Le bip basal biaxial et l'essai passif du système reproducteur de Murine utilisant un myographe de pression
Summary
Ce protocole a utilisé un système de myographe de pression disponible dans le commerce pour effectuer des tests de myographe de pression sur le vagin murine et le col de l’utérus. Utilisant des médias avec et sans calcium, les contributions du tonus basal lisse de cellules de muscle (SMC) et de la matrice extracellulaire passive (ECM) ont été isolées pour les organes dans des conditions physiologiques estimées.
Abstract
Les organes reproducteurs féminins, en particulier le vagin et le col de l’utérus, sont composés de divers composants cellulaires et d’une matrice extracellulaire unique (ECM). Les cellules musculaires lisses présentent une fonction contractile dans les parois vaginales et cervicales. Selon l’environnement biochimique et la distension mécanique des parois des organes, les cellules musculaires lisses modifient les conditions contractiles. La contribution des cellules musculaires lisses dans des conditions physiologiques de base est classée comme un ton basal. Plus précisément, un ton basal est la constriction partielle de base des cellules musculaires lisses en l’absence de stimulation hormonale et neuronale. En outre, l’ECM fournit un soutien structurel pour les parois des organes et fonctionne comme un réservoir pour les indices biochimiques. Ces indices biochimiques sont essentiels à diverses fonctions d’organe, telles que l’incitation à la croissance et le maintien de l’homéostasie. L’ECM de chaque organe est composé principalement de fibres de collagène (principalement les types de collagène I, III et V), de fibres élastiques et de glycosaminoglycanes/protéoglycanes. La composition et l’organisation de l’ECM dictent les propriétés mécaniques de chaque organe. Un changement dans la composition de l’ECM peut conduire au développement de pathologies reproductrices, telles que le prolapsus des organes pelviens ou le remodelage cervical prématuré. En outre, les changements dans la microstructure et la rigidité d’ECM peuvent altérer l’activité lisse de cellules de muscle et le phénotype, ayant pour résultat la perte de la force contractile.
Dans ce travail, les protocoles rapportés sont employés pour évaluer le tonalité basale et les propriétés mécaniques passives du vagin murine non-pregnant et du col de l’utérus à 4-6 mois d’âge dans l’estrus. Les organes ont été montés dans un myographe de pression disponible dans le commerce et des essais de diamètre de pression et de longueur de force ont été exécutés. Des données d’échantillon et des techniques d’analyse de données pour la caractérisation mécanique des organes reproducteurs sont incluses. Ces informations peuvent être utiles pour construire des modèles mathématiques et concevoir rationnellement des interventions thérapeutiques pour les pathologies de santé des femmes.
Introduction
La paroi vaginale est composée de quatre couches, l’épithélium, lalame propria, muscularis, et adventitia. L’épithélium est principalement composé de cellules épithéliales. La lame propria a une grande quantité de fibres élastiques et fibrillaires de collagène. Le muscularis est également composé d’élastine et de fibres de collagène, mais a une quantité accrue de cellules musculaires lisses. L’adventitia est composée d’élastine, de collagène et de fibroblastes, bien qu’en concentrations réduites par rapport aux couches précédentes. Les cellules musculaires lisses sont d’intérêt pour les groupes de recherche biomécaniquement motivés car ils jouent un rôle dans la nature contractile des organes. En tant que tel, la quantification de la fraction de zone musculaire lisse et l’organisation est la clé pour comprendre la fonction mécanique. Les investigations précédentes suggèrent que le contenu lisse de muscle dans la paroi vaginale soit principalement organisé dans l’axe circonférences et longitudinal. L’analyse histologique suggère que la fraction lisse de secteur de muscle soit approximativement35% pour les sections proximales et distales du mur 1.
Le col de l’utérus est une structure très collagène, qui jusqu’à récemment, a été pensé pour avoir un minimum de contenu de cellules musculaires lisses2,3. Des études récentes, cependant, ont suggéré que les cellules musculaires lisses peuvent avoir une plus grande abondance et le rôle dans le col de l’utérus4,5. Le col de l’utérus présente un gradient de cellules musculaires lisses. L’os interne contient 50-60% de cellules musculaires lisses où l’os externe ne contient que 10%. Les études de souris, cependant, rapportent le col de l’utérus pour être composé de 10-15% de cellules musculaires lisses et 85-90% tissu conjonctif fibreux sans mention des différences régionales6,7,8. Étant donné que le modèle de souris diffère du modèle humain fréquemment rapporté, d’autres investigations concernant le col de l’utérus de souris sont nécessaires.
Le but de ce protocole était d’élucider les propriétés mécaniques du vagin murine et du col de l’utérus. Ceci a été accompli en utilisant un dispositif de myographe de pression qui permet d’évaluer des propriétés mécaniques dans les directions circonférences et axiales simultanément tout en maintenant les interactions cellulaires-matrice indigènes et la géométrie d’organe. Les orgues ont été montés sur deux canules personnalisées et fixés avec des sutures en soie 6-0. Des tests de diamètre de pression ont été effectués autour de l’étirement axial physiologique estimé pour déterminer la conformité et le moduli tangente9. Des essais de longueur de force ont été effectués pour confirmer l’étirement axial estimé et pour s’assurer que les propriétés mécaniques étaient quantifiées dans la plage physiologique. Le protocole expérimental a été exécuté sur le vagin murine non-pregnant et le col de l’utérus à 4-6 mois d’âge dans l’estrus.
Le protocole est divisé en deux sections d’essais mécaniques principales : le ton basal et les essais passifs. Un ton basal est défini comme la constriction partielle de base des cellules musculaires lisses, même en l’absence de stimulation locale, hormonale et neuronale externe10. Cette nature contractile de base du vagin et du col de l’utérus donne des comportements mécaniques caractéristiques qui sont ensuite mesurés par le système myographe de pression. Les propriétés passives sont évaluées en supprimant le calcium intercellulaire qui maintient l’état de base de contraction, ce qui entraîne une relaxation des cellules musculaires lisses. Dans l’état passif, les fibres de collagène et d’élastine fournissent les contributions dominantes pour les caractéristiques mécaniques des organes.
Le modèle murine est largement utilisé pour étudier les pathologies de la santé reproductive des femmes. La souris offre plusieurs avantages pour quantifier l’évolution des relations entre l’ECM et les propriétés mécaniques dans le système reproducteur11,12,13,14. Ces avantages comprennent des cycles estrous courts et bien caractérisés, un coût relativement faible, une facilité de manipulation et un temps gestationnel relativement court15. En outre, le génome des souris de laboratoire est bien cartographié et les souris génétiquement modifiées sont des outils précieux pour tester les hypothèses mécanistes16,17,18.
Les systèmes de myographie de pression disponibles dans le commerce sont largement utilisés pour quantifier les réponses mécaniques de divers tissus et organes. Quelques structures notables analysées sur le système de myographe de pression incluent les artères élastiques19,20,21,22, veines et greffes vasculaires machinées de tissu23,24, l’œsophage25, et les gros intestins26. La technologie du myographe sous pression permet une évaluation simultanée des propriétés dans les directions axiale et circonférence tout en maintenant les interactions cellules-ECM indigènes et la géométrie in vivo. En dépit de l’utilisation étendue des systèmes de myographe dans la mécanique molle de tissu et d’organe, un protocole utilisant la technologie de myographe de pression n’avait pas été précédemment développé pour le vagin et le col de l’utérus. Des investigations antérieures sur les propriétés mécaniques du vagin et du col de l’utérus ont été évaluées uniaxialement27,28. Ces organes, cependant, l’expérience de la charge multiaxiale dans le corps29,30, quantifiant ainsi leur réponse mécanique biaxiale est important.
En outre, des travaux récents suggèrent que les cellules musculaires lisses peuvent jouer un rôle potentiel dans les pathologies des tissus mous5,28,31,32. Ceci fournit une autre attraction de l’utilisation de la technologie de myographe de pression, car il préserve les interactions cellulaires-matrice indigènes, permettant ainsi la délimitation de la contribution que les cellules musculaires lisses jouent dans physiologique et pathophysiologique Conditions. Ici, nous proposons un protocole pour quantifier les propriétés mécaniques multiaxiales du vagin et du col de l’utérus sous le tonalité basale et les conditions passives.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole fourni dans cet article présente une méthode pour déterminer les propriétés mécaniques du vagin murine et du col de l’utérus. Les propriétés mécaniques analysées dans ce protocole comprennent à la fois les conditions de tonalité passive et basale des organes. Les conditions de tonalité passive et basale sont induites par la modification de l’environnement biochimique dans lequel l’organe est submergé. Pour ce protocole, les médias impliqués dans les tests basaux contiennent du calcium. L’ess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été financés par la subvention de la NSF CAREER #1751050.
Materials
| 2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
| 6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
| CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
| CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
| Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
| Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
| Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
| Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
| ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
| Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
| KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
| KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
| MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
| MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
| MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
| Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
| Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
| NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
| NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
| Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
| Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
| Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
| Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
| VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |
References
- Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
- Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53 (4), 541-560 (1947).
- Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
- Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75 (2), 240-243 (1990).
- Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215 (4), e471-e478 (2016).
- Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23 (23), 907-912 (2014).
- Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43 (43), 433-439 (2000).
- Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
- Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. , (2006).
- Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
- Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143 (4), 429-438 (2012).
- Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation?. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193 (3), 1149-1155 (2005).
- Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24 (7), 838-849 (2017).
- Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
- Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92 (2), 287-295 (2011).
- Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224 (1), 33-44 (2011).
- Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198 (5), (2009).
- Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12 (108), 20150280 (2015).
- Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
- Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49 (8), 867-879 (2011).
- Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44 (10), 1941-1947 (2011).
- Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11 (9), 1419-1428 (2003).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
- Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
- Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32 (12), 1969-1982 (2011).
- Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13 (3), 317-337 (2010).
- Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120 (2), 224-232 (2012).
- Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
- Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. , 689-690 (2010).
- Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39 (1), 549-558 (2010).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
- Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
- McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
- Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36 (2), 133-140 (2006).
- Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
- Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103 (2), 443-447 (2006).
- de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 6364821 (2018).
- Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
- Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110 (1), 251-257 (1996).
- Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
- Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
- Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 104504 (2017).
- Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14 (4), 181-201 (1977).
- Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19 (4), 404-417 (2015).
- House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28 (6), 745-749 (2006).
- Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
- Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
- Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64 (2), 183-186 (1985).
- Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67 (8), 711-716 (1988).
- Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9 (1), 27-37 (1997).
- Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
- Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
- Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
- Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (6), 787-795 (2005).
- Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (11), 6180-6185 (2001).
- Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
- Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36 (8), 1322-1334 (2008).
- Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141 (2), 021011 (2018).
- Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
- Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132 (2), 021003 (2010).
- Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (5), 051008 (2016).
- Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
- van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25 (6), 799-805 (2014).
