Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/60122
Automatic Translation
1,2, 1
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

Summary

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Abstract

Het definiëren van het ideale model voor een in vitro studie is essentieel, vooral als het bestuderen van fysiologische processen zoals differentiatie van cellen. In de tumor stroma, gastheer fibroblasten worden gestimuleerd door kankercellen te differentiëren. Dus, ze verwerven een fenotype dat bijdraagt aan de tumor micro omgeving en ondersteunt de progressie van de tumor. Door gebruik te maken van het spheroid-model hebben we zo'n 3D in vitro modelsysteem opgezet, waarin we de rol van laminin-332 en de receptor integrine α3β1 in dit differentiatieproces analyseerden. Dit spheroid-modelsysteem reproduceert niet alleen de omstandigheden van de tumor microomgeving op een nauwkeurigere manier, maar is ook een zeer veelzijdig model, omdat het verschillende downstreamonderzoeken mogelijk maakt, zoals immunofluorescentie kleuring van zowel intra-als extracellulaire markers, evenals gedeponeerde extracellulaire matrix eiwitten. Bovendien kunnen transcriptionele analyses van qPCR, flow cytometrie en cellulaire invasie met dit model worden bestudeerd. Hier beschrijven we een protocol van een spheroid-model om de rol van CAFs ' integrine α3β1 te beoordelen en zijn ectopisch gestorte ligand, laminin-332, in differentiatie en ter ondersteuning van de invasie van pancreaskanker cellen.

Introduction

De tumor micro Environment is een zeer complexe niche en uiterst belangrijk voor het onderhoud en de progressie van de tumorcellen1. Het wordt niet alleen gevormd door de kankercellen, maar ook door stromale fibroblasten. De tumorcellen zijn omgeven door een stroma die specifiek is en verschillend van de stroma van normale weefsels2. Laminine-332 is een extracellulair matrix eiwit ectopisch uitgedrukt in de stroma van verschillende tumoren, zoals pancreas adenocarcinoom3. Bovendien, de biochemische samenstelling van de ECM en ook haar biofysische eigenschappen, zoals stijfheid en spanning, verandering binnen de tumor bulk4. Deze tumor stroma, of "reactieve stroma", wordt veroorzaakt door een aanpassing van fibroblasten aan de naburige kankercellen en door de werving van andere zeer belangrijke spelers die een gunstige en ondersteunende omgeving voor tumorprogressie ontwikkelen. De differentiatie van stromale fibroblasten resulteert in kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF). Deze cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van verschillende markers zoals α-gladde spier actine (αsma)5 of neurale/glial antigeen 2 (ng2)6.

Het meest geschikte in vitro model om de tumor micro Environment (TME) met CAFS te recapituleren is moeilijk te selecteren. De methode voor het nabootsen van fysiologische parameters van de TME op een kostenefficiënte en reproduceerbare manier moet worden overwogen voor een dergelijk modelsysteem. Binnen de TME, verschillende processen, zoals proliferatie, differentiatie, migratie en invasie van de verschillende celtypen optreden. Deze cellulaire processen kunnen individueel worden uitgevoerd met verschillende methoden. Echter, de experimentele omstandigheden moeten rekening houden met de cellulaire interacties met de tumor stroma ECM, aangezien de stijfheid van de substratum invloed op de CAF differentiatieproces. R.G. Wells becommentarieerde de impact van matrix stijfheid op Celgedrag en benadrukte dat cytoskelet organisatie en differentiatie status waargenomen in in vitro gekweekte cellen mogelijk artefeitelijk7. Verschillende stimuli lijken te worden betrokken bij CAF differentiatie, met inbegrip van mechanische spanning5,7. Om dit te voorkomen, kunnen 2D zachte substraten mogelijk benaderingen voor differentiatie studies, als ze het probleem van de stijve cultuur schotel plastic omzeilen. Een zacht 2D-oppervlak, waarop fibroblasten kunnen worden geteeld, kan collageen-I gecoate polyacrylamidegels zijn, waarbij de gelstijfheid kan worden gemanipuleerd door de concentratie van polyacrylamide en de gel cross-linker. De hechting en vorming van αSMA-rijke stress vezels worden versterkt in fibroblasten samen met de gel stijfheid8. Deze resultaten benadrukken het belang van zachte substraat steigers voor meer fysiologische in vitro differentiatie modellen. Echter, in onze handen waren de experimentele reproduceerbaarheid en beeldvorming van deze gels uitdagend. Om deze tekortkomingen te overwinnen, veranderden we het 2D zachte substraat systeem voor een 3D-spheroid-model voor differentiatie en invasie studies. Dit model is meer klinisch relevant en, vergelijkbaar met een in vitro organoïde, aan in vivo celcelinteracties, ECM productie en depositie, evenals Celgedrag9.

