Summary
O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.
Abstract
Definir o modelo ideal para um estudo in vitro é essencial, principalmente se estudar processos fisiológicos como a diferenciação de células. No estroma do tumor, os fibroblastos do anfitrião são estimulados por pilhas de cancro para diferenciar-se. Assim, adquirem um phenotype que contribua ao microambiente do tumor e apoie a progressão do tumor. Ao usar o modelo esferóide, foi criado um sistema modelo in vitro 3D, no qual analisamos o papel do laminin-332 e sua integrina receptor α3β1 nesse processo de diferenciação. Este sistema do modelo do esferóide reproduz não somente as condições do microambiente do tumor em uma maneira mais exata, mas igualmente é um modelo muito versátil desde que permite estudos a jusante diferentes, tais como a mancha imunofluorescente de ambos intra e extracelular marcadores, bem como as proteínas da matriz extracelular depositadas. Além disso, análises transcricional por qPCR, citometria de fluxo e invasão celular podem ser estudadas com este modelo. Aqui, nós descrevemos um protocolo de um modelo do esferóide para avaliar o papel do integrina α3β1 de CAFS e seu ligand ectopicamente depositado, laminin-332, na diferenciação e em suportar a invasão de pilhas de cancro pancreatic.
Introduction
O microambiente tumoral é um nicho muito complexo e extremamente importante para a manutenção e progressão das células tumorais1. É formado não só pelas células cancerosas, mas também por fibroblastos stromal. As pilhas do tumor são cercadas por um estroma que seja específico e diferente do estroma de tecidos normais2. Laminin-332 é uma proteína da matriz extracelular expressada ectopicamente no estroma de tumores diferentes, como do adenocarcinoma pancreatic3. Além disso, a composição bioquímica do ECM e também suas propriedades biofísicas, como rigidez e tensão, mudam dentro do volume tumoral4. Este estroma do tumor, ou "estroma reactivo", é causado por uma adaptação dos fibroblasto às pilhas de cancro vizinhas e pelo recrutamento de outros jogadores muito importantes que desenvolvem um ambiente favorável e de suporte para a progressão do tumor. A diferenciação de fibroblasto stromal conduz aos fibroblastos Cancer-associados (CAF). Essas células podem ser identificadas por meio de diferentes marcadores como α-actina de músculo liso (αSMA)5 ou antígeno neural/glial 2 (NG2)6.
O modelo in vitro mais adequado para recapitular o microambiente tumoral (TME) com CAFS é difícil de selecionar. O método para imitar parâmetros fisiológicos do TME de forma rentável e reprodutível deve ser considerado para tal sistema modelo. Dentro do TME, diferentes processos, como a proliferação, diferenciação, migração e invasão dos diferentes tipos de células ocorrem. Estes processos celulares podem ser realizados individualmente com diferentes métodos. No entanto, as condições experimentais devem considerar as interações celulares com a ECM do estroma tumoral, uma vez que a rigidez do substrato influencia o processo de diferenciação da CAF. R.G. Wells comentou sobre o impacto da rigidez matricial no comportamento celular e destacou que a organização citoesquelética e o status de diferenciação observados em células cultivadas in vitro podem ser artefactos7. Diferentes estímulos parecem estar envolvidos na diferenciação do Caf, incluindo a tensão mecânica5,7. Para evitar isso, substratos macios 2D podem ser possíveis abordagens para estudos de diferenciação, pois contorna o problema do plástico de prato de cultura rígida. Uma superfície 2D macia, em que os fibroblastos podem ser crescidos, pode ser colagénio-eu revestido géis do poliacrilamida, por meio de que a rigidez do gel pode ser manipulada pela concentração de poliacrilamida e pelo cross-linker do gel. A adesão e a formação de fibras de estresse ricas em αSMA são aprimoradas em fibroblastos, juntamente com a rigidez do gel8. Estes resultados salientam a importância dos andaimes de substrato macio para modelos de diferenciação in vitro mais fisiológicos. Entretanto, em nossas mãos a reprodutibilidade experimental e a imagem latente destes géis eram desafiantes. Para superar essas deficiências, mudamos o sistema de substrato 2D macio para um modelo de esferóide 3D para estudos de diferenciação e invasão. Este modelo é mais clinicamente relevante e, semelhante a um organoide in vitro, recapitula interações celulares in vivo, produção e deposição de ECM, bem como o comportamento celular9.
Spheroids são formados quando as células não têm um substrato para aderir. Quando as células são deixadas sem uma superfície adesiva, elas agregam para formar uma estrutura mais ou menos esférica. Se os esferoides são compor de um tipo de pilha, são chamados homospheroids; se compor de dois ou mais tipos diferentes da pilha formam heterospheroids.
Entre os diferentes métodos para a preparação do esferóide, realizamos o protocolo usando placas de fundo redondo não aderentes 96-well. É muito eficaz em relação aos custos. Aqui, nós produzimos ambos os homospheroids dos fibroblasto, CAF ou CAFs que faltam a subunidade do integrina α3 para examinar o processo da diferenciação e heterospheroids de CAFs ou de integrina α3 KO CAFs e pilhas pancreatic da carcinoma do duto (AsPC-I e PANC-I) para estudar a invasão na matriz circundante.
O alvo para estes estudos era usar CAFs preliminar isolados das biópsias pancreatic humanas da carcinoma. No entanto, as biópsias para obter as células são escassas e, por essa razão, os CAFs utilizados nestes estudos foram imortalizados usando Lentivirus contendo HTERT. Eles são chamados de iCAFs, e suas contrapartes normais, fibroblastos pancreáticos primários humanos, são denominados iNFs. Os fibroblasto pancreatic humanos e as pilhas pancreatic da carcinoma do duto, AsPC-I e PANC-I, estão disponíveis comercialmente.
Este protocolo foi utilizado para estudar o efeito da interação laminina-332-integrina no processo de diferenciação da CAF. Para comprovar a especificidade dessa interação e sua função, foram utilizados compostos inibidores: BM2, um anticorpo monoclonal que bloqueia o local de ligação da integrina a cadeia10de laminina-332 α3, ou lebein 1, um composto derivado de veneno de cobra que bloqueia a integrinas de ligação à laminina α3β1, α6β1 e α7β111,12.
Para o ensaio da invasão, as pilhas tinham sido transacidas com o Lentivirus que contem o cDNA que codifica mCherry (iCAFs e integrina α3 KO iCAFs) ou GFP (AsPC-I e PANC-I) para distinguir os tipos diferentes da pilha nos heterospheroids. A transdução das células para imortalizá-las e/ou rotulá-las com a expressão de proteína fluorescente (mCherry e GFP) é descrita em um estudo prévio13, que deve ser consultado para obter mais informações.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. esferoides 3D como um modelo in vitro para a diferenciação de fibroblast/CAF usando diferentes compostos inibidores de TGF-β1 da interação célula-matriz
- Misture 1 parte de solução de metilcelulose de 6 mg/mL e 3 partes de meios de cultura celular, MEM suplementado com 1% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina para obter a solução de formação de esferóide.
- Ressuscitou os fibroblastos normais imortalizados recentemente descongelados (iNFs), o CAF imortalizado (iCAFs) ou a integrina α3β1 KO iCAF (passagem até 25) na solução de formação de esferóides. Se preparando 1 96 placa de poço, prepare um excesso de solução de formação de esferóide, 10 mL e adicione 75.000 células, tendo em mente que cada esferóide é composto por 750 células, e que 100 μL são distribuídos por cada poço da placa.
- Se as citocinas ou os inibidores da integrina forem incluídos no estudo, adicione estes compostos à suspensão celular, a fim de incorporá-los nos esferóides durante a sua formação. Note-se que as iNFs são estimuladas com 10 ng/mL de TGF-β1, a fim de desencadear a diferenciação. Se for caso disso, adicionar compostos inibidores juntamente com TGF-β1, tais como 20 μg/mL BM2 ou 10 μg/mL de lebein 1.
- Prepare os homospheroídeos da CAF da mesma maneira, mas sem o estímulo TGF-β1, já que eles são diferenciados. Prepare o integrina α3 KO CAF homospheroids sem a adição de qualquer composto.
- Distribua a solução da formação do esferóide em uma placa do multi-poço do fundo redondo 96 adicionando 100 μl da solução em cada poço. Toda vez que a solução esferóide é distribuída nos poços, misture bem pipetando para cima e para baixo, várias vezes.
- Coloc a placa na incubadora da cultura da pilha para 24 h para permitir que um esferóide seja dado forma em cada poço.
- Colete os esferóides após cerca de 24 h e use-os para diferentes finalidades a jusante: coloração imunofluorescente, tempo real (RT) q-PCR e citometria de fluxo. Para detectar a expressão de antígenos intra e extracelulares, incluindo a deposição de proteínas de ECM dentro do esferóide, use coloração imunofluorescente. Após a desintegração de esferoides em únicas pilhas, quantifique o receptor membrana-ancorado pelo fluxo cytometry. Para detectar a ativação do gene e as mudanças transcricional, use o RT q-PCR do mRNA isolado das pilhas do esferóide.
2. coloração imunofluorescente de esferóides
- Colete os esferóides após cerca de 24 h em um tubo de reação de 1,5 mL por condição experimental ou por proteína a ser analisado. Por exemplo, coloque os esferóides de iNFs estimulados com TGF-β1 em um tubo diferente das iNFs de controle, que não foram tratadas. Para evitar a ruptura de esferóides devido a forças de cisalhamento muito fortes, corte a extremidade da ponta da pipeta para ampliar o orifício. Inclua pelo menos 5-10 esferóides em um tubo de reação, para permitir réplicas e levar em conta as possíveis perdas durante as etapas de lavagem.
- Centrifugue os esferóides com uma centrífuga de bancada para cerca de 30-60 s em 1.000 x g. Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem, sem perturbar os esferóides peletizados.
- Lave com 50 μL de 1X PBS. Repita a etapa de centrifugação e Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem, conforme descrito em 2,2.
- Dependendo da proteína a ser manchada, fixar com 50 μL de paraformaldeído 4% em PBS por 20 minutos à temperatura ambiente (para αSMA, NG2 e integrina α3β1) ou com 50 μL de metanol por 10 min a-20 ° c (para laminina-332 subunidades).
- Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3.
- Permeabilize as células com 0,1% Triton-X em PBS por 4 min à temperatura ambiente.
- Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
- Incubar os esferóides em PBS contendo 5% de FBS e 2% de BSA, por 1 h em RT para bloquear sítios de interação protéico não específicos.
- Incubar os esferóides com 30 μL de anticorpos primários em PBS, 2,5% FBS e 1% BSA a 4 ° c durante a noite. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anti-αSMA CY-3 conjugados e NG2 a 5 μg/mL; BM2 anti-laminina α3, 6F12 anti-laminina β3 e anti-laminina γ 2 20 μg/mL.
- Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
- Incubar os esferóides com 30 μL de anticorpos secundários em PBS, 2,5% FBS e 1% BSA em RT por 90 min. Os seguintes anticorpos secundários utilizados foram: Alexa 488 anti-coelho e anti-rato (5 μg/mL).
- Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
- Incubar as células com 30 μL de solução de coloração DAPI durante 4 min à temperatura ambiente.
- Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3.
- Coloc os esferoides em uma corrediça de vidro, em uma gota de PBS, usando um Pipet de vidro de Pasteur.
- Imagem os esferoides pela microscopia de fluorescência em um microscópio da exploração do laser usando uma ampliação de 10x. Tome a seção transversal ótica diferente do esferóide em planos óticos diferentes de uma z-pilha (15-20 planos da pilha). Para estabelecer os ajustes do laser no microscópio, use um esferóide compor das pilhas negativas para o antígeno do interesse ou um esferóide manchado somente com o anticorpo secundário. Reutilizar as mesmas configurações para todas as amostras que serão comparadas.
- Analise as imagens microscópicas com o software ImageJ como publicado anteriormente14. As etapas são resumidas na Figura 1 suplementar. Como pano de fundo, determine a densidade de sinal integrada de uma região de interesse (ROI) livre de células. Calcule a fluorescência total corrigida da célula (TCCF) como:
- Determine a fluorescência total corrigida (TCF) dos esferóides como o TCCF normalizado para a área de esferóide e o número de pilhas.
3. RT q-PCR de homospheroids
- Para executar RT-qPCR, colete pelo menos 288 esferóides (correspondendo a placas 3 96-well) em um tubo de reação de 50 mL. Centrifugue por 5 min a 1.000 x g e Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem sem perturbar os esferóides peletizados.
- Lave com 1 mL de 1X PBS e transfira os esferóides para um tubo de reacção de 1,5 mL. Centrifugue os esferóides com uma centrífuga de bancada para cerca de 30-60 s em 1.000 x g. Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem, sem perturbar os esferóides peletizados.
- Dissociar os esferóides com 250 μL de 4 mg/mL de colagenase B, 50 μg/mL DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2 em PBS a 37 ° c por cerca de 30-45 min, suavemente vortexing e pulsando intermitentemente por alguns segundos a cada 5 min.
- Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 3,2.
- Isole o RNA total das células de esferóides desintegrados usando um kit de isolamento de RNA comercial, de acordo com as instruções dos fabricantes.
- Reverter transcrito o mRNA isolado em cDNA com um kit comercial, de acordo com as instruções dos fabricantes.
- Quantificar os níveis de transcrição em repetições por PCR em tempo real. Os primers utilizados foram: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, Rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′15; Corrente laminin α3: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 Chain: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2 Chain: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; integrina α3 subunit: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' Rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
- Corrija os valores de CT para o CT-valor de um gene de referência endógeno como TOP-1 usando a equação: 2-δδct. ΔΔCt = ΔCt (amostra-alvo) – ΔCt (amostra de referência) e ΔCt = TC do gene alvo ou gene de referência – TOP-I.
4. análise da citometria de fluxo da expressão da integrina
- Para análise citométrica de fluxo, colete pelo menos 288 esferoides (correspondendo a placas 3 96-well) em um tubo de reação de 50 mL. Centrifugue por 5 min a 1.000 x g e Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem.
- Lave com 1 mL de 1X PBS e transfira os esferóides para um tubo de reacção de 1,5 mL. Repita a etapa de centrifugação e Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem.
- Dissociar os esferoides conforme descrito na etapa 3,3.
- Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 4,2.
- Para bloquear sítios de ligação não específicos e impedir a ligação de anticorpos relevantes para a detecção aos receptores Fcγ (CD16, CD32 e CD64), incubar as células em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo (ou soro de outra espécie animal, os anticorpos dos quais não serão utilizado no experimento) e 0,1% BSA por 20 min a 4 ° c com rotação.
- Em caso de coloração de marcadores intracelulares, fixar/permeabilizar as células conforme descrito na etapa 2.2-2.5.
- Incubar as células com os anticorpos primários em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo e 0,1% de BSA por 30 min a 4 ° c com rotação. Diluir o anticorpo primário para 10 μg/mL.
- Lave com 100 μL de PBS + 0,1% de BSA três vezes, com etapas da centrifugação no centrifugador superior do banco em 1.000 x g no meio.
- Incubar as células com os anticorpos secundários em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo e 0,1% de BSA por 30 min a 4 ° c com rotação. Diluir o anticorpo secundário para 10 μg/mL.
- Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 4,7.
- Analise 2,0 x 104 células manchadas em um citometro de fluxo. Portão para células únicas ao vivo através do gráfico de pontos FSC-SSC e analisar a fluorescência das células fechadas no canal apropriado para o fluoróforo selecionado.
5. ensaio de invasão usando heterospheroids
- Prepare a solução de formação de esferóides para heteroesferoides, contendo os diferentes tipos de células e médiuns correspondentes, como resumidos na tabela 1. As pilhas tinham sido transadas previamente com o Lentivirus que contem vetores para a expressão de mCherry ou de GFP.
- Encha 100 μL da solução de formação de esferóide em cada poço da placa e incubar a placa na incubadora da cultura celular por 24 h para permitir que um esferóide seja formado em cada poço.
- Preparar 60 μL de mistura de matriz gelatinosa contendo 2 mg/mL de colágeno de cauda de rato I, 30% de matriz de gelifying comercial e 2,5 μg/mL de laminina-332 num tubo de reacção de 1,5 mL. Distribua rapidamente 15 μL em 3 poços da câmara de angiogênese μ-slide. Incorpore um esferóide em cada poço que contem já o gel.
- Se necessário, ajuste ràpida a posição do esferóide ao centro do poço com uma pipeta o microscópio.
- Repita as etapas 5.2-5.3 para os heterospheroids seguintes e repita-os outra vez para os homospheroids.
- Incubar os géis na incubadora por 1 h para solidificar e, em seguida, sobrepor suavemente os géis com meio de cultura celular.
- Imagem os esferoides pela microscopia de fluorescência em um microscópio da exploração do laser. Tome a seção transversal ótica diferente do esferóide em planos óticos diferentes de uma z-pilha e em pontos diferentes do tempo da invasão (por exemplo, 0 h, 24 h, 48 h e 72 h).
- Analise as imagens contando o número de células cancerosas invasoras. As células invasoras são aquelas que deixaram o esferóide e entraram na área invasiva. A área invasiva é definida como a área do anel entre os perímetros externos e internos administrados pela célula invadida mais afastada e pela borda esferóide do esferóide no início dos experimentos de invasão, respectivamente, conforme descrito na Figura 2 suplementar .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os resultados deste delineamento experimental são publicados em Martins cavaco et al.13, o que é recomendado para posterior leitura das conclusões extraídas desses experimentos.
A Figura 1, uma imagem representativa de um esferóide imunofluorescente, mostra a imunocoloração da subunidade de integrina α3 de fibroblastos imortalizados normais e de CAFS imortalizados (Figura 1a), bem como a imunofluorescência quantificação (Figura 1b) e os níveis transcricional do gene da subunidade da integrina α3 por qPCR (Figura 1C). Este painel de resultados demonstra que a integrina α3 é regulada em iCAFs, em comparação com a contraparte normal. Isto provou que o integrina α3β1 pode ser considerado um marcador para a diferenciação pancreatic dos fibroblastos. Isso também foi demonstrado por estudos de citometria de fluxo13.
Figura 1. Expressão da subunidade de integrina α3 por iNFs e iCAFs. A subunidade de integrina α3 é upregulada por iCAFs, refletindo seu potencial como um marcador de diferenciação para CAFs pancreáticos. (A) a coloração imunofluorescente de homospheroids de fibroblastos pancreáticos normais (INFs) em comparação com os Homospheroídeos do ICAF mostra um sinal aumentado da subunidade de integrina α3 nas células diferenciadas. (B) o sinal de fluorescência das células do esferóide foi quantificado com as imagens da pilha Z do esferóide 3D, utilizando o software ImageJ. Médias ± SEM de três experimentos independentes são mostrados e comparados pelo teste t (*, p < 0,1). (C) as células obtidas dos esferóides dissociados foram analisadas quanto aos níveis transcricional da subunidade α3 da integrina. Médias ± SEM de ΔΔCt-valores como alterações de dobra de dois experimentos independentes são mostrados e comparados pelo teste t. Apesar de não atingir o nível de significância de 0,1, os níveis transcricional da integrina α3-Encoding mRNA são mais elevados em iCAFs do que em iNFs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Heterospheroids | ||
| Tipo de células (passagem até 25) | Número de células | Médio (1 parte de metilcelulose +...) |
| mCherry-iCAFs + GFP-AsPC-I | 400 CAF + 400 células cancerosas pancreáticas | 1,5 partes de célula MEM com 10% de FBS e 1% de caneta/Strep + 1,5 partes de RPMI com 10% de FBS e 1% de caneta/Strep |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-AsPC-I | ||
| mCherry-iCAFs + GFP-PANC-I | 1,5 partes de célula MEM com 10% de FBS e 1% de caneta/Strep + 1,5 partes de DMEM com 10% de FBS e 1% de caneta/Strep | |
| mCherry-α3KO-iCAFs + GFP-PANC-I | ||
| Homesheroídeos | ||
| Tipo de célula (passagem até 25) | Número de células | Médio (1 parte de metilcelulose +...) |
| mCherry-iCAFs | 400 células | 3 partes MEM suplementadas com 10% de FBS e 1% de caneta/Strep |
| mCherry-α3KO-iCAFs | ||
| GFP-AsPC-I | 3 partes de RPMI com 10% de FBS e de 1% de pena/Strep | |
| GFP-PANC-I | 3 partes DMEM com 10% de FBS e 1% de pena/Strep | |
Tabela 1. Composição celular de hetero-e homospheroids. O número de pilhas necessárias para montar o hetero-e homospheroids assim como o meio correspondente que deve ser usado para a solução da formação do esferóide é sumariado na seguinte tabela.
Complementar Figura 1. Etapas seqüenciais para a quantificação da mancha imunofluorescente de uma proteína do interesse em spheroids, usando ImageJ. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Complementar Figura 2. Etapas sequenciais para quantificação do número de células cancerosas invasoras no ensaio de invasão, usando ImageJ. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Desenvolver um modelo in vitro adequado para estudar a diferenciação da CAF é uma tarefa desafiadora. Após o emprego de diferentes abordagens, concluímos que um modelo esferóide 3D é o modelo mais prático, fisiológico e clinicamente relevante, no qual a interação entre células de carcinoma pancreática com CAFs imortalizados pode ser estudada. Este modelo impediu a diferenciação espontânea dos fibroblasto, devido aos estressores artefatual tais como a rigidez do plástico da cultura da pilha, pelo menos em condições de cultura a curto prazo (até 48 h). Embora a rigidez exata do esferóide utilizado nesses estudos não tenha sido mensurada, Ito et al. avaliaram a rigidez das células endoteliais da veia umbilical humana e heterospheroides mesenquimais da célula-tronco usando um chip microfluídico integrado de robô22. A rigidez-índice médio dos heterospheroids foi medido 1 e 3 dias após a montagem. O tamanho dos esferóides foi diferente, o MSC pareceu aumentar sua capacidade de agregação, o que resultou em uma diminuição do tamanho ao longo do tempo (de 135,5 μm para 99,8 μm)21,22. Consequentemente, a rigidez do esferóide também aumentou de 5,0 x 10-3 para 7,5 x 10-3 PA22. No entanto, a rigidez dos esferóides compostos de uma população heterotípica de CAFs e AsPC-I pode possuir propriedades mecânicas e valores de rigidez diferentes dos de homospheroídeos feitos de uma única população de fibroblastos/CAFs. Isso ainda é desconhecido e pode ser diferente do que foi descrito por Ito et al.22. A rigidez também depende da quantidade e do cross-linkage da ECM produzida por células e depositada, nas diferentes interações célula-célula dentro do esferóide, no número de células dentro do esferóide ou na duração da cultura.
Como qualquer outro modelo, o experimento envolve algumas variáveis que necessitam de otimização, como o número de células necessárias para formar os esferóides, os pontos temporais de tratamento e a imagem microscópica. O delineamento experimental descrito foi otimizado com o objetivo de ter um tamanho esferóide, o que teria influência mínima na difusão de nutrientes e oxigênio, pois há um limite de difusão devido às limitações de transporte de massa9. Por exemplo, o transporte de oxigênio em esferóides com um tamanho maior que 150-200 μm é significativamente afetado, bem como a difusão de glicose e lactato, em agregados maiores que 300 μm9,18. Os esferóides com diâmetros maiores que 400-500 μm geralmente apresentam uma estrutura em camadas concentrricamente constituída por um núcleo necrótico cercado por uma camada viável de células quiescentes e uma borda externa de células proliferantes9,24. Para evitar a difusão limitada de compostos, e para eliminar o problema do núcleo esferóide inacessível, as pilhas foram tratadas com TGF-β1, BM2 e lebein-1 antes da formação do esferóide, quando as pilhas são suspendidas individualmente na solução da formação do esferóide. Além disso, para permitir a disponibilidade de oxigênio e nutrientes para a maioria das células do esferóide e para evitar a formação de um núcleo necrótico, o número de células por esferóide foi reduzido para 750-1000 células, que formam esferóides com um diâmetro de 140-200 μm.
É importante misturar completamente os tipos diferentes da pilha na solução da formação do esferóide, assim que os esferoides são compor por aproximadamente o mesmo número de pilhas, evitando diferenças significativas do tamanho entre os esferoides. Não obstante, às vezes alguns esferoides podem ser ligeiramente maiores do que o outro e aquele conduzirá a mais Z-pilhas adquiridas no microscópio. Alguns esferóides também podem desviar-se da forma perfeitamente esférica, mas isso também é tomado em conta quando o ROI do esferóide é delineado. Essas diferenças de tamanho e forma são contabilizadas nos valores de quantificação normalizados, conforme explicado no próximo parágrafo. Outro fator importante em relação à forma do esferóide é o tipo de célula. Por exemplo, os fibroblastos e os CAFs formam esferóides com uma forma quase esférica, enquanto as células AsPC-I e PANC-I formam um agregado mais disperso de células.
Para a imagem os esferoides, Cryosections de esferoides fixos podem igualmente ser usados, porém a integridade do esferóide pode ser comprometida em cima do seccionamento, dependendo do tipo da pilha e do protocolo da imunocoloração. Alternativamente, a coloração de todo o esferóide em sua estrutura 3D, provou ser uma opção mais simples. Adquirindo imagens microscópicas Z-empilhadas do esferóide como uma estrutura 3D leva em média 5-15 min por esferóide.
Os sinais imunofluorescentes em imagens de esferóides são difíceis de quantificar à medida que representam planos de estruturas 3D. O método utilizado foi baseado em um descrito anteriormente, onde os autores extrapolaram e consideraram o esferóide como uma célula14. Desta forma, o sinal de fluorescência é corrigido usando a equação 1.
Como pano de fundo, determinou-se a densidade de sinal integrada de uma região de interesse (ROI) livre de células. A densidade de sinal integrada medida é a soma dos valores de intensidade dos pixels dentro do ROI selecionado. Desde que os esferoides são estruturas 3D, as imagens confocal das pilhas diferentes são adquiridas. Para processar tais imagens um pode medir o sinal fluorescente em cada pilha individualmente ou usar a soma de todas as pilhas em uma Z-projeção. Todas as quantificações podem ser executadas usando o ImageJ. A fluorescência total corrigida (TCF) dos esferóides é determinada como o TCCF normalizado, considerando a área do esferóide e o número de pilhas, utilizando a equação 2. Isto esclarece os tamanhos de variação dos esferoides e a discrepância na forma esférica. Analisando a coloração imunofluorescente dos esferóides usando este método pode demorar até 5 min por esferóide.
Da mesma forma, a invasão de células de esferóides na matriz estromal circundante pode ser analisada por diferentes algoritmos. Um método direto foi descrito previamente por Nowicki et al, em que as células cancerosas invasivas foram contadas23. A fim de discriminar as células invasivas dos que não invadem, é importante estabelecer um limite espacial além do qual as células são consideradas como tendo deixado a estrutura esferóide. Portanto, o ponto de partida é o limite que corresponde ao perímetro das imagens esferóides adquiridas no ponto de tempo inicial (tempo 0), quando os esferóides foram incorporados no gel. A célula que invade o gel mais distante é considerada a distância máxima que uma célula invasiva pode alcançar e, portanto, define a borda externa da região de invasão. Este método conta as células cancerosas invasoras que estão presentes na área invasora, usando a ferramenta de contagem de ImageJ, e o ROI correspondente ao esferóide no tempo 0 h é adicionado ao gerente do ROI e transposta então à imagem do mesmo esferóide exato adquirido 48 h ou 72 h mais tarde. Por esta razão, é importante que o esferóide permaneça o mais próximo possível do centro dos aviões, durante os diferentes tempos de aquisição. Contando o número de células pode demorar até 5 min por spheroid.
Outra consideração importante é distinguir os diferentes tipos de células no heterospheroid. Isso pode ser realizado usando corantes fluorescentes de células ao vivo, que podem ser problemáticos quando o tipo de célula tem uma taxa de divisão de células elevadas ou se o experimento deve ser realizado por longos períodos de tempo. A maneira mais robusta e confiável de distinguir as duas populações diferentes é desenvolver linhas celulares expressando proteínas fluorescentes como mCherry e GFP. A entrega dos vetores da expressão pode ser executada usando o Lentivirus, que conduz à expressão estável destas proteínas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses. Este material reflecte apenas os pontos de vista do autor e a União Europeia não é responsável por qualquer utilização que possa ser feita das informações nele contidas.
Acknowledgments
Reconhecemos a ajuda de Barbara Schedding na preparação do BM2 e do lebein-1. Reconhecemos a Àgnes Noel por compartilhar sua expertise em ensaios de esferóides. Agradecemos Sonja Schelhaas e Michael Schäfers por sua ajuda na manipulação de transfecção lentivirais condições S2. Reconhecemos a assistência de Sabine von Rüden na preparação de CAFs de tecido de câncer pancreático.
A investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do programa de pessoas (acções Marie Curie) do sétimo programa-quadro da União Europeia 7. º PQ/2007-2013/no âmbito do acordo de subvenção REA n ◦ (316610) para J.A.E. Além disso, a J.A.E. e a A.C.M.C. foram apoiadas financeiramente pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro do cluster de excelência Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Este projeto também foi apoiado por Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | SIGMA-ALDRICH | D9542-10 | |
| 6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal) | Homemade | ||
| A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston | ||
| Acetone | SIGMA-ALDRICH | 32201 | |
| Albumin Fraction V - BSA | AppliChem | A1391 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit | Invitrogen | A11034 | |
| Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc-28330 | |
| Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320 | Millipore | AB5320 | |
| Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal) | SIGMA-ALDRICH | C6198 | |
| AsPC-1 cell line | ATCC | Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab | |
| Bench centrifuge | Fisher Scientific | 50-589-620 | Sprout |
| BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal) | Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fluka | 21074 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge 1S-R | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagen-I, rat tail | Gibco | A10483-01 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 700 and 800 | |
| DMEM (High glucose 4.5 g/L) | Lonza | BE12-604F | |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCaliburTM | |
| Gelifying matrix | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Matrigel, Geltrex |
| Goat IgG, isotype | DAKO | X 0907 | |
| Horse Serum | SIGMA-ALDRICH | 12449-C | |
| Human Primary Pancreatic Fibroblasts | PELOBiotech | PB-H-6201 | |
| Incubator | Heraeus | B6060 | |
| Laminin-332 | Biolamina | LN332 | |
| MEM | SIGMA-ALDRICH | M4655 | |
| Microplate, 96 wells, U-bottom | Greiner Bio-One | 650101 | |
| Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mouse IgG, isotype | SIGMA-ALDRICH | I8765 | |
| Multi axle rotating mixer | CAT | RM5 80V | |
| PANC-I | ATCC | Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab | |
| Paraformaldehyde | Riedel-de Haën | 16005 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205310 | |
| Rat IgG, isotype | Invitrogen | 10700 | |
| Reaction tubes, 1.5 mL | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Real-time PCR cycler | Qiagen | Rotor-Gene Q | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Rotor Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | |
| RPMI | Lonza | BE12-702F | Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate |
| TritonX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100RS | |
| Vórtex | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| μ-Slide Angiogenesis, uncoated | Ibidi | 81501 |
References
- Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
- Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
- Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
- Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
- Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
- Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
- Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
- Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
- Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
- Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
- Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
- Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
- Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
- Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
- Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
- Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).
