Summary

Mätning av dygnsrytmen i autofagi och Proteasomal Flux

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

Vi beskriver vårt protokoll för mätning av biologiska rytmer i proteinkatabolism via autofagi och proteasomen i mus levern.

Abstract

Celler använder flera metoder för att återvinna oönskade proteiner och annat material, inklusive lysosomala och icke-lysosomala vägar. Den viktigaste lysosome-beroende vägen kallas autofagi, medan den primära icke-lysosomala metoden för proteinkatabolism är ubiquitin-Proteasome systemet. Nyligen genomförda studier i modellorganismerna tyder på att aktiviteten hos både autofagi och ubiquitin-Proteasome-systemet inte är konstant över dagen utan i stället varierar beroende på en daglig (dygnsrytmen) rytm. Förmågan att mäta biologiska rytmer i protein omsättningen är viktig för att förstå hur cellulär kvalitetskontroll uppnås och för att förstå dynamiken i specifika proteiner av intresse. Här presenterar vi ett standardiserat protokoll för att kvantifiera autofagi och proteasomen Flux in vivo som fångar den cirkadiska komponenten i protein omsättningen. Vårt protokoll innehåller information för mushantering, vävnads bearbetning, fraktionering och autofagi Flux-kvantifiering med hjälp av mus levern som utgångsmaterial.

Introduction

Dygnsrytmen avser dagliga, förutsägbara variationer i biologisk funktion som är uppenbar i naturen. De finns i varje biologisk skala, från makroskopiska beteenden som sömn-vakna cykler, till molekylära fenomen som den rytmiska överflöd av biomolekyler. Under de senaste åren har forskning om dygnsrytmen omvandlats genom upptäckten av “klockgener” som är avgörande för den dygnsrytm generationen. Studier i Clock Gene knockout möss har avslöjat en central roll för dygnsrytmen i temporally organisera centrala cellulära processer såsom metabolism1. Bland de sätt dygns rytmer göra detta hända är genom att förmedla en tidsmässig struktur till protein katabolism.

Flera grupper inklusive vår har visat att de två stora vägar för cellulära proteinkatabolism, autofagi och ubiquitin-Proteasome systemet, är föremål för dygnsrytm2,3,4,5. Autofagi representerar den lysosome-beroende armen av proteinkatabolism där proteiner av intresse levereras till denna nedbrytande organell antingen genom byggandet av en roman vesikel (macroautofagi) eller genom direkt flyttning om en kanal (Chaperone medierad autofagi)6. Den ubiquitin-Proteasome systemet är den viktigaste icke-lysosomala vägen, där proteiner är Poly-ubiquitinated och sedan matas in i Proteasome, en makromolekylär nedbrytande maskin som finns i hela cytoplasman och Nucleus7,8. Rytmer i autofagi och proteasomen aktivitet är viktiga eftersom de sannolikt spelar en roll i cellulära städning. Som ett resultat, det är värdefullt att ha en standardiserad procedur som kan upptäcka dagliga svängningar i proteinkatabolism som är kompatibel med prekliniska sjukdomsmodeller.

Här, vi tillhandahåller vårt protokoll för kvantifiering av dygns variationer i autofagi Flux i mus levern, som har fungerat som grund för arbete i vårt laboratorium3,9. Vår metod klassificeras som en “omsättning assay”10, en metod som används av många grupper för att mäta proteolytisk aktivitet (eller Flux). I denna metod ges proteashämmare som är specifika för lysosomer eller proteasomer till möss och därefter erhålls vävnadsprov efter ett fast tidsintervall. Parallellt med detta erhålls vävnadsprover från möss som utsätts för simulerade injektioner. Vävnadsproverna är homogeniserade och sedan biokemiskt separerade för att få lysosome-berikade och cytoplasmiska fraktioner. Dessa fraktioner analyseras sedan parallellt via Western blotting med antikroppar som är specifika för makroautofagi markörer (LC3b och P62) eller proteasomen substrat (poly-ubiquitinated protein). Med tiden, djur injiceras med proteashämmare ackumulera proteiner som normalt skulle ha återvunnits. Som ett resultat av detta kan omsättningen härledas genom en jämförelse av förekomsten av markör proteiner i de behandlade proverna från proteashämmare till de simulerade proverna. Genom att upprepa denna metod vid fasta tidsintervall över dagen är det möjligt att rekonstruera cirkadiska variationer i proteolys (figur 1a).

Protocol

Protokollet som beskrivs här godkändes av Washington University i St. Louis djuromsorg och användning kommittén (IACUC). 1. mus hus och experimentell design För att upptäcka dagliga rytmer i protein omsättningen, hus möss (manliga eller kvinnliga C57BL/6J, 4 − 8 vecka gammal, 20 − 25 g) under standard 12 h ljus/mörker cykler med mat som AD libitum. För att undvika att betona djuren, anpassa sig möss i minst en vecka i anläggningen före användning och undvik…

Representative Results

Representativa data presenteras i figur 2A, B, och kvantifieringen av dessa uppgifter finns i figur 2C, D (se även kompletterande fil “exempeldata”). För enkelhetens skull har vi inte avbildat lastnings kontrollerna i figur 2 , men dessa bör erhållas parallellt. Typiskt, västerländska blotting mot β-Actin används för detta ändamål, men en totalprotein fläck (såsom Ponce…

Discussion

Vårt protokoll beskriver ett tekniskt enkelt sätt att mäta biologiska rytmer i protein omsättningen hos möss som använder allmänt tillgänglig molekylärbiologisk utrustning. På grund av tidsseriens experiment och antalet biologiska prover är det viktigt att vara konsekvent i hela experimentet när det gäller hur möss injiceras, tidpunkten för vävnads förvärvet och den biokemiska bearbetningen av Prover. I stegen för injektion, eutanasi och cervikal dislokation kan det krävas operatörs övning innan ett…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades av RO1HL135846 och ett Children ‘ s Development Institute Grant (PD-II-2016-529).

Materials

4x SDS PAGE Sample Buffer Invitrogen Cat# NP0008
Bortezomib EMD Millipore Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7
Image Studio LICOR N/A
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron Merck Millipore Ltd Cat# IPFL00010
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb Cell Signaling Technology Cat#8081S; RRID:AB_10859893
LC3a Boston Biochem Cat# UL-430
LC3b antibody Novus Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146
LC3b antibody Cell Signaling Technology Cat#2775; RRID:AB_915950
Leupeptin Sigma Cat# L2884; CAS: 103476-89-7
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels Thermo Fisher Scientific Cat# WG1403BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Fisher Scientific Cat# NP0007
P62-his Novus Cat# NBP1-44490
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards Bio-Rad Cat# 1610373
Rabbit Anti-p62/SQSTM1 Millipore-Sigma Cat#P0067; RRID:AB_1841064
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) Boston Biochem Cat# UC-230
SDS-PAGE Midi-size Gels Invitrogen Cat# WG1403
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets Millipore-Sigma Cat# S8830

References

  1. Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
  2. Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
  3. Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
  4. Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
  5. Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
  6. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  7. Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
  8. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  9. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
  10. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  11. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
  12. Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).

Play Video

Cite This Article
Ryzhikov, M., Eubanks, A., Haspel, J. A. Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux. J. Vis. Exp. (151), e60133, doi:10.3791/60133 (2019).

View Video