Spheroids worden gevormd wanneer cellen een substraat missen om zich aan te houden. Wanneer de cellen worden gelaten zonder een lijm oppervlak, ze aggregeren om een meer of minder sferische structuur te vormen. Als de sferoïden zijn samengesteld uit één type cel, worden ze homo-spheroïden genoemd; Als het bestaat uit twee of meer verschillende celtypen, vormen ze heterospheroids.

Onder de verschillende methoden voor het bereiden van spheroid voeren we het protocol uit met niet-aanhandige ronde bodem 96-well Plates. Het is zeer effectief met betrekking tot de kosten. Hier produceren we zowel homospheroïden van fibroblasten, CAF of CAFs zonder de integrine α3-subeenheid om het differentiatieproces te onderzoeken en heterospheroïden van CAFs of integrine α3 KO CAFs en pancreas cellen van de alvleesklier (AsPC-I en PANC-I) om de invasie te bestuderen in de omringende matrix.

Het doel voor deze studies was het gebruik van primaire CAFs geïsoleerd van menselijke alvleesklier carcinoom biopsies. Echter, de biopsieën om de cellen te verkrijgen zijn schaars en om deze reden, de CAFs gebruikt in deze studies zijn vereeuwigd met behulp van lentivirus met HTERT. Ze heten icafs, en hun normale tegenhangers, primaire menselijke alvleesklier fibroblasten, worden genoemd INFS. De humane alvleesklier fibroblasten en de tumorcellen van de alvleesklier, AsPC-I en PANC-I, zijn in de handel verkrijgbaar.

Dit protocol werd gebruikt om het effect van de interactie laminin-332-integrin in het CAF-differentiatieproces te bestuderen. Om de specificiteit van deze interactie en zijn functie te bewijzen, werden remmer-verbindingen gebruikt: BM2, een monoklonaal antilichaam dat de integrine bindingsplaats de laminin-332 α3 keten10, of lebein 1, een slang Venom afgeleide stof blokkeert die de laminine binding Integrins α3β1, α6β1 en α7β111,12.

Voor de invasie test waren cellen met lentivirus, die cDNA-codering bevatten, ofwel mCherry (iCAFs en integrine α3 KO iCAFs) of GFP (AsPC-I en PANC-I) om de verschillende celtypen in de heterospheroïden te onderscheiden. De transductie van de cellen om ze te vereeuwigen en/of om ze te labelen met een fluorescerende proteïne (mCherry en GFP) expressie wordt beschreven in een eerdere studie13, die moet worden geraadpleegd voor meer informatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.3D-sferoïden als een in vitro model voor fibroblast/CAF-differentiatie met behulp van verschillende TGF-β1 remmende verbindingen van celmatrix interactie

  1. Meng 1 deel van 6 mg/mL methylcellulose-oplossing en 3 delen celkweek media, MEM aangevuld met 1% van het warmtegeïnactiveerde foetale runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine om de spheroid-formatie oplossing te verkrijgen.
  2. Resubreng vers ontdooide vereeuwigd normale fibroblasten (iNFs), vereeuwigd CAF (iCAFs) of integrine α3β1 KO iCAF (passage tot 25) in de spheroid-formatie oplossing. Bij de bereiding van 1 96 goed plaat, bereid een overmaat van spheroid formatie oplossing, 10 mL en voeg 75.000 cellen, rekening houdend met het bestaan van elke spheroid is samengesteld door 750 cellen, en dat 100 μL worden verdeeld per put van de plaat.
  3. Als cytokines of integrineremmers in de studie zijn opgenomen, voeg deze verbindingen toe aan de celsuspensie om ze tijdens hun vorming in de spheroïden te verankeren. Merk op dat iNFs worden gestimuleerd met 10 ng/mL TGF-β1 om differentiatie te triggeren. Voeg in voorkomend geval remmer-verbindingen toe samen met TGF-β1, zoals 20 μg/mL BM2 of 10 μg/mL lebein 1.
  4. Bereid CAF homospheroids op dezelfde manier, maar zonder de TGF-β1 stimulus, omdat ze zijn al gedifferentieerd. Bereid de integrine α3 KO CAF homospheroids zonder toevoeging van een compound.
  5. Verdeel de spheroid-formatie oplossing op een ronde bodem 96 multi-well plaat door 100 μL van de oplossing in elke put toe te voegen. Elke keer dat de spheroid-oplossing in de putjes wordt verdeeld, meng je goed door meerdere malen op en neer te pipetteren.
  6. Plaats de plaat in de celkweek incubator voor 24 uur zodat één spheroid in elke put kan worden gevormd.
  7. Verzamel de spheroïden na ongeveer 24 uur en gebruik ze voor verschillende downstream-doeleinden: immunofluorescentie kleuring, real-time (RT) q-PCR en flow cytometrie. Om de expressie van intra-en extracellulaire antigenen te detecteren, met inbegrip van de afzetting van ECM-eiwitten binnen de spheroid, gebruikt u immunofluorescentie kleuring. Na desintegratie van sferoïden in afzonderlijke cellen, kwantificeren membraan-verankerde receptor doorstroming cytometrie. Om genactivatie en transcriptionele veranderingen te detecteren, gebruikt u RT q-PCR van mRNA geïsoleerd uit de spheroid-cellen.

2. immunofluorescentie kleuring van sferoïden

  1. Verzamel de spheroïden na ongeveer 24 uur in één 1,5 mL-reactie buis per experimentele aandoening of per te analyseren eiwit. Bijvoorbeeld, plaats de sferoïden van INFS gestimuleerd met TGF-β1 in een buis verschillend van de controle-INFS, die niet werden behandeld. Snijd het uiteinde van de pipetpunt om de opening te vergroten om te voorkomen dat de spheroïden scheuren vanwege te sterke afschuifkrachten. Omvatten ten minste 5-10 sferoïden in één reactie buis, om replicaten toe te staan en rekening te houden met de mogelijke verliezen tijdens de wasstappen.
  2. Centrifugeer de sferoïden met een bench top centrifuge voor ongeveer 30-60 s bij 1.000 x g. Verwijder voorzichtig de methylcellulose-bevattende supernatant door pipetteren, zonder de gepileerde spheroids te verstoren.
  3. Wassen met 50 μL 1x PBS. Herhaal de Centrifugeer stap en verwijder de PBS voorzichtig door pipetteren, zoals beschreven in 2,2.
  4. Afhankelijk van het te bevlekt eiwit, fixeert u met 50 μL van 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (voor αSMA, NG2 en integrine α3β1) of met 50 μL methanol gedurende 10 min bij-20 °C (voor laminine-332 subeenheden).
  5. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3.
  6. Permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton-X in PBS gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.
  8. Inbroed de spheroïden in PBS met 5% FBS en 2% BSA, gedurende 1 uur bij RT om niet-specifieke proteïne-interactie sites te blokkeren.
  9. Incuberen de spheroïden met 30 μL primaire antilichamen in PBS, 2,5% FBS en 1% BSA bij 4 °C 's nachts. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: anti-αSMA CY-3 geconjugeerd en anti-NG2 bij 5 μg/mL; BM2 anti-laminin α3, 6F12 anti-laminin β3 en anti-laminin γ 2 20 μg/mL.
  10. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.
  11. Inbroed de spheroïden met 30 μL secundaire antilichamen in PBS, 2,5% FBS en 1% BSA bij RT gedurende 90 min. De volgende secundaire antilichamen werden gebruikt: Alexa 488 anti-Rabbit en anti-Mouse (5 μg/mL).
  12. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.
  13. Incuberen de cellen met 30 μL DAPI-kleurings oplossing gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
  14. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3.
  15. Plaats de sferoïden op een glazen glijbaan, in een druppel PBS, met een glazen Pasteur pipet.
  16. Beeld de sferoïden door fluorescentiemicroscopie in een laser scanning microscoop met een vergroting van 10x. Neem verschillende optische dwarsdoorsnede van de spheroid op verschillende optische vlakken van een z-stack (15-20 stapel vlakken). Om de laser instellingen in de Microscoop vast te stellen, gebruikt u een spheroid die bestaat uit cellen die negatief zijn voor het antigeen of een spheroid die alleen met het secundaire antilichaam wordt gebeitst. Hergebruik dezelfde instellingen voor alle samples die worden vergeleken.
  17. Analyseer de microscopische beelden met ImageJ-software zoals eerder gepubliceerd14. De stappen worden samengevat in aanvullend figuur 1. Bepaal als achtergrond de geïntegreerde signaal dichtheid van een cel-vrije regio van belang (ROI). Bereken de totale gecorrigeerde celfluorescentie (TCCF) als:
    Equation 1
  18. Bepaal de totale gecorrigeerde fluorescentie (TCF) van de spheroïden als de TCCF genormaliseerd naar het gebied van de spheroid en het aantal stapels.
    Equation 2

