציות תא תאים, ייצור ECM והתצהיר, כמו גם התנהגות תא9.

Spheroids נוצרות כאשר התאים חסרים מצע לדבוק. כאשר התאים משמאל ללא משטח דביק, הם מצטברים כדי ליצור מבנה כדורי פחות או יותר. אם הספרואידים מורכבים מסוג אחד של תא, הם נקראים הומורואידים; אם מורכב משני סוגי תאים שונים או יותר הם יוצרים הטרוהרואידים.

בין השיטות השונות של הכנה ספרואיד, אנו מבצעים את הפרוטוקול באמצעות התחתונה בסיבוב התחתון שאינם חסיד 96-טוב צלחות. זה מאוד יעיל ביחס לעלויות. כאן, אנו מייצרים גם הומורואידים של פיברובמות, קפה או קפה חסר אינטגרציה α3 יחידת כדי לבחון את תהליך הבידול ואת הטרולאידים של cafs או אינטגרציה α3 KO cafs ואת צינור קרצינומה של הלבלב תאים (aspc-i ו panc-i) כדי ללמוד את הפלישה לתוך המטריקס שמסביב.

המטרה עבור מחקרים אלה היה להשתמש בבתי קפה הראשי מבודדים קרצינומה של סרטן הלבלב האנושי. עם זאת, ביופסיות כדי להשיג את התאים הם נדירים ולכן, הקפה בשימוש במחקרים אלה כבר הונצח באמצעות וירוס המכיל HTERT. הם נקראים iCAFs, ואת עמיתיהם הרגיל שלהם, הראשון הלבלב פיברופיצוצים, נקראים iNFs. בסרטן הלבלב ובתאי קרצינומה של הלבלב, AsPC-I ו-PANC-I, הם מסחרית זמין.

פרוטוקול זה שימש לחקר ההשפעה של האינטראקציה המילמינציה-332-אינטגרציה בתהליך הבידול. כדי להוכיח ספציפיות של האינטראקציה הזאת ואת תפקידה, תרכובות מעכבי שימשו: BM2, נוגדן חד שבטיים שחוסם את האינטגרציה באתר מחייב-332 α3 שרשרת10, או להיות 1, ארס נחש נגזר תרכובת החוסמת את ה אינטגרציה מα3β1 למינציה, α6β1 ו-α7β111,12.

עבור שיטת הפלישה, תאים התעברו התמרה עם וירוס המכיל cDNA קידוד או mCherry (iCAFs ואינטגרציה α3 KO iCAFs) או GFP (AsPC-I ו-PANC-I) כדי להבדיל בין סוגי תאים שונים בהטרומאידים. התמרה של התאים להנציח אותם ו/או לתייג אותם עם חלבון פלורסנט (mCherry ו-GFP) ביטוי מתואר במחקר הקודם13, כי יש להתייעץ לקבלת מידע נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הספרואידים 3D כמו מודל מבחנה עבור פיברוהפיצוץ/קפה בידול באמצעות TGF-β1 שונים תרכובות מעכבות של אינטראקציה תא מטריקס

