Bu protokol, minür vajina ve serviks üzerinde basınç miyograf testi yapmak için ticari olarak mevcut basınçlı miyograf sistemi kullanılmıştır. Kalsiyumlu ve kalsiyumsuz ortamkullanımı, düz kas hücrelerinin katkıları (SMC) bazal tonu ve pasif ekstrasellüler matriks (ECM) tahmini fizyolojik koşullar altında organlar için izole edildi.
Kadın üreme organları, özellikle vajina ve serviks, çeşitli hücresel bileşenler vebenzersiz bir hücre dışı matris oluşur (ECM). Düz kas hücreleri vajinal ve servikal duvarlar içinde bir kontraktil fonksiyon sergiler. Biyokimyasal ortama ve organ duvarlarının mekanik distansiyonuna bağlı olarak, düz kas hücreleri kontraktil koşulları değiştirir. Temel fizyolojik koşullar altında düz kas hücrelerinin katkısı bazal tonu olarak sınıflandırılır. Daha spesifik olarak, bazal bir ton hormonal ve nöral stimülasyon yokluğunda düz kas hücrelerinin temel kısmi daralması olduğunu. Ayrıca, ECM organ duvarları ve biyokimyasal ipuçları için bir rezervuar olarak fonksiyonları için yapısal destek sağlar. Bu biyokimyasal ipuçları çeşitli organ fonksiyonları için hayati önem taşımaktadır, bu tür büyümeyi teşvik ve homeostaz bakımı gibi. Her organın ECM öncelikle kollajen lifleri oluşur (çoğunlukla kollajen türleri I, III, ve V), elastik lifler, ve glikozaminoglikanlar / proteoglikanlar. ECM’nin bileşimi ve organizasyonu her organın mekanik özelliklerini belirler. ECM bileşimindeki bir değişiklik, pelvik organ prolapsusu veya erken servikal remodeling gibi üreme patolojilerinin gelişmesine yol açabilir. Ayrıca, ECM mikroyapısı ve sertlik değişiklikleri düz kas hücre aktivitesi ve fenotip değiştirebilir, böylece kontraktil kuvvet kaybına neden.
Bu çalışmada, rapor edilen protokoller, estrus’ta 4-6 aylıkken gebe olmayan vajina ve serviksin bazal tonu ve pasif mekanik özelliklerini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Organlar ticari olarak kullanılabilen basınç miyografına monte edildi ve hem basınç çapı hem de kuvvet boyu testleri yapıldı. Üreme organlarının mekanik karakterizasyonu için örnek veriler ve veri analizi teknikleri dahildir. Bu tür bilgiler matematiksel modeller oluşturmak ve rasyonel kadın sağlığı patolojileri için terapötik müdahaleler tasarımı için yararlı olabilir.
Vajinal duvar dört tabakadan oluşur, epitel, lamina propria, muscularis, ve adventiti. Epitel öncelikle epitel hücrelerinden oluşur. Lamina propria elastik ve fibrillar kollajen lifleri büyük miktarda vardır. Kas da elastin ve kollajen lifleri oluşur ama düz kas hücrelerinin artan miktarda vardır. Adventiti elastin oluşur, kollajen, ve fibroblastlar, önceki katmanlara göre azaltılmış konsantrasyonlarda da olsa. Onlar organların kontraktil doğada bir rol oynamak gibi düz kas hücreleri biyomekanik motive araştırma grupları için ilgi vardır. Bu nedenle, düz kas hücre alanı fraksiyonu ve organizasyon sayısal mekanik fonksiyonu anlamak için anahtardır. Önceki araştırmalar vajinal duvar içinde düz kas içeriği öncelikle çevresel ve uzunlamasına eksende organize olduğunu göstermektedir. Histolojik analiz, düz kas alanı fraksiyonunun duvarın proksimal ve distal kesitleriiçin yaklaşık %35 olduğunu göstermektedir 1.
Serviks son derece kolajnöz bir yapıdır, yakın zamana kadar, minimal düz kas hücre içeriği olduğu düşünüldü2,3. Son çalışmalar, ancak, düz kas hücreleri serviks daha büyük bir bolluk ve rol olabileceğini ileri sürmüşlerdir4,5. Serviks düz kas hücrelerinin bir gradyan sergiler. Internal os dış işletim sistemi sadece% 10 içeren% 50-60 düz kas hücreleri içerir. Fare çalışmaları, ancak, serviks rapor oluşur 10-15% düz kas hücreleri ve 85-90% fibröz bağ dokusu bölgesel farklılıklar hiçbir söz ile6,7,8. Fare modelinin sık bildirilen insan modelinden farklı olduğu göz önüne alındığında, fare serviksi ile ilgili daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.
Bu protokolün amacı, murine vajina ve serviksin mekanik özelliklerini açıklamaktı. Bu, doğal hücre-matris etkileşimlerini ve organ geometrisini korurken aynı anda çevresel ve eksenel yönlerdemekanik özelliklerin değerlendirilmesini sağlayan bir basınçlı miyograf cihazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Organlar iki özel kanülüzerine monte edildi ve ipek 6-0 dikişile güvence altına alındı. Basınç çapı testleri uyum ve teğet modüler9belirlemek için tahmini fizyolojik eksenel streç etrafında yapılmıştır. Kuvvet uzunluğu testleri tahmini eksenel streç onaylamak ve mekanik özellikleri fizyolojik aralığında ölçüldü sağlamak için yapılmıştır. Deneysel protokol 4-6 aylık estrus’ta gebe olmayan murine vajina ve serviks üzerinde uygulandı.
Protokol iki ana mekanik test bölümüne ayrılmıştır: bazal ton ve pasif test. Bazal tonu düz kas hücrelerinin temel kısmi daralması olarak tanımlanır, dış lokal yokluklarda bile, hormonal, ve nöral stimülasyon10. Vajina ve serviksin bu temel kontraktil yapısı, daha sonra basınç miyograf sistemi ile ölçülen karakteristik mekanik davranışlar verir. Pasif özellikleri daralma temel durumunu koruyan hücreler arası kalsiyum kaldırarak değerlendirilir, düz kas hücrelerinin gevşemesi ile sonuçlanan. Pasif durumda, kollajen ve elastin lifleri organların mekanik özellikleri için baskın katkılar sağlar.
Murine modeli kadınların üreme sağlığıpatolojileri üzerinde yoğun olarak kullanılmaktadır. Fare üreme sistemi11,12,13,14içinde ECM ve mekanik özellikleri arasında gelişen ilişkileri ölçmek için çeşitli avantajlar sunuyor. Bu avantajlar kısa ve iyi karakterize ester döngüleri, nispeten düşük maliyet, kullanım kolaylığı ve nispeten kısa gebelik süresi15içerir. Ayrıca, laboratuvar farelerin genomu iyi eşlenmiş ve genetiği değiştirilmiş fareler mekanistik hipotezler16,17,18test etmek için değerli araçlardır.
Ticari olarak mevcut basınçlı miyograf sistemleri çeşitli doku ve organların mekanik tepkilerini ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Basınç miyograf sistemi üzerinde analiz bazı önemli yapılar elastik arterler dahil19,20,21,22, damarlar ve doku mühendislik vasküler greftler23,24, yemek borusu25, ve kalın bağırsak26. Basınç miyograf teknolojisi eksenel ve çevresel yönlerdeki özelliklerin eşzamanlı olarak değerlendirilmesini sağlarken, yerli hücre-ECM etkileşimlerini ve in vivo geometrisini korur. Yumuşak doku ve organ mekaniğinde miyograf sistemlerinin yaygın kullanımına rağmen, basınç miyografsı teknolojisini kullanan bir protokol daha önce vajina ve serviks için geliştirilmemiştir. Vajina ve serviksmekanik özellikleri önceki araştırmalar uniaksiyel27,28değerlendirildi . Bu organlar, ancak, vücut içinde multiaksiyel yükleme deneyimi29,30, böylece biaksiyel mekanik tepki niceliksel önemlidir.
Ayrıca, son çalışmalar düz kas hücreleri yumuşak doku patolojileripotansiyelbir rol oynayabilir düşündürmektedir 5,28,31,32. Bu, doğal hücre-matris etkileşimlerini koruduğu için basınç miyograf teknolojisini kullanmanın başka bir çekiciliği sağlar, böylece düz kas hücrelerinin fizyolojik ve patofizyolojik olarak oynadığı katkının belirtilmesine izin verir. Koşul -ları. Burada, vajina ve serviksin çok eksenli mekanik özelliklerini hem bazal ton hem de pasif koşullar altında ölçmek için bir protokol öneriyoruz.
Bu makalede verilen protokol, murine vajina ve serviksin mekanik özelliklerini belirlemek için bir yöntem sunmaktadır. Bu protokolde analiz edilen mekanik özellikler, organların hem pasif hem de bazal ton koşullarını içerir. Pasif ve bazal ton koşulları, organın sular altında kaldığı biyokimyasal ortamın değiştirilmesiyle indüklenir. Bu protokol için bazal testlerde yer alan ortam kalsiyum içerir. Bazal ton durumunutest kadın üreme organları içinde düz kas hücresi mekanik katkı izolasyon sa?…
The authors have nothing to disclose.
Çalışma NSF CAREER ödül hibe #1751050 tarafından finanse edilmiştir.
2F catheter | Millar | SPR-320 | catheter to measure cervical pressure |
6-0 Suture | Fine Science Tools | 18020-60 | larger suture ties |
CaCl2 (anhydrous) | VWR | 97062-590 | HBSS concentration: 140 mg/ mL |
CaCl2-2H20 | Fischer chemical | BDH9224-1KG | KRB concentration: 3.68 g/L |
Dextrose (D-glucose) | VWR | 101172-434 | HBSS concentration: 1000 mg/mL KRB concentration: 19.8 g/L |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | curved forceps |
Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | straight forceps |
Eclipse | Nikon | E200 | microscope used for imaging |
Flow meter | Danish MyoTechnologies | 161FM | flow meter within the testing apparatus |
Force Transducer – 110P | Danish MyoTechnologies | 100079 | force transducer |
ImageJ | SciJava | ImageJ1 | used to measure volume |
Instrument Cases | Fine Science Tools | 20830-00 | casing to hold dissection tools |
KCl | Fisher Chemical | 97061-566 | HBSS concentration: 400 mg/ mL KRB concentration: 3.5 g/L |
KH2PO4 | G-Biosciences | 71003-454 | HBSS concentration: 60 mg/ mL |
MgCl2 | VWR | 97064-150 | KRB concentration: 1.14 g/L |
MgCl2-6H2O | VWR | BDH9244-500G | HBSS concentration: 100 mg/ mL |
MgSO4-7H20 | VWR | 97062-134 | HBSS concentration: 48 mg/ mL |
Mircosoft excel | Microsoft | 6278402 | program used for spreadsheet |
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) | VWR | 97061-588 | HBSS concentration: 48 mg/mL KRB concentration: 1.44 g/L |
NaCl | VWR | 97061-274 | HBSS concentration: 8000 mg/mL KRB concentration: 70.1 g/L |
NaHCO3 | VWR | 97062-460 | HBSS concentration: 350 mg/ mL KRB concentration: 21.0 g/L |
Pressure myograph systems | Danish MyoTechnologies | 110P and 120CP | Pressure myograph system: prorgram, cannulation device, and controller unit |
Pressure Transducer | Danish MyoTechnologies | 100106 | pressure transducer |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | straight forceps |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | micro-scissors |
Tissue dye | Bradley Products | 1101-3 | ink to measure in vivo stretch |
Ultrasound transducer | FujiFilm Visual Sonics | LZ-550 | ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency |
VEVO2100 | FujiFilm Visual Sonics | VS-20035 | ultrasound used for imaging |
Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | larger scissors |