3. RT q-PCR van homospheroïden

  1. Om Rt-qPCR uit te voeren, verzamelt u ten minste 288 sferoïden (overeenkomend met 3 96-well-platen) in een reactie buis van 50 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 x g en verwijder voorzichtig de methylcellulose bevattende supernatant door pipetteren zonder de gepileerde spheroids te verstoren.
  2. Was met 1 mL 1x PBS en breng de sferioïden over naar een reactie buis van 1,5 mL. Centrifugeer de sferoïden met een bench top centrifuge voor ongeveer 30-60 s bij 1.000 x g. Verwijder de PBS voorzichtig met pipetteren, zonder de gepileerde-spheroids te storen.
  3. Dissociate de sferoïden met 250 μL van 4 mg/ml Collagenase B, 50 μg/ml DNase I, 2% BSA, 1 mm CACL2 in PBS bij 37 °c gedurende ongeveer 30-45 min door het zachtjes vortexen en pulseren met tussenpozen gedurende een paar seconden elke 5 min.
  4. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 3,2.
  5. Isoleer het totale RNA van de cellen van uiteenvallen sferoïden met behulp van een commerciële RNA Isolation Kit, volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Reverse transcriberen de geïsoleerde mRNA in cDNA met een commerciële Kit, volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Kwantificeer de transcriptie niveaus in replicaten door real-time PCR. De gebruikte primers waren: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, Rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′15; Laminin α3 keten: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 keten: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ Rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2-keten: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ Rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ Rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; integrine α3 subeenheid: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' Rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ Rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
  8. Corrigeer de CT-waarden voor de CT-waarde van een endogeen referentie-gen zoals TOP-1 met behulp van de vergelijking: 2-δδct. ΔΔCt = ΔCt (doel monster) – ΔCt (referentiemonster) en ΔCt = CT van het doel gen of referentie-gen – TOP-I.

4. Flowcytometrie analyse van integrine expressie

  1. Voor Flow cytometrische analyse, verzamelen ten minste 288 sferoïden (overeenkomend met 3 96-well platen) in een 50 ml reactie buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 x g en verwijder de supernatant van methylcellulose met pipetteren voorzichtig.
  2. Was met 1 mL 1x PBS en breng de sferioïden over naar een reactie buis van 1,5 mL. Herhaal de Centrifugeer stap en verwijder de PBS voorzichtig door pipetteren.
  3. Dissociëren van de sferoïden zoals beschreven in stap 3,3.
  4. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 4,2.
  5. Om niet-specifieke binding sites te blokkeren en te voorkomen dat detectie-relevante antilichamen tegen Fcγ-receptoren (CD16, CD32 en CD64) worden gebonden, inbroed de cellen in 100 μL PBS met 2% paarden serum (of serum van een andere diersoort, waarvan de antilichamen niet zullen worden gebruikt in het experiment) en 0,1% BSA gedurende 20 minuten bij 4 °C met rotatie.
  6. In geval van kleuring intracellulaire markers, Fix/permeabilize de cellen zoals beschreven in stap 2.2-2.5.
  7. Inincuberen de cellen met de primaire antilichamen in 100 μL PBS met 2% paarden serum en 0,1% BSA gedurende 30 minuten bij 4 °C met rotatie. Verdun het primaire antilichaam tot 10 μg/mL.
  8. Wassen met 100 μL PBS + 0,1% BSA driemaal, met centrifugeren stappen in de bovenste bank centrifuge bij 1.000 x g daartussenin.
  9. Inincuberen de cellen met de secundaire antilichamen in 100 μL PBS met 2% paarden serum en 0,1% BSA gedurende 30 minuten bij 4 °C met rotatie. Verdun secundair antilichaam tot 10 μg/mL.
  10. Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 4,7.
  11. Analyseer 2,0 x 104 bevlekt cellen in een flow cytometer. Poort voor enkele levende cellen via de FSC-SSC dot plot en analyseer de fluorescentie van de gated cellen op het kanaal dat geschikt is voor de geselecteerde fluorophore.

