Summary
Målet med denne protokollen er å etablere en 3D in vitro-modell for å studere differensiering av kreft-assosiert fibroblaster (CAFs) i en svulst bulk-lignende miljø, som kan håndteres i ulike analyse systemer, for eksempel immunofluorescence, transcriptional analyse og livs celle avbildning.
Abstract
Det er viktig å definere den ideelle modellen for en in vitro-studie, hovedsakelig hvis man studerer fysiologiske prosesser som differensiering av celler. I svulsten stroma, vert fibroblaster stimuleres av kreftceller å differensiere. Dermed erverve de en fenotype som bidrar til tumor mikromiljøet og støtter tumorprogresjon. Ved å bruke spheroid modellen, har vi satt opp en slik 3D in vitro modell system, der vi analysert rollen som laminin-332 og dens reseptor integrin α3β1 i denne differensiering prosessen. Dette spheroid modell systemet ikke bare reproduserer tumor mikromiljøet forhold i en mer nøyaktig måte, men også er en svært allsidig modell siden det gir ulike nedstrøms studier, for eksempel immunofluorescent farging av både intra-og ekstracellulære markører, samt avsatt ekstracellulære matrise proteiner. Videre transcriptional analyser av qPCR, flyt flowcytometri og cellulær invasjon kan bli studert med denne modellen. Her beskriver vi en protokoll av en spheroid modell for å vurdere rollen til CAFs ' integrin α3β1 og dets jektopicheski avsatt ligand, laminin-332, i differensiering og støtte invasjonen av kreftceller i bukspyttkjertelen.
Introduction
Svulsten mikromiljøet er en svært kompleks nisje og svært viktig for vedlikehold og progresjon av tumorceller1. Det dannes ikke bare av kreftcellene, men også av stromal fibroblaster. Tumorceller er omgitt av en stroma som er spesifikk og forskjellig fra stroma av normal vev2. Laminin-332 er en ekstracellulære matrise protein jektopicheski uttrykt i stroma av ulike svulster, for eksempel bukspyttkjertelen adenokarsinom3. Videre, den biokjemiske sammensetningen av ECM og også dens Biofysiske egenskaper, slik som stivhet og spenning, endring i svulsten bulk4. Dette tumor stroma, eller "reaktiv stroma", er forårsaket av en tilpasning av fibroblaster til nærliggende kreftceller og ved rekruttering av andre svært viktige aktører som utvikler en gunstig og støttende miljø for tumorprogresjon. Differensiering av stromal fibroblaster resulterer i kreft-assosiert fibroblaster (CAF). Disse cellene kan identifiseres ved hjelp av ulike markører som α-glatte muskel utgangen (αSMA)5 eller neural/gliacellene antigen 2 (NG2)6.
Den mest egnede in vitro -modellen for å recapitulate tumor MIKROMILJØET (TME) med CAFs er vanskelig å velge. Metoden for å etterligne fysiologiske parametre for TME på en kostnadseffektiv og reproduserbar måte må vurderes for en slik modell system. Innenfor TME, ulike prosesser, for eksempel spredning, differensiering, migrasjon og invasjon av ulike celletyper forekomme. Disse cellulære prosesser kan utføres individuelt med ulike metoder. Imidlertid må de eksperimentelle forholdene vurdere mobilnettet interaksjoner med tumor stroma ECM, siden stivhet av undergrunnen påvirker CAF differensiering prosessen. R.G. Wells kommentert virkningen av matrisen stivhet på celle atferd og fremhevet at cytoskjelettkomponenter organisasjon og differensiering status observert i in vitro kultivert celler kan være artefactual7. Ulike stimuli synes å være involvert i CAF differensiering, inkludert mekanisk spenning5,7. For å unngå dette, kan 2D myke underlag være mulige tilnærminger for differensiering studier, som de omgå problemet med stiv kultur parabolen plast. En myk 2D overflate, som fibroblaster kan dyrkes, kan kollagen-I belagt polyakrylamid gels, der gel stivhet kan manipuleres av konsentrasjonen av polyakrylamid og gel kryss-linker. Vedheft og dannelse av αSMA-rike stress fibre forsterkes i fibroblaster sammen med gel stivhet8. Disse resultatene understreker viktigheten av myke substrat stillaser for mer fysiologiske in vitro differensiering modeller. Men i våre hender den eksperimentelle reproduserbarhet og bildebehandling av disse gels var utfordrende. For å overkomme disse svakhetene, endret vi 2D myke substrat system for en 3D spheroid modell for differensiering og invasjon studier. Denne modellen er mer klinisk relevant og ligner på en in vitro organoid, viser in vivo celle-celle interaksjoner, ECM produksjon og deponering, samt celle atferd9.
