Tono basale biassiale e test passivi del sistema riproduttivo Murine utilizzando un miografo a pressione
Summary
Questo protocollo utilizzava un sistema miografo a pressione disponibile in commercio per eseguire test miografici di pressione sulla vagina murina e sulla cervice. Utilizzando i media con e senza calcio, i contributi del tono basale delle cellule muscolari lisce (SMC) e della matrice extracellulare passiva (ECM) sono stati isolati per gli organi in condizioni fisiologiche stimate.
Abstract
Gli organi riproduttivi femminili, in particolare la vagina e la cervice, sono composti da vari componenti cellulari e da una matrice extracellulare unica (ECM). Le cellule muscolari lisce presentano una funzione contrattile all’interno delle pareti vaginali e cervicali. A seconda dell’ambiente biochimico e della distensione meccanica delle pareti dell’organo, le cellule muscolari lisce alterano le condizioni contrattili. Il contributo delle cellule muscolari lisce in condizioni fisiologiche al basale è classificato come un tono basale. Più specificamente, un tono basale è la costrizione parziale della linea di base delle cellule muscolari lisce in assenza di stimolazione ormonale e neurale. Inoltre, l’ECM fornisce supporto strutturale per le pareti degli organi e funziona come serbatoio per segnali biochimici. Questi segnali biochimici sono vitali per varie funzioni degli organi, come incitare la crescita e mantenere l’omeostasi. L’ECM di ogni organo è composto principalmente da fibre di collagene (per lo più tipi di collagene I, III e V), fibre elastiche e glicosaminoglicani/proteoglicani. La composizione e l’organizzazione dell’ECM dettano le proprietà meccaniche di ogni organo. Un cambiamento nella composizione ECM può portare allo sviluppo di patologie riproduttive, come prolasso dell’organo pelvico o rimodellamento cervicale prematuro. Inoltre, i cambiamenti nella microstruttura e rigidità dell’ECM possono alterare l’attività delle cellule muscolari lisce e il fenotipo, con conseguente perdita della forza contrattile.
In questo lavoro, i protocolli riportati vengono utilizzati per valutare il tono basale e le proprietà meccaniche passive della vagina murina non incinta e della cervice a 4-6 mesi di età in estro. Gli organi sono stati montati in un miografo a pressione disponibile in commercio ed è stato eseguito sia il diametro della pressione che i test di lunghezza della forza. Sono inclusi dati di esempio e tecniche di analisi dei dati per la caratterizzazione meccanica degli organi riproduttivi. Tali informazioni possono essere utili per la costruzione di modelli matematici e per progettare razionalmente interventi terapeutici per le patologie della salute delle donne.
Introduction
La parete vaginale è composta da quattro strati, l’epitelio, la mina propria, muscularis, e l’avvento. L’epitelio è composto principalmente da cellule epiteliali. La propriala ha una grande quantità di fibre di collagene elastico e fibrillare. Il muscolo è anche composto da elastina e fibre di collagene, ma ha una maggiore quantità di cellule muscolari lisce. L’avventtia è costituita da elastina, collagene e fibroblasti, anche se in concentrazioni ridotte rispetto agli strati precedenti. Le cellule muscolari lisce sono di interesse per i gruppi di ricerca motivati biomeccanicamente in quanto svolgono un ruolo nella natura contrattile degli organi. Come tale, quantificare la frazione di area della cellula muscolare liscia e l’organizzazione è fondamentale per comprendere la funzione meccanica. Indagini precedenti suggeriscono che il contenuto muscolare liscio all’interno della parete vaginale è organizzato principalmente nell’asse circonferenziale e longitudinale. L’analisi istologica suggerisce che la frazione dell’area muscolare liscia è di circa il 35% per entrambe le sezioni prossimali e distali della parete1.
La cervice è una struttura altamente collagenosa, che fino a poco tempo fa, si pensava avesse un minimo contenuto di cellule muscolari lisce2,3. Recenti studi, tuttavia, hanno suggerito che le cellule muscolari lisce possono avere una maggiore abbondanza e ruolo nella cervice4,5. La cervice presenta un gradiente di cellule muscolari lisce. L’os interno contiene 50-60% cellule muscolari lisce in cui l’os esterno contiene solo 10%. Gli studi sui topi, tuttavia, riportano la cervice da compostare da cellule muscolari lisce 10-15% e tessuto connettivo fibroso 85-90% senza menzione delle differenze regionali6,7,8. Dato che il modello murino differisce dal modello umano frequentemente riportato, sono necessarie ulteriori indagini riguardanti la cervice del topo.
Lo scopo di questo protocollo era quello di chiarire le proprietà meccaniche della vagina murina e della cervice. Ciò è stato ottenuto utilizzando un dispositivo miografo a pressione che consente la valutazione delle proprietà meccaniche nelle direzioni circonferenziali e assiali contemporaneamente, pur mantenendo le interazioni nativo della matrice cellulare e la geometria dell’organo. Gli organi erano montati su due cannule personalizzati e fissati con suture 6-0 di seta. Sono stati eseguiti test di diametro della pressione intorno all’allungamento assiale fisiologico stimato per determinare la conformità e la modulitangente9. Sono stati condotti test di lunghezza della forza per confermare l’allungamento assiale stimato e per garantire che le proprietà meccaniche siano state quantificate nella gamma fisiologica. Il protocollo sperimentale è stato eseguito sulla vagina murina e sulla cervice murine non incinta a 4-6 mesi di età in estrus.
Il protocollo è suddiviso in due sezioni di test meccanici principali: tono basale e test passivo. Un tono basale è definito come la costrizione parziale della linea di base delle cellule muscolari lisce, anche nelle assenze di stimolazione locale, ormonale e neurale esterna10. Questa natura contrattile di base della vagina e della cervice produce comportamenti meccanici caratteristici che vengono poi misurati dal sistema miografo a pressione. Le proprietà passive vengono valutate rimuovendo il calcio intercellulare che mantiene lo stato di base della contrazione, con conseguente rilassamento delle cellule muscolari lisce. Nello stato passivo, le fibre di collagene ed elastina forniscono i contributi dominanti per le caratteristiche meccaniche degli organi.
Il modello murino è ampiamente utilizzato per studiare le patologie nella salute riproduttiva delle donne. Il mouse offre diversi vantaggi per quantificare le relazioni in evoluzione tra ECM e le proprietà meccaniche all’interno del sistema riproduttivo11,12,13,14. Questi vantaggi includono cicli estistici brevi e ben caratterizzati, costi relativamente bassi, facilità di movimentazione e un tempo gestazionale relativamente breve15. Inoltre, il genoma dei topi da laboratorio è ben mappato e i topi geneticamente modificati sono strumenti preziosi per testare ipotesi meccanicistiche16,17,18.
I sistemi miografici a pressione disponibili in commercio sono ampiamente utilizzati per quantificare le risposte meccaniche di vari tessuti e organi. Alcune strutture notevoli analizzate sul sistema miografo a pressione includono arterie elastiche19,20,21,22, vene e innesti vascolari ingegnerizzati su tessuti23,24, l’esofago25, e l’intestino crasso26. La tecnologia del miografo a pressione consente la valutazione simultanea delle proprietà nelle direzioni assiali e circolari, mantenendo al contempo le interazioni cell-ECM native e la geometria in vivo. Nonostante l’ampio uso di sistemi miografici nella meccanica dei tessuti molli e degli organi, un protocollo che utilizzava la tecnologia del miografo a pressione non era stato precedentemente sviluppato per la vagina e la cervice. Precedenti indagini sulle proprietà meccaniche della vagina e della cervice sono state valutate uniaxially27,28. Questi organi, tuttavia, sperimentano il carico multiassiale all’interno del corpo29,30, quantificando così la loro risposta meccanica biassiale è importante.
Inoltre, recenti lavori suggeriscono che le cellule muscolari lisce possono svolgere un potenziale ruolo nelle patologie dei tessuti molli5,28,31,32. Questo fornisce un’altra attrazione nell’utilizzare la tecnologia miografica a pressione, in quanto conserva le interazioni nativo cellula-matrice, permettendo così la delineazione del contributo che le cellule muscolari lisce giocano in fisiologica e patologica Condizioni. Qui, proponiamo un protocollo per quantificare le proprietà meccaniche multiassiali della vagina e della cervice sia in condizioni di tono basale che passive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo fornito in questo articolo presenta un metodo per determinare le proprietà meccaniche della vagina murina e della cervice. Le proprietà meccaniche analizzate in questo protocollo includono sia le condizioni di tono passivo che basale degli organi. Le condizioni di tono passivo e basale sono indotte alterando l’ambiente biochimico in cui l’organo è sommerso. Per questo protocollo, i media coinvolti nei test basali contengono calcio. Testare la condizione del tono basale permette l’isolamento del contribut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato finanziato dalla borsa di #1751050 di premiazione NSF CAREER.
Materials
| 2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
| 6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
| CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
| CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
| Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
| Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
| Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
| Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
| ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
| Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
| KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
| KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
| MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
| MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
| MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
| Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
| Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
| NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
| NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
| Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
| Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
| Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
| Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
| VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |
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