  1. מערבבים 1 חלק של 6 mg/mL מתילתאית פתרון ו 3 חלקים של מדיה תרבות התא, הגברת בתוספת 1% של סרום העוברי חום בלתי מופעל (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין כדי לקבל את פתרון היווצרות ספרואיד.
  2. השעיה מחדש טריים המופשרו רגיל פיברוהפיצוצים (iNFs), הונצח קפה (iCAFs) או אינטגרציה α3β1 KO iCAF (מעבר עד 25) בפתרון היווצרות ספרואיד. אם הכנת 1 96 צלחת טוב, להכין עודף של פתרון היווצרות ספרואיד, 10 מ ל ולהוסיף 75,000 תאים, שמירה על זכור כי כל ספרואיד מורכב על ידי 750 תאים, וזה 100 μL מופצים לכל הבאר של הצלחת.
  3. אם ציטוקינים או מעכבי אינטגרציה כלולים במחקר, להוסיף תרכובות אלה להשעיה התא, כדי להטביע אותם לתוך spheroids במהלך הקמתה. שים לב כי iNFs מגורה עם 10 ng/mL של TGF-β1 על מנת לעורר בידול. במידת הצורך, להוסיף תרכובות מעכבי יחד TGF-β1, כגון 20 μg/mL BM2 או 10 μg/mL של להיות 1.
  4. להכין הומורואידים של קפה באותו אופן אך ללא הגירוי TGF-β1, מאז הם כבר הבדיל. הכינו את האינטגרציה הבין-α3 KO בבית קפה, ללא תוספת של כל תרכובת.
  5. הפץ את פתרון היווצרות ספרואיד על התחתון עגול 96 צלחת רב-היטב על-ידי הוספת 100 μL של הפתרון בכל טוב. בכל פעם הפתרון הספרואיד מופץ בבארות, מערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה, מספר פעמים.
  6. מניחים את הצלחת בחממה לתרבות התא עבור 24 שעות כדי לאפשר לאחד ספרואיד להיווצר בכל באר.
  7. לאסוף את הספרואידים לאחר כ 24 h ולהשתמש בהם עבור מטרות המטה שונים: immunofluorescent כתמים בזמן אמת (RT) q-PCR וזרימה cy, לנסות. כדי לזהות ביטוי של אנטיגנים פנים ומסחטות, כולל הפקדת חלבונים של ECM בתוך הספרואיד, השתמש בהכתמים מאימונוoforaaaaat. לאחר התפוררות של spheroids לתוך תאים בודדים, מכמת ממברנה מעוגן קולטן על ידי cy, הזרמת הציטונסה. כדי לזהות הפעלת גנים ושינויים בהמרה, השתמש ב-RT q-PCR של mRNA מבודדים מתאי ספרואיד.

2. מכתים כתמים של מוטרואידים

  1. לאסוף את הספרואידים לאחר כ 24 שעות לתוך אחד 1.5 mL התגובה צינור לכל מצב ניסיוני או חלבון להיות מנותח. לדוגמה, מניחים את הספרואידים של iNFs מגורה עם TGF-β1 בצינור שונה את ה-iNFs הבקרה, אשר לא טופלו. כדי למנוע קרע של הספרואידים עקב כוחות הטיה חזקים מדי, לחתוך את קצה הצינורות כדי להגדיל את הפתח. כלול לפחות 5-10 spheroids בצינור תגובה אחד, כדי לאפשר משכפל ולקחת בחשבון את ההפסדים האפשריים במהלך שלבי הכביסה.
  2. צנטריפוגה את spheroids עם צנטריפוגה את הספסל העליון עבור כ 30-60 s ב 1,000 x g. הסר בזהירות את מתילצלולוזה המכיל את הסופרנטנט על ידי ליטוף, מבלי להפריע את הספרואידים.
  3. שטוף עם 50 μL של 1x PBS. חזרו על השלב הצנטריפוגה והוציאו בזהירות את ה-PBS באמצעות ליטוף, כפי שמתואר ב2.2.
  4. בהתאם לחלבון להיות מוכתם, לתקן עם 50 μL של 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (עבור αSMA, NG2 ו אינטאין α3β1) או עם 50 μL של מתנול עבור 10 דקות ב-20 ° צ' (עבור למינציה-332 subunits).
  5. חזור על צעד כביסה כפי שהוסבר בשלבים 2.2-2.3.
  6. החדירות התאים עם 0.1% טריטון-X ב PBS עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. חזור על צעד כביסה כפי שהוסבר בשלבים 2.2-2.3 שלוש פעמים.
  8. מודטת את הספרואידים ב-PBS המכיל 5% FBS ו 2% BSA, עבור 1 h ב RT כדי לחסום אתרים שאינם ספציפיים אינטראקציה חלבונים.
  9. מארג את הספרואידים עם 30 μL של נוגדנים עיקריים ב-PBS, 2.5% FBS ו 1% BSA ב 4 ° c בלילה. הנוגדנים העיקריים הבאים שימשו: anti-αSMA Cy-3 מצופני ו anti-NG2 ב 5 μg/mL; BM2 נגד למינציה ב α3, 6F12 אנטי למינציה ב β3 ו אנטי למינציה ב γ 2 20 μg/mL.
  10. חזור על צעד כביסה כפי שהוסבר בשלבים 2.2-2.3 שלוש פעמים.
  11. מודיית את spheroids עם 30 μL של נוגדנים משניים ב-PBS, 2.5% FBS ו 1% BSA בשעה RT עבור 90 דקות. הנוגדנים המשניים הבאים השתמשו היו: אלקסה 488 נגד ארנבת ונגד עכבר (5 μg/mL).
  12. חזור על צעד כביסה כפי שהוסבר בשלבים 2.2-2.3 שלוש פעמים.
  13. דגירה את התאים עם 30 μL של פתרון DAPI מכתים עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. חזור על צעד כביסה כפי שהוסבר בשלבים 2.2-2.3.
  15. מניחים את הספרואידים על מגלשת זכוכית, בירידה של PBS, באמצעות זכוכית פסטר המחמד.
  16. תמונה של הספרואידים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית במיקרוסקופ סריקת לייזר באמצעות הגדלה של 10x. קח חתך אופטי שונה של מקטע הספרואיד במישורים אופטיים שונים של מחסנית z (15-20 מטוסי מחסנית). כדי להקים את הגדרות הלייזר במיקרוסקופ, להשתמש בתוך ספרואיד מורכב של תאים שליליים עבור אנטיגן של עניין או מוכתם ספרואיד רק עם הנוגדן המשני. שימוש חוזר באותן הגדרות עבור כל הדגימות שיושוו.
  17. לנתח את התמונות מיקרוסקופיים עם תוכנת ImageJ כפי שפורסמו בעבר14. השלבים מסוכמים באיור המשלים 1. כרקע, בדוק את צפיפות האותות המשולבת של אזור מעניין ללא תא (ROI). חשב את המסך הכולל של התאים הפלואורסצנטית (TCCF) כולל:
    Equation 1
  18. קבע את האור הפלואורסצנטית הכולל (TCF) של הספרואידים כ-TCCF מנורמל לאזור הספרואיד ומספר המחסניות.
    Equation 2