Spheroids dannes når cellene mangler et substrat å følge. Når cellene er igjen uten en selvklebende overflate, samlet de å danne en mer eller mindre sfærisk struktur. Hvis spheroids er sammensatt av én type celle, kalles de homospheroids; Hvis sammensatt av to eller flere forskjellige celletyper de danner heterospheroids.
Blant de ulike metodene for spheroid forberedelser, utfører vi protokollen ved hjelp av ikke-tilhenger runde bunnen 96-brønn plater. Det er svært effektivt med hensyn til kostnadene. Her produserer vi både homospheroids av fibroblaster, CAF eller CAFs mangler integrin α3 delenhet å undersøke differensiering prosessen og heterospheroids av CAFs eller integrin α3 KO CAFs og bukspyttkjertelen duct kreftceller (AsPC-I og PANC-I) for å studere invasjonen i den omliggende matrisen.
Målet for disse studiene var å bruke primære CAFs isolert fra menneskelige bukspyttkjertelkreft biopsier. Men biopsier å få cellene er knappe og av denne grunn, CAFs brukes i disse studiene har vært udødeliggjort bruker lentivirus inneholder HTERT. De kalles iCAFs, og deres normale kolleger, primære menneskelige bukspyttkjertelen fibroblaster, kalles inf. Den menneskelige bukspyttkjertelen fibroblaster og bukspyttkjertelen duct kreftceller, AsPC-I og PANC-I, er kommersielt tilgjengelig.
Denne protokollen ble brukt til å studere effekten av laminin-332-integrin interaksjon i CAF differensiering prosessen. For å bevise spesifisitet av denne samhandlingen og dens funksjon, hemmere forbindelser ble brukt: BM2, et monoklonale antistoff som blokkerer integrin bindende området laminin-332 α3 kjede10, eller lebein 1, en slangegift avledet sammensatt som blokkerer laminin-bindende integrins α3β1, α6β1 og α7β111,12.
For invasjonen analysen, celler fikk blitt transduced med lentivirus inneholder cDNA omsette til kode enten mCherry (iCAFs og integrin α3 KO iCAFs) eller GFP (AsPC-jeg og PANC-jeg) å skjelne det annerledes cellen typer inne det heterospheroids. Transduction av cellene for å forevige dem og/eller å merke dem med fluorescerende protein (mCherry og GFP) uttrykket er beskrevet i en tidligere studie13, som bør konsulteres for ytterligere informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.3D spheroids som en in vitro modell for Fibroblast/CAF differensiering bruke ulike TGF-β1 hemme forbindelser av celle-matrise interaksjon
- Bland 1 del av 6 mg/mL methylcellulose oppløsning og 3 deler av cellekultur Media, MEM supplert med 1% av varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin/Streptomycin å oppnå spheroid formasjon løsning.
- Resuspend fersk tint udødeliggjort normal fibroblaster (INF), udødeliggjort CAF (iCAFs) eller integrin α3β1 KO iCAF (passasje opp til 25) i spheroid formasjon løsning. Hvis forbereder 1 96 brønn plate, utarbeide et overskudd av spheroid formasjon løsning, 10 mL og tilsett 75 000 celler, husk at hver spheroid er sammensatt av 750 celler, og at 100 μL er fordelt per hver brønn av platen.