5. invasie test met heterospheroids

  1. Bereid de spheroid-formatie oplossing voor heterospheroïden, die de verschillende celtypen en bijbehorende mediums bevat, zoals samengevat in tabel 1. De cellen waren eerder met lentivirus met vectoren voor mCherry of GFP expressie.
  2. Vul 100 μL van de spheroid-formatie oplossing in elke put van de plaat en bebroed de plaat in de celkweek incubator voor 24 uur, zodat één spheroid in elke put kan worden gevormd.
  3. Bereid 60 μL gelatineuze matrix mengsel met 2 mg/mL rat tail collageen I, 30% van de commerciële gelifying matrix en 2,5 μg/mL laminin-332 in een 1,5 mL reactie buis. Verdeel 15 μL snel in 3 putjes van de μ-Slide angiogenese kamer. Sluit één spheroid in elke put die al de gel bevat.
  4. Pas indien nodig de locatie van de spheroid snel aan het midden van de put aan met een pipet onder de Microscoop.
  5. Herhaal stap 5.2-5.3 voor de volgende heterospheroids en herhaal opnieuw voor de homospheroïden.
  6. Inculeer de gels in de incubator voor 1 uur om te stollen en de gels vervolgens zachtjes met celkweekmedium te bedekken.
  7. Beeld de sferoïden door fluorescentiemicroscopie in een laser scanning microscoop. Neem verschillende optische dwarsdoorsnede van de spheroid op verschillende optische vlakken van een z-stack en op verschillende tijdstippen van invasie (bijvoorbeeld 0 h, 24 h, 48 h en 72 h).
  8. Analyseer de beelden door het aantal binnenvallende kankercellen te tellen. Binnenvallende cellen zijn degene die de spheroid hebben verlaten en het invasieve gebied binnenkwamen. Het invasieve gebied wordt gedefinieerd als het ring gebied tussen de buitenste en binnenste perimeters die worden gegeven door de verste binnenvallende cel en door de spheroid-grens van de spheroid aan het begin van de invasie-experimenten, respectievelijk, zoals uiteengezet in aanvullende figuur 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De resultaten van dit experimentele ontwerp worden gepubliceerd in Martins Cavaco et al.13, die wordt aanbevolen voor verdere lezing van de conclusies die werden getrokken uit deze experimenten.

Figuur 1, een representatief beeld van een immunofluorescentie-spheroid, toont de immunokleuring van de integrine α3-subeenheid van beide vereeuwigd normale fibroblasten en vereeuwigd CAFS (Figuur 1a), evenals de immunofluorescentie kwantificering (Figuur 1b) en de transcriptionele niveaus van het integrine α3-subeenheid-gen door qPCR (figuur 1c). Dit panel van resultaten toont aan dat integrine α3 is up-gereguleerd in iCAFs, in vergelijking met de normale tegenhanger. Dit bewees dat integrine α3β1 kan worden beschouwd als een marker voor de differentiatie van de fibroblasten van de alvleesklier. Dit werd ook aangetoond door flow cytometrie studies13.

Figure 1
Figuur 1. Expressie van integrine α3 subeenheid door iNFs en iCAFs. De integrine α3-subeenheid is upregulated door icafs, die zijn potentieel als differentiatie marker voor de alvleesklier CAFS weerspiegelt. A) immunofluorescentie kleuring van homospheroïden van normale alvleesklier fibroblasten (INFS) in vergelijking met de Homospheroïden van ICAF vertoont een verhoogd signaal van de integrine α3-subeenheid in de gedifferentieerde cellen. B) het fluorescentie signaal van de cellen in de spheroid werd gekwantificeerd met de Z-stack beelden van de 3D-spheroid, met behulp van de imagej-software. Betekent ± SEM van drie onafhankelijke experimenten worden getoond en vergeleken met t-test (*, p < 0,1). C) de cellen die uit de gedissocieerde spheroïden zijn verkregen, werden geanalyseerd op hun transcriptionele niveaus van de integrine α3-subeenheid. Betekent ± SEM van ΔΔCt-waarden als vouw veranderingen van twee onafhankelijke experimenten worden getoond en vergeleken met t-test. Hoewel het niet bereiken van significantieniveau van 0,1, de transcriptionele niveaus van integrine α3-codering mRNA zijn hoger in iCAFs dan in iNFs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Heterospheroids
Type cellen (passage tot 25) Aantal cellen Medium (1 deel Hydroxypropyl methylcellulose +...)
mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-I 400 CAF + 400 pancreaskanker cellen 1,5 delen cel MEM met 10% FBS en 1% pen/STREP + 1,5 delen van RPMI met 10% FBS en 1% pen/Strep
mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I
mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I 1,5 delen cel MEM met 10% FBS en 1% pen/STREP + 1,5 delen van DMEM met 10% FBS en 1% pen/Strep
mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-PANC-I
Homospheroïden
Celtype (passage tot 25) Aantal cellen Medium (1 deel Hydroxypropyl methylcellulose +...)
mCherry-iCAFs 400 cellen 3 delen MEM aangevuld met 10% FBS en 1% pen/Strep
mCherry-α3KO-iCAFs
GFP-AsPC-I 3 delen RPMI met 10% FBS en 1% pen/Strep
GFP-PANC-I 3 delen DMEM met 10% FBS en 1% pen/Strep

