Denne protokollen benyttet et kommersielt tilgjengelig trykk myograph system for å utføre trykk myograph testing på murine vagina og cervix. Bruker Media med og uten kalsium, bidrag av glatt muskelceller (SMC) basal tone og passiv ekstracellulære matrise (ECM) ble isolert for organene under estimerte fysiologiske forhold.
Den kvinnelige reproduktive organer, spesielt vagina og cervix, er sammensatt av ulike cellulære komponenter og en unik ekstracellulære matrise (ECM). Glatte muskelceller viser en kontraktile funksjon innenfor vaginal og cervical vegger. Avhengig av biokjemiske miljø og mekaniske distensjon av orgel veggene, de glatte muskelceller endre kontraktile forhold. Bidraget av den glatte muskelceller under Baseline fysiologiske forhold er klassifisert som en basal tone. Mer spesifikt, en basal tone er Baseline delvis innsnevring av glatte muskelceller i fravær av hormonelle og neural stimulering. Videre gir ECM strukturell støtte til orgel veggene og fungerer som et reservoar for biokjemiske signaler. Disse biokjemiske Stikkordene er avgjørende for ulike organ funksjoner, for eksempel oppfordre vekst og opprettholde homeostase. ECM av hvert organ består hovedsakelig av kollagen fibre (for det meste kollagen typer I, III og V), elastiske fibre, og glykosaminoglykaner/proteoglycans. Sammensetningen og organiseringen av ECM dikterer de mekaniske egenskapene til hvert organ. En endring i ECM sammensetning kan føre til utvikling av reproduktive patologi, slik som bekken orgel prolaps eller prematur cervical remodeling. Videre kan endringer i ECM-mikrostruktur og stivhet endre jevn muskel celle aktivitet og fenotype, noe som resulterer i tap av kontraktile kraft.
I dette arbeidet, de rapporterte protokollene brukes til å vurdere basal tone og passive mekaniske egenskaper av nonpregnant murine vagina og cervix på 4-6 måneders alder i estrus. Organene ble montert i et kommersielt tilgjengelig trykk myograph og både trykk-diameter og Force-lengde tester ble utført. Eksempel data og dataanalyse teknikker for mekanisk karakterisering av reproduktive organer er inkludert. Slik informasjon kan være nyttig for å konstruere matematiske modeller og rasjonelt designe terapeutiske intervensjoner for kvinners helse patologi.
Den vaginal veggen består av fire lag, epitel, lamina propria, muscularis, og adventitia. Epitel er hovedsakelig sammensatt av epitelceller. Lamina propria har en stor mengde elastiske og fibrillær kollagen fibre. Muscularis er også sammensatt av elastin og kollagen fibre, men har en økt mengde glatte muskelceller. Adventitia består av elastin, kollagen og fibroblaster, riktignok i reduserte konsentrasjoner sammenlignet med tidligere lag. Den glatte muskelceller er av interesse for å biomekanisk motiverte forskningsgrupper som de spiller en rolle i kontraktile natur organer. Som sådan, Kvantifisere det glatte muskelen cellen område brøk og organisasjon er nøkkel å forståelse det mekanisk funksjonen. Tidligere undersøkelser tyder på at glatt muskel innhold i vaginal veggen er primært organisert i circumferential og langsgående aksen. Histologiske analyse tyder på at den glatte muskelområdet brøkdel er ca 35% for både proksimale og de flate delene av veggen1.
Livmorhalsen er en svært Collagenous struktur, som inntil nylig ble antatt å ha minimal glatt muskel celleinnhold2,3. Nyere studier har imidlertid antydet at glatte muskelceller kan ha en større overflod og rolle i livmorhalsen4,5. Livmorhalsen utstillinger en gradient av glatte muskelceller. Det indre OS behersker 50-60% glatte muskelen celler der hvor det ekstern OS bare behersker 10%. Mus studier imidlertid rapportere cervix å være sammensatt av 10-15% glatte muskelceller og 85-90% fiber bindevev uten omtale av regionale forskjeller6,7,8. Gitt at musen modellen er forskjellig fra den ofte rapporterte menneskelige modellen, videre undersøkelser om musen cervix er nødvendig.
Hensikten med denne protokollen var å belyse de mekaniske egenskapene til murine vagina og cervix. Dette ble gjort ved hjelp av en trykk myograph enhet som muliggjør vurdering av mekaniske egenskaper i circumferential og aksial retninger samtidig samtidig som innfødte celle-matrise interaksjoner og organ geometri. Organene ble montert på to tilpassede kanyler og sikret med silke 6-0 sting. Trykk-diameter testene ble utført rundt estimert fysiologisk aksial strekk for å bestemme samsvar og tangent moduli9. Force-lengde testene ble gjennomført for å bekrefte estimert aksial strekk og for å sikre at mekaniske egenskaper ble kvantifisert i det fysiologiske området. Den eksperimentelle protokollen ble utført på nonpregnant murine vagina og cervix på 4-6 måneders alder i estrus.
Protokollen er delt inn i to viktigste mekaniske test seksjoner: basal tone og passiv testing. En basal tone er definert som baseline delvis innsnevring av glatte muskelceller, selv i fravær av eksterne lokale, hormonelle, og neural stimulering10. Denne Baseline kontraktile natur vagina og cervix gir karakteristisk mekanisk adferd som deretter måles ved trykk myograph systemet. De passive egenskapene er vurdert ved å fjerne intercellulære kalsium som opprettholder den opprinnelige tilstanden av sammentrekning, noe som resulterer i avslapping av glatte muskelceller. I passiv tilstand, kollagen og elastin fibre gir den dominerende bidrag for mekaniske egenskaper av organene.
Den murine modellen brukes mye for å studere patologi i kvinners reproduktive helse. Musen har flere fordeler for å kvantifisere de utviklende relasjonene mellom ECM og mekaniske egenskaper innenfor reproduksjonssystemet11,12,13,14. Disse fordelene inkluderer korte og godt preget estrous sykluser, relativt lav kostnad, enkel håndtering, og en relativt kort svangerskaps tid15. I tillegg er det Genova av laboratoriet mus godt kartlagt og genetisk modifiserte mus er verdifulle verktøy for å teste mekanistisk hypoteser16,17,18.
Kommersielt tilgjengelige trykk myograph systemer brukes i stor utstrekning for å kvantifisere de mekaniske reaksjonene til ulike vev og organer. Noen bemerkelsesverdige strukturer analysert på trykk myographsystemet inkluderer elastisk arterier19,20,21,22, årer og vev konstruert vaskulær hud på23,24, spiserøret25, og den store tarmen26. Trykket myograph teknologien tillater samtidig vurdering av egenskaper i aksial og circumferential retninger samtidig opprettholde den innfødte Cell-ECM interaksjoner og in vivo geometri. Til tross for utstrakt bruk av myograph systemer i bløtvev og organ mekanikk, en protokoll utnytte trykket myograph teknologi hadde ikke tidligere blitt utviklet for vagina og cervix. Tidligere undersøkelser av mekaniske egenskaper i skjeden og cervix ble vurdert uniaxially27,28. Disse organene, men opplever multiaxial lasting i kroppen29,30, og dermed kvantifisere deres biaksiale mekanisk respons er viktig.
Videre antyder nyere arbeid glatte muskelceller kan spille en potensiell rolle i bløtvev patologi5,28,31,32. Dette gir en annen attraksjon for å utnytte trykket myograph teknologi, som det bevarer den innfødte celle-matrise interaksjoner, og dermed tillater avgrensning av bidraget som glatte muskelceller spille i fysiologiske og patofysiologiske Forhold. Heri, foreslår vi en protokoll for å kvantifisere multiaxial mekaniske egenskaper av vagina og cervix under både basal tone og passive forhold.
Protokollen som tilbys i denne artikkelen presenterer en metode for å bestemme de mekaniske egenskapene til murine vagina og cervix. De mekaniske egenskapene analysert i denne protokollen omfatter både passiv og basal tone forholdene i organene. Passive og basale tone forhold er indusert ved å endre det biokjemiske miljøet som orgelet er neddykket. For denne protokollen inneholder Media som er involvert i basal testing kalsium. Testing av basal tone tilstand tillater isolering av glatt muskel celle mekanisk bidrag in…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet var finansiert av NSF CAREER Award Grant #1751050.
2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |