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Bioengineering

압력 근엽을 이용한 뮤린 생식 계통의 양축 기저톤 및 수동 테스트

Published: August 13, 2019
doi:
10.3791/60125
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Tulane University

Summary

이 프로토콜은 뮤린 질 및 자궁 경부에 대한 압력 근사진 테스트를 수행하기 위해 시판되는 압력 근경 시스템을 활용했습니다. 칼슘유무와 관계없이 매질, 평활근 세포(SMC) 기저톤 및 수동 세포외 매트릭스(ECM)의 기여도를 추정된 생리적 조건 하에서 장기용으로 분리하였다.

Abstract

여성 생식 기관, 특히 질과 자궁 경부는 다양한 세포 구성 요소와독특한 세포 외 매트릭스 (ECM)로 구성됩니다. 평활근 세포는 질 및 자궁 경부 벽 내의 수축 기능을 나타낸다. 생화학적 환경과 기관 벽의 기계적 팽창에 따라 평활근 세포는 수축 상태를 변경합니다. 기준선 생리적 조건 하에서 평활근 세포의 기여는 기저 톤으로 분류된다. 보다 구체적으로, 기저 톤은 호르몬 및 신경 자극이 없는 평활근 세포의 기준선 부분 수축이다. 또한, ECM은 기관 벽에 대한 구조적 지원을 제공하고 생화학 적 단서를위한 저장소로서의 기능을 제공합니다. 이 생화확적인 단서는 성장을 선동하고 항상성을 유지하는 것과 같은 각종 기관 기능에 생명입니다. 각 기관의 ECM은 주로 콜라겐 섬유 (주로 콜라겐 유형 I, III 및 V), 탄성 섬유 및 글리코사미노 글리칸 / 프로테오글리칸으로 구성됩니다. ECM의 구성 및 조직은 각 기관의 기계적 특성을 지시합니다. ECM 조성에 있는 변경은 골반 기관 탈출 또는 조기 자궁 경관 개조와 같은 생식 병리의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 더욱이, ECM 미세 구조 및 강성에 있는 변경은 평활근 세포 활동 및 표현형을 바꿀 수 있습니다, 따라서 수축력의 손실의 결과로.

이 작품에서, 보고된 프로토콜은 발식에 있는 나이의 4-6 달에 비임신 한 뮤린 질 및 자궁 경부의 기저 톤 및 수동 기계적 특성을 평가하기 위하여 이용됩니다. 장기를 시판되는 압력 근사에 장착하고 압력 직경 및 힘 길이 테스트를 모두 수행했습니다. 생식 기관의 기계적 특성분석을 위한 샘플 데이터 및 데이터 분석 기술이 포함되어 있다. 이러한 정보는 수학적 모델을 구축하고 여성의 건강 병리학에 대한 치료 적 개입을 합리적으로 설계하는 데 유용 할 수 있습니다.

Introduction

질 벽은 4 개의 층, 상피, 라미나 프로피아, 근육질 및 출현으로 구성됩니다. 상피는 주로 상피 세포로 구성됩니다. 라미나 프로프리아는 다량의 탄성 및 섬유질 콜라겐 섬유를 가지고 있습니다. 근육질은 또한 엘라스틴과 콜라겐 섬유로 구성되지만 평활근 세포의 양이 증가합니다. 출현은 엘라스틴, 콜라겐 및 섬유아세포로 구성되어 있으며, 이전 층에 비해 농도가 감소합니다. 평활근 세포는 장기의 수축성질에서 역할을 하기 때문에 생체역학적으로 동기를 부여받은 연구 그룹에 관심이 있습니다. 이와 같이, 평활근 세포 면적 분획 및 조직을 정량화하는 것은 기계적 기능을 이해하는 데 핵심이다. 이전 조사는 질 벽 내의 평활근 함량이 주로 둘레및 세로 축으로 구성되어 있음을 시사한다. 조직학적 분석에 따르면 평활근 면적 분율은 벽 1의 근위 및 말단 모두에대해 약 35%입니다.

자궁경부는 콜라겐구조가 높고, 최근까지 는 평활근 세포함량이2,3로생각되었다. 최근 연구는, 그러나, 평활근 세포가 자궁 경부에 있는 더중대한 풍부하고 역할을 가질 수 있다는 것을 건의했습니다 4,5. 자궁 경부는 평활근 세포의 구배를 나타낸다. 내부 OS는 외부 OS가 10 %를 포함하는 50-60 % 평활근 세포를 포함합니다. 그러나 마우스 연구는 자궁경부를 10-15% 평활근 세포와 85-90% 섬유결합조직으로 구성하여 지역적차이에 대한 언급없이 6,7,8로구성된다. 마우스 모형이 자주 보고된 인간 모형과 다르다는 것을 감안할 때, 마우스 자궁 경부에 관하여 추가 조사가 필요합니다.

이 프로토콜의 목적은 뮤린 질 및 자궁 경부의 기계적 특성을 해명하는 것이었습니다. 이것은 네이티브 세포 매트릭스 상호 작용 및 기관 기하학을 유지하면서 원주 및 축 방향에서 기계적 특성을 동시에 평가할 수 있는 압력 myograph 장치를 사용하여 달성되었습니다. 장기는 두 개의 사용자 정의 캐뉼러에 장착하고 실크 6-0 봉합사로 고정되었습니다. 압력 직경 시험은 컴플라이언스 및 탄젠트 모듈리 9를 결정하기위해 추정된 생리축 스트레치 를 중심으로 수행되었다. 힘 길이 시험은 추정된 축 스트레칭을 확인하고 기계적 성질이 생리적인 범위에서 정량화되었는지 확인하기 위하여 실시되었습니다. 실험 프로토콜은 발식에 있는 나이의 4-6 달에 비임신 한 뮤린 질 및 자궁 경부에 수행되었다.

프로토콜은 기저 톤과 수동 테스트의 두 가지 주요 기계 테스트 섹션으로 나뉩니다. 기저톤은 외부 국소, 호르몬 및 신경 자극(10)의 부재에도 평활근 세포의 기준선 부분수축으로 정의된다. 질과 자궁 경부의 이 기준선 수축성 성질은 압력 myograph 시스템에 의해 측정되는 특징적인 기계적 행동을 산출합니다. 수동 속성은 수축의 기준선 상태를 유지 하는 세포 간 칼슘을 제거 하 여 평가, 평활근 세포의 이완의 결과. 수동 상태에서 콜라겐과 엘라스틴 섬유는 장기의 기계적 특성에 대한 지배적 인 기여를 제공합니다.

뮤린 모델은 여성의 생식 건강에 있는 병리학을 공부하기 위하여 광범위하게 이용됩니다. 마우스는 생식 시스템11,12,13,14내에서 ECM 과 기계적 특성 사이의 진화하는 관계를 정량화하기 위한 몇 가지 이점을 제공한다. 이러한 장점은 짧고 잘 특성화 된 에스트로스 사이클, 상대적으로 저렴한 비용, 취급의 용이성 및 상대적으로 짧은 임신 시간15를포함한다. 부가적으로, 실험실 마우스의 게놈은 잘 매핑되고 유전자 변형 마우스는 기계론적가설을 테스트하는 귀중한 도구16,17,18.

시판되는 압력 myograph 시스템은 다양한 조직 및 기관의 기계적 반응을 정량화하기 위해 광범위하게 사용됩니다. 압력 근막 시스템에서 분석된 몇몇 주목할 만한 구조물은 탄성 동맥19,20,21,22,정맥 및 조직 공학된 혈관 이식편23,24, 식도25,대장26. 압력 근사진 기술은 기본 세포-ECM 상호 작용 및 생체 내 기하학을 유지하면서 축 방향 및 원주 방향에서 의 특성을 동시에 평가할 수 있게 합니다. 연조직 및 장기 역학에서 근엽 시스템을 광범위하게 사용했음에도 불구하고, 압력 근엽 기술을 활용한 프로토콜은 이전에 질과 자궁 경부를 위해 개발되지 않았습니다. 질 및 자궁 경부의 기계적 성질에 대한 사전 조사는27,28을단축으로 평가했다. 이 기관은, 그러나, 바디 29,30내의 다축 하중을 경험하고, 따라서 그들의 이축 기계적인 반응을 정량화하는 것이 중요합니다.

더욱이, 최근의 연구는 평활근 세포가 연조직 병리학5,28,31,32에서잠재적인 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이것은 네이티브 세포 매트릭스 상호 작용을 보존하기 때문에 압력 myograph 기술을 활용하는 또 다른 매력을 제공하므로 평활근 세포가 생리및 병리생리학적으로 재생되는 기여의 묘사를 허용합니다. 조건. 본 명세서에서, 우리는 기저톤 및 수동 조건 모두에서 질 및 자궁경부의 다축 기계적 특성을 정량화하는 프로토콜을 제안한다.

Protocol

Nulliparous 4-6 개월 여성 C57BL6J 마우스 (29.4 ± 6.8 그램) 이 연구에 사용 되었다. 모든 절차는 툴레인 대학의 연구소 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 납품 후에, 마우스는 안락사 의 앞에 1 주일 동안 적응하고 표준 조건 (12 시간 빛/어두운 주기)에서 수용되었습니다. 1. 에스트로스에서 마우스 희생 에스트로스 주기 결정: 에스트로스 사이클은 이전 연구<sup class…

Representative Results

여성 생식 기관의 기계적 특성을 성공적으로 분석하는 것은 적절한 장기 해부, 통조림 및 검사에 달려 있습니다. 어떤 결점없이 질에 자궁 경적을 이식하는 것이 필수적입니다(그림 1). 장기 유형에 따라 캐뉼라 크기가 다를수 있습니다 (그림 2). 실험 중에 장기가 움직일 수 없지만 시술 중에 장기의 벽을 손상시키지 않도록캐밀을 수행해야합니다…

Discussion

본 서에 제공된 프로토콜은 뮤린 질 및 자궁 경부의 기계적 성질을 결정하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜에서 분석된 기계적 특성에는 장기의 수동 및 기저 톤 조건이 모두 포함됩니다. 수동 및 기저 톤 조건은 기관이 침수되는 생화학 적 환경을 변경하여 유도됩니다. 이 프로토콜을 위해, 기초 시험에 관련시킨 매체는 칼슘을 포함합니다. 기저톤 상태를 테스트하면 여성 생식 기관 내의 평활근 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NSF 커리어 어워드 보조금 #1751050 의해 지원되었습니다.

Materials

2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer – 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors
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White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).
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