Tabel 1. Celsamenstelling van hetero-en homospheroïden. Het aantal cellen dat nodig is om de hetero-en homo sferoïden samen te stellen, evenals het corresponderende medium dat moet worden gebruikt voor de oplossing van de spheroid-formatie, wordt samengevat in de volgende tabel.

Aanvullend figuur 1. Sequentiële stappen voor de kwantificering van de immunofluorescentie kleuring van een eiwit van belang in spheroids, met behulp van ImageJ. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Sequentiële stappen voor de kwantificering van het aantal binnenvallende kankercellen in de invasie test, met behulp van ImageJ. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het ontwikkelen van een geschikt in vitro model om CAF-differentiatie te bestuderen is een uitdagende taak. Na het gebruik van verschillende benaderingen concludeerden we dat een 3D-spheroid-model het praktischer, fysiologisch en klinisch relevant model is, waarin het samenspel tussen pancreas carcinoom cellen met vereeuwigd CAFs kan worden bestudeerd. Dit model voorkwam spontane differentiatie van fibroblasten, als gevolg van artefeitelijke stressoren zoals de stijfheid van de celcultuur kunststof, althans in korte-termijn cultuuromstandigheden (tot 48 uur). Hoewel de precieze stijfheid van de in deze onderzoeken gebruikte spheroid niet werd gemeten, evalueerde Ito et al. de stijfheid van humane navelstreng endotheliale cellen en mesenchymale stamcel heterospheroïden met behulp van een robot geïntegreerde microfluïdische chip22. De gemiddelde stijfheid-index van de heterospheroïden werd gemeten 1 en 3 dagen na de assemblage. De grootte van de sferoïden was anders, de MSC leek hun aggregatie capaciteit te verhogen, wat resulteerde in een afname van de grootte na verloop van tijd (van 135,5 μm tot 99,8 μm)21,22. Bijgevolg steeg de stijfheid van de spheroid ook van 5,0 x 10-3 tot 7,5 x 10-3 pa22. De stijfheid van de sferoïden, bestaande uit een heterotypische populatie van CAFS en ASPC-I, kan echter mechanische eigenschappen en stijfheidswaarden bezitten die verschillen van die van de homo-spheroïden uit één populatie fibroblasten/CAFS. Dit is nog onbekend en kan afwijken van wat werd beschreven door Ito et al22. De stijfheid hangt ook af van de hoeveelheid en de kruiskoppeling van de door de cel geproduceerde en gestorte ecu, over de verschillende celcelinteracties binnen de spheroid, over het aantal cellen binnen de spheroid of over de duur van de cultuur.

Net als elk ander model omvat het experimentele ontwerp een aantal variabelen die moeten worden geoptimaliseerd, zoals het aantal cellen dat nodig is om de spheroids, de tijdpunten van de behandeling en microscopische beeldvorming te vormen. Het beschreven experimentele ontwerp werd geoptimaliseerd met als doel het hebben van een spheroid-grootte, die minimale invloed zou hebben in de diffusie van nutriënten en zuurstof, omdat er een diffusie limiet is als gevolg van massatransport beperkingen9. Bijvoorbeeld, het transport van zuurstof in sferoïden met een grootte groter dan 150-200 μm wordt significant aangetast, evenals de diffusie van glucose en lactaat, in aggregaten groter dan 300 μm9,18. Spheroids met diameters groter dan 400-500 μm presenteren gewoonlijk een concentrisch gelaagde structuur die bestaat uit een necrotische kern, omringd door een levensvatbare laag van trillende cellen en een buitenste rand van prolifererende cellen9,24. Om de beperkte diffusie van verbindingen te voorkomen en om het probleem van de ontoegankelijke spheroid-kern te elimineren, werden cellen behandeld met TGF-β1, BM2 en lebein-1 voorafgaand aan spheroid-vorming, wanneer de cellen individueel worden opgehangen in de spheroid-formatie oplossing. Bovendien, om de beschikbaarheid van zuurstof en voedingsstoffen aan de meeste cellen in de spheroid toe te staan en om de vorming van een necrotische kern te voorkomen, werd het aantal cellen per spheroid verlaagd tot 750-1000 cellen, die spheroïden vormen met een diameter van 140-200 μm.

Het is belangrijk om de verschillende celtypen grondig te mengen in de spheroid-vormings oplossing, zodat de sferoïden met ongeveer hetzelfde aantal cellen worden samengesteld, waardoor significante verschillen in grootte tussen de sferoïden worden vermeden. Toch kunnen sommige sferioïden iets groter zijn dan de andere en dat zal resulteren in meer Z-stapels verworven in de Microscoop. Sommige sferoïden kunnen ook afwijken van de perfect sferische vorm, maar dit wordt ook in aanmerking genomen wanneer de ROI van de spheroid wordt afgebakend. Deze verschillen in grootte en vorm worden verwerkt in de genormaliseerde kwantificerings waarden zoals uitgelegd in de volgende alinea. Een andere belangrijke factor met betrekking tot de vorm van de spheroid is het celtype. Bijvoorbeeld, fibroblasten en CAFS vormen spheroïden met een bijna bolvormige vorm, terwijl ASPC-i en panc-i cellen een meer verspreiden aggregaat van cellen vormen.

Voor de beeldvorming van de sferoïden kunnen cryosecties van vaste sferoïden ook worden gebruikt, maar de integriteit van de spheroid kan worden aangetast bij het snijden, afhankelijk van het celtype en het immunokleurings protocol. Als alternatief bleek de kleuring van de hele spheroid in zijn 3D-structuur een eenvoudigere optie te zijn. Het verwerven van microscopische Z-gestapelde foto's van de spheroid als een 3D-structuur duurt gemiddeld 5-15 min per spheroid.

De immunofluorescentie signalen in beelden van sferoïden zijn moeilijk te kwantificeren als ze vlakken van 3D-structuren vertegenwoordigen. De gebruikte methode was gebaseerd op een eerder beschreven, waarbij de auteurs geëxtreerd en beschouwd als de spheroid een cel14. Op deze manier wordt het fluorescentie signaal gecorrigeerd met behulp van vergelijking 1.

Als achtergrond werd de geïntegreerde signaal dichtheid van een cel-vrij interessegebied (ROI) bepaald. De gemeten geïntegreerde signaal dichtheid is de som van de intensiteitswaarden van de pixels binnen de geselecteerde ROI. Omdat sferoïden 3D-structuren zijn, worden confocale beelden van verschillende stapels verworven. Om dergelijke beelden te verwerken, kan men het fluorescerende signaal in elke stapel afzonderlijk meten of de som van alle stapels in een Z-projectie gebruiken. Alle risicokwantificeringen kunnen worden uitgevoerd met imagej. De totale gecorrigeerde fluorescentie (TCF) van de sferoïden wordt bepaald als de genormaliseerde TCCF, gezien het gebied van spheroid en het aantal stapels, met behulp van vergelijking 2. Dit is goed voor de verschillende grootten van sferoïden en het verschil in de bolvormige vorm. Het analyseren van de immunofluorescentie kleuring van de sferoïden met behulp van deze methode kan tot 5 minuten per spheroid duren.

