Summary
Vi beskriver vores protokol til måling af biologiske rytmer i protein katabolisme via autophagy og proteasomet i muse leveren.
Abstract
Celler anvender flere metoder til genanvendelse af uønskede proteiner og andet materiale, herunder lysosomale og ikke-lysosomale veje. Den vigtigste lysosome-afhængige vej kaldes autophagy, mens den primære ikke-lysosomale metode til protein katabolisme er ubiquitin-proteasome system. Nylige undersøgelser af modelorganismer tyder på, at aktiviteten af både autophagy og ubiquitin-proteasome systemet ikke er konstant hele dagen, men i stedet varierer i henhold til en daglig (døgnrytmen) rytme. Evnen til at måle biologiske rytmer i proteinomsætningen er vigtig for at forstå, hvordan cellulær kvalitetskontrol opnås, og for at forstå dynamikken i specifikke proteiner af interesse. Her præsenterer vi en standardiseret protokol til kvantificering af autophagic og proteasomal flux in vivo, som fanger den cirkadiske bestanddel af proteinomsætningen. Vores protokol indeholder detaljer for mus håndtering, vævs behandling, fraktionering og autophagic flux kvantificering ved hjælp af mus leveren som udgangsmateriale.
Introduction
Cirkadiske rytmer refererer til daglige, forudsigelige variationer i biologisk funktion, der er synlige i hele naturen. De findes på alle biologiske skala, fra makroskopiske adfærd som søvn-vågne cyklusser, at molekylære fænomener som den rytmiske overflod af biomolekyler. I de seneste år er forskningen i døgnrytmen blevet forvandlet ved opdagelsen af "urgener", der er afgørende for døgnrytmen. Undersøgelser i clock gene Knockout-mus har afsløret en central rolle for cirkadiske rytmer i timeligt organisere kerne cellulære processer såsom metabolisme1. Blandt de måder cirkadiske rytmer gøre dette ske, er ved at bibringe en tidsmæssig struktur til protein katabolisme.
Flere grupper herunder vores har vist, at de to store muligheder for cellulære protein katabolisme, autophagy og ubiquitin-proteasome system, er underlagt døgnrytmer2,3,4,5. Autophagy repræsenterer den lysosome-afhængige arm af protein katabolisme, hvor proteiner af interesse er leveret til denne nedbrydende organelle enten gennem opførelse af en roman vesikelprotein (macroautophagy) eller gennem direkte translokation selv en kanal (chaperone medieret autophagy)6. Det ubiquitin-proteasome system er den vigtigste ikke-lysosomale pathway, hvor proteiner er poly-allestedsnærværende og derefter fodret ind i proteasomet, en makromolekyle Nedbryd ende maskine findes i hele cytoplasmaet og Nucleus7,8. Rytmer i autophagic og proteasomal aktivitet er vigtige, fordi de sandsynligvis spiller en rolle i cellulære husholdning. Som et resultat, det er værdifuldt at have en standardiseret procedure, der kan detektere daglige svingninger i protein katabolisme, der er kompatibel med præ-kliniske sygdomsmodeller.
Her giver vi vores protokol til kvantificering af døgn udsving i autophagic flux i muselever, som har tjent som grundlag for arbejdet i vores laboratorium3,9. Vores metode er klassificeret som en "omsætnings analyse"10, en tilgang, der anvendes af talrige grupper til at måle proteolytisk aktivitet (eller flux). I denne fremgangsmåde administreres proteasehæmmere, der er specifikke for lysosomer eller proteasomer, til mus, og vævsprøverne fremstilles derefter efter et fast tidsinterval. Parallelt hermed opnås vævsprøver fra mus, der udsættes for Sham-injektioner. Vævsprøverne homogeniseret og derefter biokemisk separeret for at opnå de lysosom-berigede og cytoplasmiske fraktioner. Disse fraktioner analyseres derefter parallelt via Western blotting ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for makroautophagy markører (LC3b og p62) eller proteasomale substrater (Poly-ubiquitineret protein). Over tid akkumulerer dyr, der injiceres med proteasehæmmere, proteiner, som normalt ville være blevet genanvendt. Som følge heraf udledes omsætningshastigheden ved at sammenligne den overflod af markør proteiner i de proteasehæmmer-behandlede prøver med de Sham-behandlede prøver. Ved at gentage denne metode med faste tidsintervaller hele dagen er det muligt at rekonstruere cirkadiske variationer i proteolyse (figur 1a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den protokol, der er beskrevet her, blev godkendt af Washington University i St. Louis Animal Care og use Committee (IACUC).
1. mus boliger og eksperimentel design
- For at opdage daglige rytmer i proteinomsætningen, House mus (mandlig eller kvindelig C57BL/6J, 4 − 8 uge gammel, 20 − 25 g) under standard 12 h lys/mørke cyklusser med mad forudsat ad libitum. For at undgå at stressere dyrene, akklistre mus i mindst en uge i anlægget før brug og undgå enkelt hus. For at bevise, at rytmer i protein katabolisme er virkelig cirkadiske (dvs. drevet af dyrets interne biologiske ur), House mus under konstante mørke betingelser, at sørge for at undgå at udsætte mus til eksogen lys.
Bemærk: For detaljer om muse huse til døgnrytme eksperimenter Se følgende reference11. - For hvert tidspunkt fordeles tre mus som Sham-kontroller og mindst tre mus for hver type proteasehæmmer, der anvendes (leupeptin for autophagic flux og bortezomib for proteasomale flux-målinger). Plan lægge seks tidspunkter jævnt fordelt på 4 h intervaller på tværs af dag/nat cyklus for at opnå vævsprøver.
Bemærk: Et 24 timer, 6 tidspunkts eksperiment med fosfat-bufferet saltvand (PBS), leupeptin og bortezomib vil kræve i alt 54 mus (3 pr. behandling x 3 behandlinger x 6 tidspunkter).
2. fremstilling af homogenisering opløsning, inhibitor stamopløsninger, og hætteglas til mus lever indsamling
- Forbered frisk homogenisering buffer (HB) og holde på is: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM saccharose, 5 mM EDTA pH 8,0, og 1 proteasehæmmer tablet per 100 mL.
Bemærk: Der er behov for ca. 10 mL HB pr. mus. - Til downstream-behandling af biologiske prøver kræver hver prøve et 15 mL konisk rør til at holde den rå homogenate, et 15 mL rør til at holde den post-nukleare supernatant, to 1,5 mL mikrocentrifuge glas til at holde 3.000 x g og 20.000 x g pelleteret og et 1,5 mL mikrocentrifuge glas til at holde den cytoplasmiske fraktion. 7 mL kold HB tilsættes til hvert rør, som er beregnet til rå homogeniat, og som holdes på is.
- Forbered en 2 mg/mL stamopløsning af leupeptin Hemi-sulfat i steril PBS. Der bør også forberedes en 50 mg/mL opløsning af bortezomib i dimethylsulfoxid (DMSO). Alikvot og opbevar løsningerne ved-80 °C.
3. administration af proteasehæmmer
- Thaw leupeptin (2 mg/mL) og bortezomib (50 mg/mL) stamopløsninger til stuetemperatur 15 min før hvert tidspunkt. Leupeptin bestanden er klar til injektion. Bortezomib fortyndes i steril PBS for at give en 50 μg/mL arbejdsopløsning.
Bemærk: Bortezomib er let følsom, så Beskyt arbejds bestanden mod lys indtil brug. - Veje mus og udføre intraperitoneale injektioner af "Sham" PBS (0,5 mL), leupeptin (40 mg/kg) eller bortezomib (1,6 μg/kg). Returner mus til passende mærkede bure grupperet efter den type injektion, de har modtaget. Optag det tidspunkt, hvor musene behandles eller manipuleres i en standardiseret tabel (Se supplerende fil "eksempel data").
Bemærk: En dosis beregner er inkluderet som en hjælp i den supplerende fil "Sample data". Det er vigtigt at udføre injektioner hurtigt og i samme rækkefølge fra tidspunkt til tidspunkt for at minimere variabilitet.
4. vævs erhvervelse og oplagring
- To timer efter injektionen, aflive mus en ad gangen i overensstemmelse med den institutionsmæssigt godkendte iacuc protokol. For eksempel anæstetize mus derefter aflive ved livmoderhals dislokation. Fortsæt til dissektions trinnet umiddelbart efter euthanasia.
Bemærk: Sørg for komplet anæstesi før livmoderhalsen dislokation ved at klemme forreste poter uden en observerbare refleks. - Fjern den venstre lap af leveren ved at gøre en 1,5 til 2,0 cm indsnit med Metzenbaum saks på musens ventrale abdomen. Eksteralisere den venstre lap af leveren og punkt det med kirurgisk saks. Lever prøven nedsænkes i 7 mL iskold HB i et passende mærket 15 mL konisk rør. Opbevar prøven på is under hele behandlingen.
Bemærk: Prøverne kan opbevares på is eller ved 4 °C natten over, før de fortsætter. Hvis standard markører for macroautophagy og proteasomal aktivitet er de eneste tilsigtede udlæsninger, kan lever prøverne opfryses i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C til senere behandling. For at undersøge andre nedbrydnings mål (f. eks. via proteomics) skal prøverne behandles uden frysning. - Fortsæt til aflive og dissekere den næste mus, indtil alle prøver er erhvervet. Behandl mus i samme gruppe rækkefølge, som de blev injiceret, og Registrer varigheden af dette trin (Se supplerende fil "eksempel data"). Hver mus skal behandles i under 5 minutter for at begrænse forskellen i eksponerings tiderne for de injicerede hæmmere.
5. biokemisk fraktionering af Leverprøver
Bemærk: Figur 1b viser fraktionerings ordningen.
- Hver lever prøve og 7 mL HB overføres til en 15 mL-Dounce-homogenisator. Prøven homogeniseres med 10 strøg af det løse stempel og 15 streger af det stramme stempel. Returner den resulterende rå homogeni til det 15 mL koniske rør, den stammer fra. Gentages, indtil alle leverprøver er blevet homogeniseret.
- Spin rå homogenatet prøver ved 700 x g i 10 min ved 4 °c til pellet kerner og snavs. De øverste 4 mL post-nukleare supernatanten (S1) overføres til et frisk 15 ml konisk rør.
- Proteinkoncentrationen i fraktion S1 bestemmes ved hjælp af Bradford eller bicinchonininsyre (BCA) assays i henhold til fabrikantens anvisninger. Næste udligne koncentrationerne af alle prøver til 2,1 mg/mL eller til den ønskede koncentration ved at tilføje frisk HB til S1 , hvor det er nødvendigt. De normaliserede prøver er "total protein" (TOT) fraktion. Til analyseformål i senere produktionsled og kvalitetsforbedring, alikvot 500 μL af TOT -fraktionen og opbevares ved-80 °c.
- 1,5 mL af den resterende TOT -fraktion overføres til et mikrocentrifuge glas, og der centrifugeres ved 3.000 x g i 15 minutter ved 4 °c. 1 mL af den resulterende supernatanten (S2) overføres til et frisk mikrocentrifuge glas og sættes på is.
- Aspirer den resterende supernatanten og vask 3.000 x g pellet (3kp) to gange med 1,5 ml kold HB. 3Kp -pellet kan opbevares tørt ved-80 °c, hvis der forventes nedstrøms proteomics. Hvis der kun forventes vestlig blotting, resuspension 3Kp pellet i 200 μl natriumdodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side) prøve buffer (tabel over materialer) og kog ved 95 °c i 5 min.
- S2 -fraktionen centrifuger ved 20.000 x g i 20 minutter ved 4 °c. Den resulterende supernatanten (S3) overføres til et frisk mikrocentrifuge glas. S3 er den cytoplasmiske (cyto) fraktion. Til SDS-side kombineres 150 μL cyto fraktion med 50 ΜL 4X SDS-side prøve buffer og koges ved 95 °c i 5 min.
- Den resterende supernatanten aspirerer fra 20.000 x g pellet (20kp) og vaskes to gange med 1,5 ml kold HB. 20Kp -pellet kan opbevares tørt ved-80 °c, hvis der forventes nedstrøms proteomics. Hvis kun Western blotting forventes, resuspension 20Kp pellet i 100 ΜL af SDS-side prøve buffer og koge ved 95 °c i 5 min.
6. Western blotting udlæser
- For at kvantificere makroautophagic og proteasomal flux via Western blotting, komponere en stamopløsning af renset GST-LC3b (2 μg/mL), p62-hans6 (2 μg/ml), og lys48 forbundet Polyubiquitin (K48-UB, 50 μg/ml) i 1x SDS-side prøve buffer. Efter kogning ved 95 °C i 5 min, alikvot og opbevares ved-80 °C til fremtidig brug.
- På tidspunktet for SDS-side, generere en 6-punkts standardkurve af standard protein blandingen ved serielt fortynding 1:3 i 1x SDS-side prøve buffer. Der belastes 10 μL af hver standardkurve prøve på en 26-4-12% SDS-PAGE MIDI-gel, efterfulgt af præplettet protein standarder (tabel over materialer), en kommerciel molekylvægt standard.
- Til måling af autophagic flux, belastning 12 μL af 3Kp prøve i hver brønd.
Bemærk: Forudsat Sham, bortezomib, og leupeptin behandlinger blev udført og antager 3 mus per behandling, hvert tidspunkt bør bestå af 9 prøver. Derfor kan hver MIDI-gel rumme 2 tidspunkter plus standardkurven og et typisk tidsserie eksperiment vil kræve 3 MIDI-gels til aflæsning. - Til måling af proteasomal flux indlæses 12 μL cyto -fraktion i hver brønd.
- Separate protein prøver af SDS-side og overførsel til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner ved hjælp af standardprotokoller. Hvis Western blotting for LC3b forventes, overføre gels ved hjælp af 20% methanol-holdige overførsels buffer. Ellers skal du bruge 10% methanol-holdige overførsels buffer, da dette vil muliggøre en mere effektiv overførsel af høj molekylvægt protein arter.
- Udfør Western blotting ved hjælp af standardprotokoller. Til analyse af macroautophagic flux, blot membraner indeholdende 3Kp prøver med anti-p62 eller anti-LC3b antistoffer (1:1000) natten over ved 4 °c. Til analyse af proteasomale flux, blot membraner indeholdende cyto prøver med anti-lys48 specifik polyubiquitin (1:1000) natten over ved 4 °c.
- Image Western blots ved hjælp af standard sekundære antistoffer og Billeddannende enheder. Billede alle membraner, der udgør et givent tidsserie eksperiment sammen.
7. data analyse
Bemærk: Se supplerende fil "eksempel data".
- Hvis du vil udføre densitometri på de vestlige blot prøver, skal du bruge standardgrafik software, billed studie eller alternativt ImageJ.
- Udføre densitometriske målinger på interesse intervaller for både standardkurven og forsøgs prøverne. I Image Studio, ved hjælp af p62 som et eksempel, tegne en lang rektangel, der omfatter protein monomer i bunden og strækker sig til toppen af membranen. Kopiér, Indsæt og Flyt rektanglet til de resterende prøver. Det er vigtigt at holde det rektangel, der anvendes til kvantificering konsistent mellem prøverne.
- Gem kvantificeringen i et regneark ved at trykke på rapport og starte regneark nederst til højre i analysevinduet.
- Generer en densitometrisk standardkurve med regneark ved hjælp af den serielt fortyndede standardprøve og brug enten lineær eller polynomium regression for at opnå en bedst egnet standardkurve ligning. Ved hjælp af denne ligning ekstrapolere mængden af p62, LC3b-II eller lys48-poly UB i de eksperimentelle prøver.
- For at opnå flux-målinger trækkes den ekstruderede proteinmængde for hver inhibitor behandlet prøve fra den gennemsnitlige værdi af PBS-prøverne fra samme tidspunkt (Se supplerende fil "eksempel data").
- Evaluer den statistiske betydning af tidsmæssig variation i proteinomsætningen ved hjælp af 1-vejs ANOVA. Dette kan gøres ved hjælp af standard regnearkssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative data præsenteres i figur 2A, B, og kvantificeringen af disse data er angivet i figur 2C, D (Se også supplerende fil "eksempeldata"). For enkelhed, har vi ikke afbildet lastning kontrol i figur 2 , men disse bør opnås parallelt. Typisk, vestlige blots mod β-actin bruges til dette formål, men en total protein bejdser (såsom Ponceau S) vil være tilstrækkeligt. Den primære udlæser for autophagic flux på et givet tidspunkt er forskellen i mængden af makroautophagy specifikke markører (p62 eller LC3b-II) mellem de leupeptin-behandlede versus Sham prøver i lysosomet beriget 3KP fraktion divideret med 2 (antallet af timer mellem injektion af proteasehæmmer og vævs høst). Tilsvarende data kan fås fra 20KP prøver, som også er lysosomet beriget, men vores erfaring i mus leveren er, at det meste af signalet adskiller sig i 3KP fraktion. Typisk er resultaterne normaliseret til middelværdien, som forenkler sammenligningen på tværs af uafhængige eksperimenter (figur 2C, D). Den primære udlæser for proteasomal omsætning er forskellen i mængden af lys48-polyubiquitineret protein mellem de bortezomib-behandlede versus Sham-prøver i cytosolisk ("cyto")-brøken divideret med 2. Da p62 kan være et mål for både macroautophagy og proteasomet3, er en alternativ markør for proteasomal flux ændringen i p62 indhold +/-bortezomib i 3kp-fraktionen (Se eksempel data). Men vi finder denne markør er mindre robust i forhold til lys48-polyubiquitineret protein og er bedst bruges som støttende data.
Figur 1: eksperiment trin og prøve behandling. (A) skematisk af en typisk tidsserie eksperiment for at måle daglige rytmer i autophagic og proteasomal aktivitet (flux) i mus leveren. B) fraktionerings ordning for opnåelse af lysosom-beriget og cytosolisk lever protein fraktioner til Western blot-analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: prøve eksperimentelle resultater af flux. Western blots fra en repræsentativ tidsserie eksperiment for at måle daglige rytmer i autophagic flux (a), og proteasomale flux (B) i mus leveren. Bemærk, at under leupeptin-behandlede betingelser, p62 kører som stigen spænder fra den monomeriske form på omkring 50 kDa til SDS-stabile komplekser på omkring 250 kDa. Tidspunkter på dagen er afbildet i enheder af zeitgeber tid (ZT), hvor ZT0 repræsenterer lys på og ZT12 repræsenterer lys slukket. Observations tider, der falder i lyset, er sorte i skyggen. (C,D) Kvantificering af disse data. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SE (n = 3). Statistisk signifikans via en-vejs ANOVA er afbildet. Se venligst den supplerende fil "eksempel data" for en tabel gengivelse af disse data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil: eksempeldata. Laboratorieanalyse af densitometriske data og efterfølgende statistisk analyse. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores protokol beskriver en teknisk ligetil måde at måle biologiske rytmer i proteinomsætningen i mus ved hjælp af almindeligt tilgængelige molekylær biologi udstyr. På grund af varigheden af tidsserie eksperimenter og antallet af involverede biologiske prøver er det vigtigt at være konsekvent på tværs af hele forsøget med hensyn til, hvordan musene injiceres, timingen af vævs erhvervelse og den biokemiske behandling af Prøver. Injektion, eutanasi, og livmoderhals dislokation trin kan kræve operatør praksis før påbegyndelse af en fuld skala eksperiment. Det er bedst for en enkelt operatør til at udføre alle væv dissektioner, da forskellige individer dissekere ved forskellige hastigheder, men hvis dette er umuligt, kan det være umagen værd at øge tiden mellem proteasehæmmer injektion og vævs høst fra 2 h til 3 eller 4 h ( forudsat at dette sker konsekvent på tværs af tidspunkter).
Almindelige årsager til fejlfinding omfatter variabilitet i flux mellem biologiske replikatprøver og dårlig vestlig blot kvalitet. Med hensyn til prøve variabilitet kan dette skyldes brugen af flere operatører med forskellige dissekere hastigheder eller erfaringsniveauer. Dette kan afhjælpes ved at udføre øvelses eksperimenter, indtil de gennemsnitlige dissekting tider er mindre end 5 min pr. mus. Alternativt kan en enkelt operatør bruges til at udføre dissektioner. Høj baggrund på vestlige blots kan opstå fra ujævn overførsel, utilstrækkelig blokering, lav kvalitet primære antistof, eller utilstrækkelige vaske trin. De bedste resultater opnås ved over natten våd overførsel af SDS-side separerede protein prøver til PVDF i 10 − 20% methanol indeholdende overførsels buffer, ved hjælp af 10% fedtfri tørmælk til blokering, og omfattende vask mellem trin (3x 10 min minimum på en mekanisk rocker).
Denne teknik har flere begrænsninger. For det første kræver den beskrevne protokol et betydeligt antal dyr og er derfor ressourceintensiv. Mens et minimalt tidsserie eksperiment strækker sig over 24 timer, er eksperimenter med mindst 2 cyklusser ideelle til at bekræfte, at de daglige variationer, der observeres i proteinomsætningen, er reproducerbare, og til vurdering af rytme egenskaber som hyppighed og fase12 . Da tiden skal forløbe mellem, hvornår proteasehæmmere administreres til mus, og tids prøverne høstes (for at gøre det muligt at akkumulere proteolysemål), repræsenterer de opnåede omsætnings målinger en gennemsnitlig aktivitet over et interval på 2 timer snarere end et point estimat. Som et resultat, der er en grænse for den beslutning, denne analyse kan give til påvisning af dynamiske ændringer i protein katabolisme. Endelig, denne protokol er optimeret til mus leveren og den biokemiske fraktionerings procedure præsenteret her ville sandsynligvis nødt til at blive modificeret til effektivt at opnå lysosomer fra andre vævstyper.
Dette er den første metode til direkte at måle daglige rytmer i autophagic flux, der også muliggør proteome-dækkende observationer af dette fænomen. Fremtidige anvendelser af denne teknik omfatter analyse af proteolytiske rytmer i forskellige sygdomsmodeller, herunder autoimmunsygdom, kræft, og akut infektion. I hovedstol denne metode kan tilpasses andre mus organer og til forklarende humane prøver, som repræsenterer en spændende fremtidig anvendelse med høj translationel potentiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af RO1HL135846 og et tilskud til børns udviklingsinstitut (PD-II-2016-529).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W.
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L.
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P.
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