- Hvis cytokiner eller integrin hemmere er inkludert i studien, legge disse forbindelsene til cellen suspensjon, for å legge dem inn i spheroids under dannelsen. Merk at INF stimuleres med 10 ng/mL av TGF-β1 for å utløse differensiering. Når det er hensiktsmessig, legger du til inhibitor forbindelser sammen med TGF-β1, for eksempel 20 μg/mL BM2 eller 10 μg/mL av lebein 1.
- Forbered CAF homospheroids på samme måte, men uten den TGF-β1 stimulans, siden de allerede er differensiert. Forbered integrin α3 KO CAF homospheroids uten tilsetning av noen sammensatte.
- Distribuer den spheroid formasjonen til en rund bunn på 96 med flere brønn plater ved å tilsette 100 μL av oppløsningen i hver brønn. Hver gang den spheroid løsningen er fordelt i brønnene, bland godt av pipettering opp og ned, flere ganger.
- Plasser platen i cellen kultur inkubator for 24 h å tillate en spheroid som skal dannes i hver brønn.
- Samle spheroids etter ca 24 h og bruke dem for ulike nedstrøms formål: immunofluorescent farging, sanntid (RT) q-PCR og flyt flowcytometri. For å avdekke uttrykk for intra-og ekstracellulære antigener, inkludert deponering av ECM proteiner i spheroid, bruk immunofluorescent farging. Etter oppløsning av spheroids i enkeltceller, kvantifisere membran-forankret reseptor av Flow flowcytometri. For å oppdage gen aktivering og transcriptional endringer, bruk RT q-PCR av mRNA isolert fra de spheroid cellene.
2. Immunofluorescent farging av spheroids
- Samle spheroids etter ca 24 timer i ett 1,5 mL reaksjons rør per eksperimentell tilstand eller per protein som skal analyseres. For eksempel plassere spheroids av INF stimulert med TGF-β1 i et rør som er forskjellig fra kontroll inf, som ikke ble behandlet. For å unngå brudd på spheroids på grunn av for sterke skjærkrefter, kutt enden av pipette spissen for å forstørre åpningen. Ta med minst 5-10 spheroids i ett reaksjons rør, for å tillate replikerer og ta hensyn til mulige tap under vaske trinnene.
- Sentrifuger spheroids med en benk topp sentrifuger for ca 30-60 s ved 1 000 x g. Fjern forsiktig methylcellulose som inneholder supernatanten ved pipettering, uten å forstyrre pelleted spheroids.
- Vask med 50 μL av 1x PBS. Gjenta det sentrifugering trinnet og fjern PBS forsiktig ved å pipettering, som beskrevet i 2,2.
- Avhengig av protein som skal beiset, fikse med 50 μL av 4% paraformaldehyde i PBS i 20 minutter ved romtemperatur (for αSMA, NG2 og integrin α3β1) eller med 50 μL av metanol i 10 min ved-20 ° c (for laminin-332 under enheter).
- Gjenta vaske trinnet som forklart i trinn 2.2-2.3.
- Permeabilize cellene med 0,1% Triton-X i PBS for 4 min ved romtemperatur.
- Gjenta vaske trinnet som forklart i trinn 2.2 – 2,3 tre ganger.
- Ruge spheroids i PBS inneholder 5% FBS og 2% BSA, for 1 time ved RT å blokkere ikke-spesifikke protein interaksjon nettsteder.
- Ruge spheroids med 30 μL av primær antistoffer i PBS, 2,5% FBS og 1% BSA ved 4 ° c over natten. Følgende primære antistoffer ble brukt: anti-αSMA CY-3 bøyd og anti-NG2 ved 5 μg/mL; BM2 anti-laminin α3, 6F12 anti-laminin β3 og anti-laminin γ 2 20 μg/mL.
- Gjenta vaske trinnet som forklart i trinn 2.2 – 2,3 tre ganger.
- Ruge spheroids med 30 μL av sekundære antistoffer i PBS, 2,5% FBS og 1% BSA ved RT for 90 min. Følgende sekundære antistoffer brukte var: Alexa 488 anti-kanin og anti-mus (5 μg/mL).
- Gjenta vaske trinnet som forklart i trinn 2.2 – 2,3 tre ganger.
- Ruge cellene med 30 μL DAPI farge oppløsning i 4 min ved romtemperatur.
- Gjenta vaske trinnet som forklart i trinn 2.2-2.3.
- Plasser spheroids på et glass lysbilde, i en dråpe PBS, ved hjelp av et glass Pasteur Pipet.
- Bilde av spheroids ved å fluorescens mikroskopi i et laser skanne mikroskop med en forstørrelse på 10x. Ta forskjellige optiske tverrsnitt av spheroid på ulike optiske plan av en z-stabel (15-20 stack fly). For å etablere laser innstillingene i mikroskopet, bruk en spheroid bestående av celler som er negative for antigen av interesse eller en spheroid beiset bare med den sekundære antistoff. Bruk de samme innstillingene for alle prøvene som skal sammenlignes.
- Analysere mikroskopiske bilder med ImageJ programvare som publisert tidligere14. Trinnene oppsummeres i supplerende figur 1. Som bakgrunn, bestemme den integrerte signal tettheten av en celle-fri region av interesse (ROI). Beregn den totale korrigerte celle fluorescens (TCCF) som:
- Bestem samlet korrigert fluorescens (TCF) av spheroids som TCCF normalisert til området av spheroid og antall stabler.
3. RT q-PCR av homospheroids
- For å utføre RT-qPCR, samle minst 288 spheroids (tilsvarende 3 96-brønn plater) i et 50 mL reaksjons rør. Sentrifuger for 5 min på 1 000 x g og forsiktig fjerne methylcellulose-inneholdende supernatanten ved pipettering uten å forstyrre pelleted spheroids.
- Vask med 1 mL 1x PBS og Overfør spheroids til et 1,5 mL reaksjons rør. Sentrifuger spheroids med en benk topp sentrifuger for ca 30-60 s ved 1 000 x g. Forsiktig fjerne PBS av pipettering, uten å forstyrre pelleted spheroids.
- Distansere spheroids med 250 μL av 4 mg/mL kollagenase B, 50 μg/mL DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2 i PBS ved 37 ° c i ca 30-45 min ved forsiktig virvlingen og pulserende periodisk i noen sekunder hver 5 min.
- Gjenta vaske trinnet som forklart i trinn 3,2.
- Isoler den totale RNA-en fra cellene i oppløst spheroids ved hjelp av et kommersielt RNA isolasjons sett, i henhold til produsentens anvisninger.
- Omvendt transkribere den isolerte mRNA i cDNA med en kommersiell Kit, ifølge produsentens instruksjoner.
- Kvantifisere transkripsjon nivåer i replikerer av sanntids PCR. Den primere brukt var: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ', rev 5 ' ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 '15; Laminin α3 kjede: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 '16; Laminin β3 kjede: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ' rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 '17; Laminin γ2 kjede: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ' rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ' 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ' rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 '18; integrin α3 delenhet: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOPP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ' rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 '20.
- Rett CT-verdiene for CT-verdien av en endogene referanse genet som TOP-1 ved hjelp av ligningen: 2-ΔΔCt. ΔΔCt = ΔCt (mål prøve) – ΔCt (referanse prøve) og ΔCt = CT av mål gen eller referanse gen – TOP-I.
4. Flow flowcytometri analyse av integrin uttrykk
- For strømnings analytiske analyse, samle minst 288 spheroids (tilsvarende 3 96-brønn plater) til en 50 mL reaksjons rør. Sentrifuger for 5 min ved 1 000 x g og fjern forsiktig methylcellulose som inneholder supernatanten ved pipettering.
- Vask med 1 mL 1x PBS og Overfør spheroids til et 1,5 mL reaksjons rør. Gjenta sentrifugering trinnet og fjern forsiktig PBS ved å pipettering.
- Distansere spheroids som beskrevet i trinn 3,3.
- Gjenta vaske trinnet som forklart i trinn 4,2.
- For å blokkere ikke-spesifikke bindings områder og for å hindre binding av deteksjons relevante antistoffer mot Fcγ-reseptorer (CD16, CD32 og CD64), ruge cellene i 100 μL av PBS som inneholder 2% heste serum (eller serum av andre dyrearter, antistoffer som ikke vil bli brukes i eksperimentet) og 0,1% BSA i 20 min ved 4 ° c med rotasjon.
- I tilfelle farging intracellulære markører, Fix/permeabilize cellene som beskrevet under trinn 2.2-2.5.
- Ruge cellene med primær antistoffer i 100 μL av PBS som inneholder 2% heste serum og 0,1% BSA i 30 min ved 4 ° c med rotasjon. Fortynne primær antistoff til 10 μg/mL.
- Vask med 100 μL av PBS + 0,1% BSA tre ganger, med sentrifugering trinn i den øverste benk sentrifuge på 1 000 x g i mellom.
- Ruge cellene med sekundære antistoffer 100 μL av PBS som inneholder 2% heste serum og 0,1% BSA i 30 min ved 4 ° c med rotasjon. Fortynne sekundært antistoff til 10 μg/mL.
- Gjenta vaske trinnet som forklart i trinn 4,7.
- Analyser 2,0 x 104 farget celler i en flyt flowcytometer. Gate for én levende celler via FSC-SSC prikken tomten og analysere fluorescens av gated celler på kanalen som passer for den valgte fluoroforen.
5. invasjonen analysen benytter heterospheroids
- Forbered spheroid formasjon løsning for heterospheroids, som inneholder de ulike celletyper og tilsvarende medier, som oppsummert i tabell 1. Cellene hadde tidligere vært transduced med lentivirus inneholder vektorer for enten mCherry eller GFP uttrykk.
- Fyll 100 μL av spheroid formasjon løsning i hver brønn av platen og ruge platen i cellen kultur inkubator for 24 h slik at en spheroid skal dannes i hver brønn.
- Forbered 60 μL av geléaktige matrise blanding som inneholder 2 mg/mL av rotte tail kollagen I, 30% av kommersiell gelifying matrise og 2,5 μg/mL av laminin-332 i en 1,5 mL reaksjons rør. Distribuer raskt 15 μL i 3 brønner i det μ angiogenese kammeret. Bygg inn en spheroid i hver brønn som allerede inneholder gelen.
- Om nødvendig kan du raskt justere plasseringen av spheroid til midten av brønnen med en pipette under mikroskopet.
- Gjenta trinn 5.2-5.3 for neste heterospheroids og gjenta igjen for homospheroids.
- Ruge gels i inkubator for 1 t å stivne, og deretter forsiktig overlappe gels med cellekultur medium.
- Bilde av spheroids ved å fluorescens mikroskopi i et laser skanne mikroskop. Ta ulike optiske tverrsnitt av spheroid på ulike optiske fly av en z-stack og på ulike tidspunkt punkter for invasjon (f. eks 0 h, 24 h, 48 h og 72 h).
- Analysere bildene ved å telle antall invaderende kreftceller. Invaderende celler er de som har forlatt spheroid og gikk inn i invasiv området. Den invasive området er definert som ringen området mellom den ytre og indre perimeters gitt av lengst invaderte cellen og av spheroid grensen av spheroid i begynnelsen av invasjonen eksperimenter, henholdsvis som beskrevet i supplerende figur 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene av denne eksperimentelle design er publisert i Martins Cavaco et al.13, som er anbefalt for videre lesning om konklusjonene som ble trukket fra disse eksperimentene.
Figur 1, et representativt bilde av en immunofluorescent spheroid, viser immunostaining av integrin α3 delenhet av både udødeliggjort normal fibroblaster og udødeliggjort CAFs (figur 1a), samt immunofluorescence kvantifisering (figur 1B) og transcriptional nivåer av integrin α3 delenhet gen av QPCR (figur 1C). Dette panelet av resultatene viser at integrin α3 er opp-regulert i iCAFs, sammenlignet med den normale motstykket. Dette beviste at integrin α3β1 kan betraktes som en markør for bukspyttkjertelen fibroblaster differensiering. Dette ble også demonstrert av Flow flowcytometri studier13.
Figur 1. Uttrykk for integrin α3 delenhet av inf og iCAFs. Den integrin α3 delenhet er upregulated av iCAFs, som reflekterer dens potensiale som en differensiering markør for bukspyttkjertelen CAFs. (A) Immunofluorescent farging av homospheroids av normal bukspyttkjertelen fibroblaster (INF) sammenlignet med Homospheroids av iCAF viser et økt signal om integrin α3 delenhet i differensiert celler. (B) fluorescens signal av cellene i spheroid ble kvantifisert med Z-stabelen bilder av 3D-spheroid, ved hjelp av ImageJ programvare. Means ± SEM av tre uavhengige eksperimenter vises og sammenlignes med t-test (*, p < 0,1). (C) cellene innhentet fra dissosiert spheroids ble analysert for sine transcriptional nivåer av integrin α3 delenhet. Means ± SEM av ΔΔCt-verdier som fold endringer fra to uavhengige eksperimenter er vist og sammenlignet med t-test. Selv om det ikke når viktighetsnivået 0,1, er de transcriptional nivåene av integrin α3-koding mRNA høyere i iCAFs enn i inf. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Heterospheroids | ||
| Celle type (passasje opp til 25) | Antall celler | Middels (1 del methylcellulose +...) |
| mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-I | 400 CAF + 400 bukspyttkjertelkreft celler | 1, 5 deler celle MEM med 10% av FBS og 1% penn/strep + 1, 5 deler av RPMI med 10% av FBS og 1% penn/strep |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I | ||
| mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I | 1, 5 deler celle MEM med 10% av FBS og 1% penn/strep + 1, 5 deler av DMEM med 10% av FBS og 1% penn/strep | |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-PANC-I | ||
| Homospheroids | ||
| Celle type (passasje opp til 25) | Antall celler | Middels (1 del methylcellulose +...) |
| mCherry-iCAFs | 400 celler | 3 deler MEM supplert med 10% av FBS og 1% penn/strep |
| mCherry-α3KO-iCAFs | ||
| GFP-AsPC-I | 3 deler RPMI med 10% av FBS og 1% penn/strep | |
| GFP-PANC-I | 3 deler DMEM med 10% av FBS og 1% penn/strep | |
Tabell 1. Celle sammensetning av hetero-og homospheroids. Antall celler som er nødvendige for å montere hetero-og homospheroids samt tilsvarende medium som skal brukes for spheroid formasjon løsningen er oppsummert i følgende tabell.
Supplerende figur 1. Sekvensielle trinn for kvantifisering av immunofluorescent farging av et protein av interesse for spheroids, ved hjelp av ImageJ. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2. Sekvensielle trinn for kvantifisering av antall invaderende kreftceller i invasjonen analysen, ved hjelp ImageJ. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å utvikle en hensiktsmessig in vitro-modell for å studere CAF differensiering er en utfordrende oppgave. Etter å ha tatt i mot ulike tilnærminger, konkluderte vi med at en 3D-spheroid modell er den mer praktiske, fysiologiske og klinisk relevante modellen, hvor samspillet mellom kreftceller i bukspyttkjertelen med udødeliggjort CAFs kan bli studert. Denne modellen forhindret spontan differensiering av fibroblaster, på grunn av artefactual stressfaktorer som stivhet av cellen kultur plast, i det minste i kortsiktige kultur forhold (opp til 48 h). Selv om den nøyaktige stivheten til spheroid som brukes i disse studiene ikke ble målt, ble Ito et al. evaluert stivheten av menneskelig navle vene endothelial celler og mesenchymal stilk cellen heterospheroids ved hjelp av en robot integrert mikrovæskebasert chip22. Den gjennomsnittlige stivhet-indeksen av heterospheroids ble målt 1 og 3 dager etter montering. Størrelsen på spheroids var annerledes, MSC syntes å øke sin aggregering kapasitet, noe som resulterte i en nedgang i størrelse over tid (fra 135,5 μm til 99,8 μm)21,22. Følgelig, stivhet av spheroid også økte fra 5,0 x 10-3 til 7,5 x 10 til3 pa22. Men stivheten av spheroids sammensatt av en heterotypic befolkning på CAFs og AsPC-jeg kan ha mekaniske egenskaper og stivhet verdier forskjellig fra de av homospheroids laget av en enkelt befolkning på fibroblaster/CAFs. Dette er fortsatt ukjent og kan være forskjellig fra det som ble beskrevet av Ito et al22. Stivheten avhenger også av mengden og kryss-kobling av celle-produsert og avsatt ECM, på de ulike celle-celle interaksjoner innenfor spheroid, på antall celler i spheroid eller på varigheten av kulturen.
Som alle andre modeller, den eksperimentelle design innebærer noen variabler som trenger optimalisering som antall celler er nødvendig for å danne spheroids, tidspunktet poeng av behandling og mikroskopisk bildebehandling. Den beskrevne eksperimentelle designen ble optimalisert med sikte på å ha en spheroid størrelse, som ville ha minimal innflytelse i spredningen av næringsstoffer og oksygen, som det er en diffusjon grense på grunn av masse transportbegrensninger9. For eksempel er transport av oksygen i spheroids med en størrelse større enn 150-200 μm signifikant påvirket, så vel som spredningen av glukose og melkesyre, i aggregater som er større enn 300 μm9,18. Spheroids med diametre større enn 400-500 μm vanligvis presentere en konsentrisk lagdelt struktur bestående av en nekrotisk kjerne omgitt av et levedyktig lag av Quiescent celler og en ytre kant av voksende celler9,24. For å unngå begrenset diffusjon av forbindelser, og for å eliminere problemet med utilgjengelige spheroid kjernen, ble celler behandlet med TGF-β1, BM2 og lebein-1 før spheroid formasjon, når cellene er individuelt suspendert i spheroid formasjon løsning. Videre, for å tillate tilgjengeligheten av oksygen og næringsstoffer til de fleste av cellene i spheroid og for å hindre dannelsen av en nekrotisk kjerne, ble antall celler per spheroid redusert til 750-1000 celler, som danner spheroids med en diameter på 140-200 μm.
Det er viktig å grundig blande de ulike celletyper i spheroid formasjon løsning, slik at spheroids er sammensatt av omtrent samme antall celler, unngå betydelige størrelses forskjeller mellom spheroids. Likevel, noen ganger noen spheroids kan være litt større enn den andre, og som vil resultere i mer Z-stabler ervervet i mikroskopet. Noen spheroids kan også avvike fra perfekt sfærisk form, men dette er også tatt i betraktning når AVKASTNINGEN av spheroid er avgrenset. Disse forskjellene av størrelse og form er utgjorde normalisert kvantifisering verdier som forklart i neste avsnitt. En annen viktig faktor når det gjelder formen på spheroid er celletypen. Fibroblaster og CAFs danner for eksempel spheroids med en nesten sfærisk form, mens AsPC-I-og PANC-celler danner en mer spredt samling av celler.
For avbildning av spheroids kan cryosections av faste spheroids også brukes, men integriteten til spheroid kan være kompromittert ved snitting, avhengig av celletypen og immunostaining-protokollen. Alternativt, farging av hele spheroid i sin 3D-struktur, viste seg å være et enklere alternativ. Anskaffelse av mikroskopiske Z-stablede bilder av spheroid som en 3D-struktur tar i gjennomsnitt 5-15 min per spheroid.
Den immunofluorescent signaler i bilder av spheroids er vanskelig å kvantifisere som de representerer fly av 3D-strukturer. Metoden som ble brukt var basert på en tidligere beskrevet en, der forfatterne ekstrapolert og betraktet spheroid å være en celle14. På denne måten korrigeres fluorescens signalet ved hjelp av Formel 1.
Som bakgrunn ble den integrerte signal tettheten til en celle-fri region av interesse (ROI) bestemt. Den målte integrerte signal tettheten er summen av intensitet verdiene i piksler innenfor den valgte AVKASTNINGEN. Siden spheroids er 3D-strukturer, blir konfokalmikroskopi bilder fra forskjellige stabler anskaffet. Å behandle slike bilder kan man måle fluorescerende signal i hver stabel individuelt eller bruke summen av alle stabler i en Z-projeksjon. Alle quantifications kan utføres ved hjelp av ImageJ. Den totale korrigerte fluorescens (TCF) av spheroids bestemmes som normalisert TCCF, med tanke på området av spheroid og antall stabler, ved hjelp av ligning 2. Dette står for varierende størrelser av spheroids og avviket i sfærisk form. Analysere immunofluorescent farging av spheroids ved hjelp av denne metoden kan ta opptil 5 min per spheroid.
Tilsvarende kan invasjonen av celler fra spheroids inn i omkringliggende stromal matrise analyseres av ulike algoritmer. En grei metode ble tidligere beskrevet av Nowicki et al, der invasiv kreftceller ble talt23. For å diskriminere de invasive cellene fra de som ikke invadere, er det viktig å etablere en romlig grense utover som cellene anses å ha forlatt spheroid struktur. Derfor er utgangspunktet grensen som tilsvarer omkretsen av de spheroid bildene ervervet ved starttidspunktet (tid 0), da spheroids ble innebygd i gelen. Cellen som invaderer gelen lengst anses maksimal avstand en invasiv celle kan nå, og dermed definerer den ytre kanten av invasjonen regionen. Denne metoden teller invasiv kreftceller som er til stede i invaderende området, ved hjelp av telling verktøyet fra ImageJ, og AVKASTNINGEN tilsvarer spheroid på tid 0 h er lagt til AVKASTNINGEN Manager og deretter overført til bildet av de samme spheroid ervervet 48 h eller 72 h senere. Av denne grunn er det viktig at spheroid forblir så nær sentrum av flyene som mulig, under de ulike tider av oppkjøpet. Telling av antall celler kan ta opptil 5 min per spheroid.
En annen viktig faktor er å skille de ulike celle typene i heterospheroid. Dette kan utføres ved hjelp av levende celle fluorescerende fargestoffer, som kan være problematisk når celletypen har en høy celledeling rate eller hvis eksperimentet skal utføres i lange perioder av gangen. Den mer robuste og pålitelige måten å skille de to forskjellige populasjoner er å utvikle cellelinjer uttrykke fluorescerende proteiner som mCherry og GFP. Levering av uttrykket vektorer kan utføres ved hjelp av lentivirus, som resulterer i stabile uttrykk for disse proteinene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Dette materialet reflekterer bare forfatterens synspunkter og EU er ikke ansvarlig for eventuell bruk som kan gjøres av informasjonen som finnes der.
Acknowledgments
Vi erkjenner Barbara Schedding hjelp i utarbeidelsen av BM2 og lebein-1. Vi erkjenner Àgnes Noel for å dele sin ekspertise i spheroid analyser. Vi takker Sonja Schelhaas og Michael Schäfers for deres hjelp i håndteringen lentiviral transfeksjoner under S2 forhold. Vi erkjenner Sabine von Rüden's assitent i å forberede CAFs fra bukspyttkjertelen kreft vev.
Forskningen som fører til disse resultatene har fått støtte fra person programmet (Marie Curie Actions) av EUs syvende rammeprogram FP7/2007-2013/under REA gi avtalen n ◦ (316610) til J.A.E. Videre ble J.A.E. og A.C.M.C. økonomisk støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) innenfor Cells-in-Motion Cluster of Excellence (eks 1003-CiM). Dette prosjektet ble også støttet av Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