Evenzo kan de invasie van cellen van sferoïden in de omringende stromale matrix worden geanalyseerd door verschillende algoritmen. Een eenvoudige methode werd eerder beschreven door Nowicki et al, waarin de invasieve kankercellen werden geteld23. Om de invasieve cellen te discrimineren van degenen die niet binnenvallen, is het belangrijk om een ruimtelijke grens vast te stellen waarboven de cellen geacht worden de spheroid-structuur te hebben verlaten. Daarom is het uitgangspunt de limiet die overeenkomt met de omtrek van de spheroid-beelden die op het eerste tijdstip (tijd 0) zijn verworven, toen de sferoïden in de gel werden ingebed. De cel die de gel het verst binnendringt wordt beschouwd als de maximale afstand die een invasieve cel kan bereiken, en dus definieert hij de buitenste rand van het invasie gebied. Deze methode telt de invasieve kankercellen die aanwezig zijn in het binnenvallende gebied, met behulp van de teltool van ImageJ, en de ROI overeenkomend met de spheroid op tijd 0 h wordt toegevoegd aan de ROI Manager en vervolgens getransponeerd naar het beeld van dezelfde specifieke spheroid verworven 48 h of 72 h later. Om deze reden is het belangrijk dat de spheroid zo dicht mogelijk bij het midden van de vlakken blijft, tijdens de verschillende tijden van overname. Het tellen van het aantal cellen kan tot 5 min per spheroid duren.

Een andere belangrijke overweging is het onderscheiden van de verschillende celtypen in de heterospheroid. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van levende cel fluorescerende kleurstoffen, die problematisch kunnen zijn wanneer het celtype een hoge celdelings snelheid heeft of als het experiment voor langere tijd moet worden uitgevoerd. De robuustere en betrouwbaardere manier om de twee verschillende populaties te onderscheiden is het ontwikkelen van cellijnen die fluorescerende eiwitten zoals mCherry en GFP uitdrukken. De levering van de expressie vectoren kan worden uitgevoerd met behulp van lentivirus, wat resulteert in een stabiele uitdrukking van deze eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict. Dit materiaal weerspiegelt alleen de standpunten van de auteur en de Europese Unie is niet aansprakelijk voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de daarin vervatte informatie.

Acknowledgments

We erkennen de hulp van Barbara Schedding bij het voorbereiden van de BM2 en lebein-1. We erkennen Àgnes Noel voor het delen van haar expertise in spheroid-assays. We danken Sonja Schelhaas en Michael Schäfers voor hun hulp bij het hanteren van linvirale transfectie onder S2-condities. We erkennen Sabine von Rüden's assistentie in het bereiden van CAFs van pancreaskanker weefsel.

Het onderzoek dat tot deze resultaten leidt, heeft financiering ontvangen van het people-programma (Marie Curie-acties) van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie KP7/2007-2013/onder de REA subsidieovereenkomst n ◦ (316610) tot en met J.A.E. Bovendien werd J.A.E. en A.C.M.C. financieel gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen de cellen-in-Motion cluster of Excellence (EXC 1003-CiM). Dit project werd ook gesteund door Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) SIGMA-ALDRICH D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
Acetone SIGMA-ALDRICH 32201
Albumin Fraction V - BSA AppliChem A1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse Invitrogen A11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit Invitrogen A11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) Santa Cruz sc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 Millipore AB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) SIGMA-ALDRICH C6198
AsPC-1 cell line ATCC Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifuge Fisher Scientific 50-589-620 Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2) Fluka 21074
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mL Corning 430290
Collagenase B Roche 11088831001
Collagen-I, rat tail Gibco A10483-01
Confocal microscope Zeiss LSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L) Lonza BE12-604F
Dnase I Roche 10104159001
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCaliburTM
Gelifying matrix ThermoFisher Scientific A1413202 Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotype DAKO X 0907
Horse Serum SIGMA-ALDRICH 12449-C
Human Primary Pancreatic Fibroblasts PELOBiotech PB-H-6201
Incubator Heraeus B6060
Laminin-332 Biolamina LN332
MEM SIGMA-ALDRICH M4655
Microplate, 96 wells, U-bottom Greiner Bio-One 650101
Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Mouse IgG, isotype SIGMA-ALDRICH I8765
Multi axle rotating mixer CAT RM5 80V
PANC-I ATCC Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
Paraformaldehyde Riedel-de Haën 16005
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
QuantiTect Reverse Transcription Kit Qiagen 205310
Rat IgG, isotype Invitrogen 10700
Reaction tubes, 1.5 mL Greiner Bio-One 616201
Real-time PCR cycler Qiagen Rotor-Gene Q
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074
RPMI Lonza BE12-702F Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100 SIGMA-ALDRICH X100RS
Vórtex Scientific Industries Vortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoated Ibidi 81501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

Tags

Kankeronderzoek afgifte 150 spheroids CAF 3D-model differentiatie immunofluorescentie kleuring qPCR flow cytometrie invasie extracellulaire matrix gel
Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D… More

Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (150), e60122, doi:10.3791/60122 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter