Summary

Le bip basal biaxial et l'essai passif du système reproducteur de Murine utilisant un myographe de pression

Published: August 13, 2019
doi:

Summary

Ce protocole a utilisé un système de myographe de pression disponible dans le commerce pour effectuer des tests de myographe de pression sur le vagin murine et le col de l’utérus. Utilisant des médias avec et sans calcium, les contributions du tonus basal lisse de cellules de muscle (SMC) et de la matrice extracellulaire passive (ECM) ont été isolées pour les organes dans des conditions physiologiques estimées.

Abstract

Les organes reproducteurs féminins, en particulier le vagin et le col de l’utérus, sont composés de divers composants cellulaires et d’une matrice extracellulaire unique (ECM). Les cellules musculaires lisses présentent une fonction contractile dans les parois vaginales et cervicales. Selon l’environnement biochimique et la distension mécanique des parois des organes, les cellules musculaires lisses modifient les conditions contractiles. La contribution des cellules musculaires lisses dans des conditions physiologiques de base est classée comme un ton basal. Plus précisément, un ton basal est la constriction partielle de base des cellules musculaires lisses en l’absence de stimulation hormonale et neuronale. En outre, l’ECM fournit un soutien structurel pour les parois des organes et fonctionne comme un réservoir pour les indices biochimiques. Ces indices biochimiques sont essentiels à diverses fonctions d’organe, telles que l’incitation à la croissance et le maintien de l’homéostasie. L’ECM de chaque organe est composé principalement de fibres de collagène (principalement les types de collagène I, III et V), de fibres élastiques et de glycosaminoglycanes/protéoglycanes. La composition et l’organisation de l’ECM dictent les propriétés mécaniques de chaque organe. Un changement dans la composition de l’ECM peut conduire au développement de pathologies reproductrices, telles que le prolapsus des organes pelviens ou le remodelage cervical prématuré. En outre, les changements dans la microstructure et la rigidité d’ECM peuvent altérer l’activité lisse de cellules de muscle et le phénotype, ayant pour résultat la perte de la force contractile.

Dans ce travail, les protocoles rapportés sont employés pour évaluer le tonalité basale et les propriétés mécaniques passives du vagin murine non-pregnant et du col de l’utérus à 4-6 mois d’âge dans l’estrus. Les organes ont été montés dans un myographe de pression disponible dans le commerce et des essais de diamètre de pression et de longueur de force ont été exécutés. Des données d’échantillon et des techniques d’analyse de données pour la caractérisation mécanique des organes reproducteurs sont incluses. Ces informations peuvent être utiles pour construire des modèles mathématiques et concevoir rationnellement des interventions thérapeutiques pour les pathologies de santé des femmes.

Introduction

La paroi vaginale est composée de quatre couches, l’épithélium, lalame propria, muscularis, et adventitia. L’épithélium est principalement composé de cellules épithéliales. La lame propria a une grande quantité de fibres élastiques et fibrillaires de collagène. Le muscularis est également composé d’élastine et de fibres de collagène, mais a une quantité accrue de cellules musculaires lisses. L’adventitia est composée d’élastine, de collagène et de fibroblastes, bien qu’en concentrations réduites par rapport aux couches précédentes. Les cellules musculaires lisses sont d’intérêt pour les groupes de recherche biomécaniquement motivés car ils jouent un rôle dans la nature contractile des organes. En tant que tel, la quantification de la fraction de zone musculaire lisse et l’organisation est la clé pour comprendre la fonction mécanique. Les investigations précédentes suggèrent que le contenu lisse de muscle dans la paroi vaginale soit principalement organisé dans l’axe circonférences et longitudinal. L’analyse histologique suggère que la fraction lisse de secteur de muscle soit approximativement35% pour les sections proximales et distales du mur 1.

Le col de l’utérus est une structure très collagène, qui jusqu’à récemment, a été pensé pour avoir un minimum de contenu de cellules musculaires lisses2,3. Des études récentes, cependant, ont suggéré que les cellules musculaires lisses peuvent avoir une plus grande abondance et le rôle dans le col de l’utérus4,5. Le col de l’utérus présente un gradient de cellules musculaires lisses. L’os interne contient 50-60% de cellules musculaires lisses où l’os externe ne contient que 10%. Les études de souris, cependant, rapportent le col de l’utérus pour être composé de 10-15% de cellules musculaires lisses et 85-90% tissu conjonctif fibreux sans mention des différences régionales6,7,8. Étant donné que le modèle de souris diffère du modèle humain fréquemment rapporté, d’autres investigations concernant le col de l’utérus de souris sont nécessaires.

Le but de ce protocole était d’élucider les propriétés mécaniques du vagin murine et du col de l’utérus. Ceci a été accompli en utilisant un dispositif de myographe de pression qui permet d’évaluer des propriétés mécaniques dans les directions circonférences et axiales simultanément tout en maintenant les interactions cellulaires-matrice indigènes et la géométrie d’organe. Les orgues ont été montés sur deux canules personnalisées et fixés avec des sutures en soie 6-0. Des tests de diamètre de pression ont été effectués autour de l’étirement axial physiologique estimé pour déterminer la conformité et le moduli tangente9. Des essais de longueur de force ont été effectués pour confirmer l’étirement axial estimé et pour s’assurer que les propriétés mécaniques étaient quantifiées dans la plage physiologique. Le protocole expérimental a été exécuté sur le vagin murine non-pregnant et le col de l’utérus à 4-6 mois d’âge dans l’estrus.

Le protocole est divisé en deux sections d’essais mécaniques principales : le ton basal et les essais passifs. Un ton basal est défini comme la constriction partielle de base des cellules musculaires lisses, même en l’absence de stimulation locale, hormonale et neuronale externe10. Cette nature contractile de base du vagin et du col de l’utérus donne des comportements mécaniques caractéristiques qui sont ensuite mesurés par le système myographe de pression. Les propriétés passives sont évaluées en supprimant le calcium intercellulaire qui maintient l’état de base de contraction, ce qui entraîne une relaxation des cellules musculaires lisses. Dans l’état passif, les fibres de collagène et d’élastine fournissent les contributions dominantes pour les caractéristiques mécaniques des organes.

Le modèle murine est largement utilisé pour étudier les pathologies de la santé reproductive des femmes. La souris offre plusieurs avantages pour quantifier l’évolution des relations entre l’ECM et les propriétés mécaniques dans le système reproducteur11,12,13,14. Ces avantages comprennent des cycles estrous courts et bien caractérisés, un coût relativement faible, une facilité de manipulation et un temps gestationnel relativement court15. En outre, le génome des souris de laboratoire est bien cartographié et les souris génétiquement modifiées sont des outils précieux pour tester les hypothèses mécanistes16,17,18.

Les systèmes de myographie de pression disponibles dans le commerce sont largement utilisés pour quantifier les réponses mécaniques de divers tissus et organes. Quelques structures notables analysées sur le système de myographe de pression incluent les artères élastiques19,20,21,22, veines et greffes vasculaires machinées de tissu23,24, l’œsophage25, et les gros intestins26. La technologie du myographe sous pression permet une évaluation simultanée des propriétés dans les directions axiale et circonférence tout en maintenant les interactions cellules-ECM indigènes et la géométrie in vivo. En dépit de l’utilisation étendue des systèmes de myographe dans la mécanique molle de tissu et d’organe, un protocole utilisant la technologie de myographe de pression n’avait pas été précédemment développé pour le vagin et le col de l’utérus. Des investigations antérieures sur les propriétés mécaniques du vagin et du col de l’utérus ont été évaluées uniaxialement27,28. Ces organes, cependant, l’expérience de la charge multiaxiale dans le corps29,30, quantifiant ainsi leur réponse mécanique biaxiale est important.

En outre, des travaux récents suggèrent que les cellules musculaires lisses peuvent jouer un rôle potentiel dans les pathologies des tissus mous5,28,31,32. Ceci fournit une autre attraction de l’utilisation de la technologie de myographe de pression, car il préserve les interactions cellulaires-matrice indigènes, permettant ainsi la délimitation de la contribution que les cellules musculaires lisses jouent dans physiologique et pathophysiologique Conditions. Ici, nous proposons un protocole pour quantifier les propriétés mécaniques multiaxiales du vagin et du col de l’utérus sous le tonalité basale et les conditions passives.

Protocol

Des souris femelles nullipares de 4-6 mois de C57BL6J (29,4 à 6,8 grammes) à l’estrus ont été utilisées pour cette étude. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut de l’Université Tulane. Après l’accouchement, les souris se sont acclimatées pendant une semaine avant l’euthanasie et ont été logées dans des conditions standard (cycles de lumière/obscurité de 12 heures). 1. Sacrifice de souris à l’estrus <o…

Representative Results

L’analyse réussie des propriétés mécaniques des organes reproducteurs féminins est subordonnée à la dissection appropriée d’organe, à l’annulation, et à l’essai. Il est impératif d’explanter les cornes utérines au vagin sans aucun défaut (Figure 1). Selon le type d’organe, la taille de la canule variera (Figure 2). Cannulation doit être fait de sorte que l’organe ne peut pas se déplacer pendant l’expérience, mais aussi ne pas endommager la paroi de l’orga…

Discussion

Le protocole fourni dans cet article présente une méthode pour déterminer les propriétés mécaniques du vagin murine et du col de l’utérus. Les propriétés mécaniques analysées dans ce protocole comprennent à la fois les conditions de tonalité passive et basale des organes. Les conditions de tonalité passive et basale sont induites par la modification de l’environnement biochimique dans lequel l’organe est submergé. Pour ce protocole, les médias impliqués dans les tests basaux contiennent du calcium. L’ess…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les travaux ont été financés par la subvention de la NSF CAREER #1751050.

Materials

2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer – 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

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White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

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