3. RT q-PCR של הומוספרואידים

  1. כדי לבצע RT-qPCR, לאסוף לפחות 288 spheroids (מתאים 3 96-טוב צלחות) לתוך שפופרת התגובה 50 mL. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 1,000 x ו להסיר בזהירות את מתילצלולוזה המכיל supernatant על ידי ליטוף בלי להפריע spheroids המשחק.
  2. לשטוף עם 1 מ ל של 1x PBS ולהעביר את spheroids לצינור התגובה 1.5 mL. צנטריפוגה את spheroids עם צנטריפוגה את הספסל העליון עבור כ 30-60 s ב 1,000 x g. הסירי בזהירות את ה-PBS באמצעות ליטוף, מבלי להטריד את הספרואידים.
  3. הנתק את הספרואידים עם 250 μL של 4 מ"ג/mL קולגן, 50 μg/mL DNase I, 2% BSA, 1 מ"מ CaCl2 ב PBS ב 37 ° צ' עבור כ 30-45 דקות על ידי בעדינות vortexing ו פעימות לסירוגין במשך כמה שניות כל 5 דקות.
  4. חזור על צעד כביסה כפי שהוסבר בשלב 3.2.
  5. לבודד RNA הכולל מן התאים של spheroids מתפורר באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרי, על פי ההוראות של היצרנים.
  6. הפוך תעתור את mRNA המבודד לתוך cDNA עם ערכת מסחרית, על פי הוראות היצרנים.
  7. מכמת את רמות התמלול משכפל על ידי PCR בזמן אמת. השימוש התחל היו: α-SMA: Fw 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, Rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′15; שרשרת α3 הלמינציה: Fw 5 ′-GCTC כמוסות-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCCTGGCAATAGC-3 ′16; Β3 שרשרת: Fw 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ Rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; מלמינציה שרשרת γ2: Fw 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ Rev 5 ′-הגנה מפני שלושה ′ 16; NG2: Fw 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ Rev 5 ′-הפוך-3 ′ שלמשחק הגנה. אינטגרציה α3 יחידת משנה: Fw 5 '-AGGGGACCTGCA-3 ' Rev 5 '-שטונגאגרגונגגאכאחתול-3 '19; TOP-1: Fw 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ Rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
  8. תקן את ערכי ה-Ct עבור ה-Ct-ערך של גן התייחסות אנדודוגני כגון TOP-1 באמצעות המשוואה: 2-ΔΔCt. ΔΔCt = ΔCt (מדגם היעד) – ΔCt (דגימת הפניה) ו ΔCt = Ct של גן היעד או גן התייחסות – TOP-I.

4. הזרמת cy, ניתוח של ביטוי אינטגרציה

  1. עבור ניתוח ציטוטומטי זרימה, לאסוף לפחות 288 spheroids (מתאים 3 96-ובכן צלחות) לתוך שפופרת התגובה 50 mL. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 1,000 x g ובזהירות להסיר את מתילתאית המכילה supernatant על ידי ליטוף.
  2. לשטוף עם 1 מ ל של 1x PBS ולהעביר את spheroids לצינור התגובה 1.5 mL. חזרו על הצעד הצנטריפוגה והוציאו בזהירות את ה-PBS באמצעות ליטוף.
  3. הנתק את הspheroids כפי שמתואר בשלב 3.3.
  4. חזור על צעד כביסה כפי שהוסבר בשלב 4.2.
  5. כדי לחסום אתרי איגוד לא ספציפיים וכלה למנוע איגוד של נוגדנים רלוונטיים לזיהוי כדי Fcγ-קולטנים (CD16, CD32, ו CD64), מודלת את התאים 100 μL של PBS המכיל 2% סרום סוסים (או סרום של מינים אחרים בעלי חיים, הנוגדנים של אשר לא יהיו שמש בניסוי) ו 0.1% BSA עבור 20 דקות ב 4 ° צ' עם סיבוב.
  6. במקרה של הצביעת סמנים תאיים, לתקן/לחדור את התאים כפי שמתואר תחת שלב 2.2-2.5.
  7. דגירה את התאים עם הנוגדנים העיקריים ב 100 μL של PBS המכיל 2% סרום סוסים 0.1% BSA עבור 30 דקות ב 4 ° צ' עם סיבוב. לדלל את הנוגדן העיקרי כדי 10 μg/mL.
  8. לשטוף עם 100 μL של PBS + 0.1% BSA שלוש פעמים, עם צעדים צנטריפוגה בצנטריפוגה הספסל העליון ב 1,000 x g בין.
  9. דגירה את התאים עם נוגדנים משני ב 100 μL של PBS המכיל 2% סרום סוסים 0.1% BSA עבור 30 דקות ב 4 ° צ' עם סיבוב. לדלל נוגדן משני כדי 10 μg/mL.
  10. חזור על צעד כביסה כפי שהוסבר בשלב 4.7.
  11. לנתח 2.0 x 104 תאים ויטראז בתוך cytometer זרימה. שער לתאים חיים בודדים דרך העלילה FSC-למטה הקרקע ולנתח את הזריחה של התאים מגודרת על הערוץ המתאים fluorophore שנבחרו.

5. שיטת הפלישה באמצעות הטרוההרואידים

  1. הכן את פתרון היווצרות הספרואיד עבור הטרומאידים, המכיל את סוגי התאים השונים והמדיומים המתאימים, כפי שסוכם בטבלה 1. התאים בעבר התעברו התמרה עם וירוס המכיל וקטורים עבור הביטוי mCherry או GFP.
  2. מילוי 100 μL של פתרון היווצרות ספרואיד בכל באר של הצלחת ו מודקת את הצלחת בחממה תרבות התא עבור 24 שעות כדי לאפשר אחד ספרואיד להיווצר בכל טוב.
  3. הכינו 60 μL של תערובת מטריקס ז'לטין המכילה 2 מ"ג/mL של קולגן זנב החולדה אני, 30% של מטריצה מסחרי מטריקס 2.5 μg/mL של מלמינציה-332 ב שפופרת משנת התגובה 1.5 mL. פזר במהירות 15 μL ב 3 בארות של תא האנגיוגנזה μ-שקופית. הטבע ספרואיד אחד בכל טוב כבר המכיל את ג'ל.
  4. במידת הצורך, התאימו במהירות את מיקום הספרואיד למרכז הבאר עם פיפטה מתחת למיקרוסקופ.
  5. חזור על שלבים 5.2-5.3 לקבלת הטרורואידים הבאים וחזור שוב על ההומוספאידים.
  6. מודטה את הג בחממה עבור 1 h כדי לחזק ולאחר מכן, בעדינות כיסוי ג'ל עם מדיום תרבות התא.
  7. תמונה של הספרואידים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית במיקרוסקופ סריקת לייזר. לקחת חתך אופטי שונים של חתך הספרואיד במישורים אופטיים שונים של z-מחסנית ו בנקודות זמן שונות של פלישה (למשל, 0 h, 24 h, 48 h ו 72 h).
  8. לנתח את התמונות על ידי ספירת מספר הפולשים תאים סרטניים. הפולשים התאים הם אלה שעזבו את ספרואיד ונכנסו לאזור פולשני. האזור פולשני מוגדר כאזור הטבעת בין החלל החיצוני והפנימי שניתנו על ידי התא פלשו הרחוק על ידי הגבול הספרואיד של הספרואיד בתחילת ניסויי הפלישה, בהתאמה, כפי שמתואר באיור משלים 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות של עיצוב ניסיוני זה מתפרסמים ב מרטין Cavaco ואח '13, המומלץ לקריאה נוספת על המסקנות שנלקחו מניסויים אלה.

איור 1, דמות מייצגת של האימונומערכת החיסונית, מראה את החיסוני של אינטגרציה α3 יחידת של שניהם מונצח בשתי הכדורים הנורמליים והונצח cafs (איור 1a), כמו גם את הimmunofluorescent כימות (איור 1B) והרמות הטרנדיות של הגנים המשניים בα3 של ה-qpcr (איור 1b). פאנל זה של תוצאות ממחיש כי אינטגרציה α3 הוא מוסדר למעלה iCAFs, לעומת עמיתו נורמלי. זה הוכיח כי אינטאין α3β1 יכול להיחשב סמן עבור בידול פיברותקיעות הלבלב. זה הוכח גם על ידי זרימה cy, לימודי מחקרים13.

Figure 1
איור 1. ביטוי של אינטגרציה α3 יחידת משנה על ידי iNFs ו-iCAFs. אינטגרציה α3 יחידת הוא upregulated על ידי iCAFs, המשקף את הפוטנציאל שלה כסמן בידול עבור CAFs הלבלב. (א) אימונוהלוקסורפיקציה כתמים של הומוספטאידים של הלבלב הטבעי פיברותקיעות (infs) לעומת ההומוספרואידים של icaf מראה אות מוגברת של אינטα3 יחידת בתאים הבדיל. (ב) האות הפלואורסצנטית של התאים בתוך הספרואיד היה מכמת עם תמונות Z-מחסנית של ספרואיד תלת-ממד, באמצעות התוכנה imagej. פירושו ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים מוצגים ומושווים על-ידי מבחן t (*, p < 0.1). (ג) התאים שהושגו מתוך הספרואידים שאינם מכילים נותחו עבור רמות הטרנדיות שלהם של אינטגרציה α3 subunit. פירושו ± SEM של ΔΔCt-values כשינויי מקפלים משני ניסויים עצמאיים מוצגים ומושווים על-ידי מבחן t. למרות שלא הגיע לרמת המובהקות של 0.1, רמות ההמרה של אינטגרציה α3-קידוד mRNA גבוהים יותר ב-iCAFs מאשר ב-iNFs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הטרוספירואידים
סוג תאים (מעבר עד 25) מספר התאים בינוני (1 חלק מתילתאית +...)
מצ'רי-iCAFs + GFP-I 400 קפה + 400 הלבלב תאים סרטניים 1, 5 התאים החלקים זיכרון עם 10% של FBS ו 1% עט/דלקת + 1, 5 חלקים של RPMI עם 10% של FBS ו 1% עט/דלקת
מדובדבן-α3KO-iCAFs + GFP-I
מדובדבן-iCAFs + GFP-PANC-I 1, 5 התאים החלקים זיכרון עם 10% של FBS ו 1% עט/דלקת + 1, 5 חלקים של DMEM עם 10% של FBS ו 1% עט/דלקת
מדובדבן-α3KO-iCAFs + GFP-PANC-I
הומוספטאידים
סוג תא (מעבר עד 25) מספר התאים בינוני (1 חלק מתילתאית +...)
מדובדבן-iCAFs 400 תאים הגברת 3 חלקים בתוספת עם 10% FBS ו 1% עט/דלקת
מדובדבן-α3KO-iCAFs
GFP-AsPC-I 3 חלקים RPMI עם 10% של FBS ו 1% עט/דלקת
GFP-PANC-אני 3 חלקים DMEM גברת עם 10% של FBS ו 1% עט/דלקת

. שולחן 1 הרכב התא של הטרוסקסואל. והומורואידים מספר התאים הנחוצים להרכבת הטרוסקסואל והומופלאידים, כמו גם המדיום המתאים שצריך להשתמש בו עבור פתרון היווצרות הספרואיד מסוכמים בטבלה הבאה.

משלים איור 1. שלבים רציפים לכמת את החיבור של האימונוללואוורפרוטאין של חלבון התעניינות בספרואידים, באמצעות ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

משלים איור 2. שלבים רציפים לכמת את מספר הפולשים תאים סרטניים בתוך שיטת הפלישה, באמצעות ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לפתח מודל מתאים מחוץ לחדר העבודה כדי ללמוד בידול בקפה הוא משימה מאתגרת. לאחר שימוש בגישות שונות, הגענו למסקנה כי מודל 3D ספרואיד הוא המודל מעשי יותר, פיסיולוגי וקליני, שבו הגומלין בין תאים קרצינומה של הלבלב עם מונצח CAFs ניתן ללמוד. מודל זה מונע הבחנה ספונטנית של הפיברוטינים, בשל התמחלות ארטעובדתיות כגון נוקשות של פלסטיק התרבות התא, לפחות בתנאי תרבות לטווח קצר (עד 48 h). למרות הנוקשות המדויקת של ספרואיד בשימוש במחקרים אלה לא נמדדה, איטו אל. העריך את הקשיחות של תאים הטבור האדם הטבורי ולתאי גזע mesenchymal באמצעות רובוט משולב מיקרופלואידיג שבב22. הקשיות הממוצעת של מדד הטרומאידים נמדדה 1 ו -3 ימים לאחר ההרכבה. הגודל של הספרואידים היה שונה, MSC נראה להגדיל את קיבולת הצבירה שלהם, אשר הביא ירידה בגודל לאורך זמן (מ 135.5 יקרומטר עד 99.8 יקרומטר)21,22. כתוצאה מכך, הנוקשות של ספרואיד גדלה גם מ 5.0 x 10-3 כדי 7.5 x 10-3 Pa22. עם זאת, הקשיות של הספרואידים המורכב של אוכלוסיית הטרוטיפקס של כף s ו AsPC-אני יכול להיות בעל תכונות מכניות וערכי קשיות שונים מן האלה של הומוספרואידים עשוי אוכלוסייה אחת של פיברותקיעות/CAFs. זה עדיין לא ידוע ויכול להיות שונה ממה שתואר על ידי Ito. הנוקשות גם תלויה בכמות ובהצמדה הצולבת של התאים המיוצרים והמופקדת ECM, על האינטראקציות השונות של תאי התא בתוך הספרואיד, על מספר התאים בתוך הספרואיד או על משך התרבות.

כמו כל מודל אחר, העיצוב הניסיוני כולל כמה משתנים הזקוקים לאופטימיזציה כגון מספר התאים הנחוצים כדי ליצור את הספרואידים, נקודות הזמן של טיפול מיקרוסקופיים הדמיה. העיצוב הניסיוני המתואר היה אופטימיזציה עם המטרה של בעל גודל ספרואיד, אשר תהיה השפעה מינימלית בדיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן, כמו יש מגבלת דיפוזיה בשל מגבלות הובלה המונית9. לדוגמה, התחבורה של חמצן spheroids עם גודל גדול יותר מ-150-200 יקרומטר מושפע באופן משמעותי, כמו גם את הדיפוזיה של גלוקוז ו לקטט, באגרגטים גדול יותר מ 300 יקרומטר9,18. Spheroids עם קטרים גדולים יותר מ-400-500 יקרומטר בדרך כלל להציג מבנה שכבתית גלילים המורכב של ליבה נקרוטיק מוקף שכבה קיימא של תאים השקט והשפה החיצונית של מתרבים תאים9,24. כדי למנוע דיפוזיה מוגבלת של תרכובות, כדי לחסל את הבעיה של ליבה ספרואיד נגיש, תאים טופלו TGF-β1, BM2 ו-lebein-1 לפני היווצרות ספרואיד, כאשר התאים מושעה בנפרד בפתרון היווצרות ספרואיד. יתר על כן, כדי לאפשר את הזמינות של חמצן וחומרים מזינים לרוב התאים בספרואיד וכלה למנוע היווצרות של ליבת נקרוטיק, מספר התאים לספרואיד הופחת 750-1000 תאים, אשר טופס spheroids עם קוטר של 140-200 μm.

חשוב לערבב ביסודיות את סוגי התאים השונים בפתרון היווצרות הספרואיד, ולכן הספרואידים מורכבים על-ידי מספר זהה של תאים, הימנעות מהבדלים בגודל משמעותי בין הספרואידים. עם זאת, לפעמים כמה spheroids יכולים להיות קצת יותר גדול מהשני וזה יגרום עוד Z-ערימות רכשה במיקרוסקופ. חלק מההרורואידים עלולים גם לסטות מצורת הכדורית המושלמת, אבל זה נלקח גם בחשבון כאשר ההחזר של הספרואיד הוא מתחום. הבדלים אלה של גודל וצורה מתומחרים בערכי הקוונפיקציה המנורמרים כפי שהוסבר בפסקה הבאה. גורם חשוב נוסף לגבי צורת הספרואיד הוא סוג התא. לדוגמה, פיברובמות ו-CAFs טופס spheroids עם צורה כדורית כמעט, בעוד התאים AsPC-I ו PANC-I טופס הצבירה פיזור יותר של תאים.

עבור הדמיה של spheroids, הקריודורים של spheroids קבוע יכול לשמש גם, אולם את היושרה של ספרואיד עלול להיות נפרץ על התלות, בהתאם לסוג התא ואת פרוטוקול חיסוני. לחילופין, ההכתמים של הספרואיד כולו במבנה התלת-ממדי שלה, הוכיחה להיות אופציה פשוטה יותר. השגת מיקרוסקופי תמונות מוערמות Z של הספרואיד כמבנה תלת-ממד לוקח בממוצע 5-15 דקות לכל שכבה.

בתמונות של הספרואידים קשה לכמת כפי שהם מייצגים מטוסים של מבנים תלת-ממדיים. השיטה בה נעשה שימוש הייתה מבוססת על מסמך אחד שתואר קודם לכן, שבו המחברים מתבוססים והחשיבו את הספרואיד להיות תא14. בדרך זו, האות הפלואורסצנטית מתוקן באמצעות משוואה 1.

כרקע, נקבע צפיפות האות המשולבת של אזור מעניין ללא תא (ROI). צפיפות האותות המשולבת הנמדדת היא הסכום של ערכי העוצמה של הפיקסלים בתוך ההחזר הנבחר. מאחר והספרואידים הם מבנים תלת-ממדיים, התמונות הקונמיות מערימות שונות נרכשים. כדי לעבד תמונות כאלה ניתן למדוד את אות הפלורסנט בכל מחסנית בנפרד או להשתמש בסכום של כל הערימות לתוך Z-הטלה. ניתן לבצע את כל הכימות באמצעות ImageJ. הקרינה הפלואורסצנטית הכוללת (TCF) של הספרואידים נקבעת כ-TCCF המנורמלת, בהתחשב באזור הספרואיד ובמספר המחסניות, באמצעות משוואה 2. זה מסביר את הגדלים השונים של הספרואידים ואת הפער בצורה כדורית. ניתוח מודלי האימונולאורומטר של הספרואידים בשיטה זו יכול להימשך עד 5 דקות לכל היותר.

באופן דומה, פלישה של תאים מתוך spheroids אל מטריצה סטרומה שמסביב ניתן לנתח על ידי אלגוריתמים שונים. שיטה ישירה תוארה בעבר על ידי Nowicki et al, שבו תאים סרטניים פולשני נספר23. על מנת להפלות את התאים הפולשניים מאלה שאינם פולשים, חשוב להקים מגבלה מרחבית מעבר לה התאים נחשבים שעזבו את המבנה הספרואיד. לפיכך, נקודת ההתחלה היא המגבלה המתאימה להיקף של התמונות הספרואיד שנרכשו בנקודת הזמן ההתחלתית (זמן 0), כאשר הרוהרואידים הוטבעו בתוך הג. התא הפולש לג הרחוק ביותר נחשב למרחק המקסימלי תא פולשני יכול להגיע, ולכן הוא מגדיר את השפה החיצונית של אזור הפלישה. שיטה זו סופרת את תאי הסרטן פולשני הנמצאים באזור הפולש, באמצעות הכלי ספירה מ-ImageJ, ואת ROI המתאים הספרואיד בזמן 0 h מתווסף למנהל ROI ולאחר מכן משורבב לתמונה של בדיוק אותו הספרואיד רכשה 48 h או 72 h מאוחר יותר. מסיבה זו, חשוב כי הספרואיד יישאר קרוב למרכז המטוסים ככל האפשר, בתקופות הרכישה השונות. ספירת מספר התאים יכולה להימשך עד 5 דקות לכל הספרואיד.

שיקול חשוב נוסף הוא להבדיל בין סוגי תאים שונים הטרוספרואיד. ניתן לבצע זאת באמצעות צבעי פלורסנט של תאים חיים, אשר יכול להיות בעייתי כאשר לסוג התא יש קצב חלוקה גבוה של תאים או אם הניסוי הוא להתבצע לפרקי זמן ארוכים. הדרך החזקה והאמינה יותר כדי להבדיל בין שתי אוכלוסיות שונות היא לפתח קווי תאים המבטא חלבונים פלורסנט כגון mCherry ו GFP. המסירה של וקטורי הביטוי ניתן לבצע באמצעות הנגיף, אשר מביא ביטוי יציב של חלבונים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים חומר זה משקף רק את דעותיו של המחבר והאיחוד האירופי אינו אחראי לכל שימוש שעשוי להתבצע במידע הכלול בו.

Acknowledgments

אנו מכירים בעזרתו של ברברה שרינג בהכנת הBM2 ולביין -1. אנו מכירים ב-Àgnes נואל, על שיתוף המומחיות שלה בספרואיד. אנו מודים לסוניה שלהאס ולמייקל שלינג לעזרתם בטיפול בזיהום ויראלי בתנאים של S2. אנו מכירים את assistence של סבין פון Rüden's בהכנת CAFs מרקמת סרטן הלבלב.

המחקר המוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתוכנית העם (מארי קירי פעולות) של תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי FP7/2007-2013/תחת הסכם המענק REA n ◦ (316610) כדי J.A.E. יתר על כן, J.A.E. ו A.C.M.C. היה נתמך מבחינה כספית על ידי הגרמני Forsch שבירכתיים (DFG) בתוך אשכול תאים בתנועה של מצוינות (EXC 1003-CiM). פרויקט זה נתמך גם על ידי וילהלם סנדר Stiftung (גרנט: 2016.113.1 to J.A.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) SIGMA-ALDRICH D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
Acetone SIGMA-ALDRICH 32201
Albumin Fraction V - BSA AppliChem A1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse Invitrogen A11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit Invitrogen A11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) Santa Cruz sc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 Millipore AB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) SIGMA-ALDRICH C6198
AsPC-1 cell line ATCC Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifuge Fisher Scientific 50-589-620 Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2) Fluka 21074
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mL Corning 430290
Collagenase B Roche 11088831001
Collagen-I, rat tail Gibco A10483-01
Confocal microscope Zeiss LSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L) Lonza BE12-604F
Dnase I Roche 10104159001
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCaliburTM
Gelifying matrix ThermoFisher Scientific A1413202 Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotype DAKO X 0907
Horse Serum SIGMA-ALDRICH 12449-C
Human Primary Pancreatic Fibroblasts PELOBiotech PB-H-6201
Incubator Heraeus B6060
Laminin-332 Biolamina LN332
MEM SIGMA-ALDRICH M4655
Microplate, 96 wells, U-bottom Greiner Bio-One 650101
Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Mouse IgG, isotype SIGMA-ALDRICH I8765
Multi axle rotating mixer CAT RM5 80V
PANC-I ATCC Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
Paraformaldehyde Riedel-de Haën 16005
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
QuantiTect Reverse Transcription Kit Qiagen 205310
Rat IgG, isotype Invitrogen 10700
Reaction tubes, 1.5 mL Greiner Bio-One 616201
Real-time PCR cycler Qiagen Rotor-Gene Q
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074
RPMI Lonza BE12-702F Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100 SIGMA-ALDRICH X100RS
Vórtex Scientific Industries Vortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoated Ibidi 81501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 150 spheroids קפה מודל 3D בידול מכתים אימונוofor כתמים qPCR זרימה cy הפלישה מטריקס מטריתאי ג'ל
3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D… More

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (150), e60122, doi:10.3791/60122 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter