Vi beskriver vårt protokoll för mätning av biologiska rytmer i proteinkatabolism via autofagi och proteasomen i mus levern.
Celler använder flera metoder för att återvinna oönskade proteiner och annat material, inklusive lysosomala och icke-lysosomala vägar. Den viktigaste lysosome-beroende vägen kallas autofagi, medan den primära icke-lysosomala metoden för proteinkatabolism är ubiquitin-Proteasome systemet. Nyligen genomförda studier i modellorganismerna tyder på att aktiviteten hos både autofagi och ubiquitin-Proteasome-systemet inte är konstant över dagen utan i stället varierar beroende på en daglig (dygnsrytmen) rytm. Förmågan att mäta biologiska rytmer i protein omsättningen är viktig för att förstå hur cellulär kvalitetskontroll uppnås och för att förstå dynamiken i specifika proteiner av intresse. Här presenterar vi ett standardiserat protokoll för att kvantifiera autofagi och proteasomen Flux in vivo som fångar den cirkadiska komponenten i protein omsättningen. Vårt protokoll innehåller information för mushantering, vävnads bearbetning, fraktionering och autofagi Flux-kvantifiering med hjälp av mus levern som utgångsmaterial.
Dygnsrytmen avser dagliga, förutsägbara variationer i biologisk funktion som är uppenbar i naturen. De finns i varje biologisk skala, från makroskopiska beteenden som sömn-vakna cykler, till molekylära fenomen som den rytmiska överflöd av biomolekyler. Under de senaste åren har forskning om dygnsrytmen omvandlats genom upptäckten av “klockgener” som är avgörande för den dygnsrytm generationen. Studier i Clock Gene knockout möss har avslöjat en central roll för dygnsrytmen i temporally organisera centrala cellulära processer såsom metabolism1. Bland de sätt dygns rytmer göra detta hända är genom att förmedla en tidsmässig struktur till protein katabolism.
Flera grupper inklusive vår har visat att de två stora vägar för cellulära proteinkatabolism, autofagi och ubiquitin-Proteasome systemet, är föremål för dygnsrytm2,3,4,5. Autofagi representerar den lysosome-beroende armen av proteinkatabolism där proteiner av intresse levereras till denna nedbrytande organell antingen genom byggandet av en roman vesikel (macroautofagi) eller genom direkt flyttning om en kanal (Chaperone medierad autofagi)6. Den ubiquitin-Proteasome systemet är den viktigaste icke-lysosomala vägen, där proteiner är Poly-ubiquitinated och sedan matas in i Proteasome, en makromolekylär nedbrytande maskin som finns i hela cytoplasman och Nucleus7,8. Rytmer i autofagi och proteasomen aktivitet är viktiga eftersom de sannolikt spelar en roll i cellulära städning. Som ett resultat, det är värdefullt att ha en standardiserad procedur som kan upptäcka dagliga svängningar i proteinkatabolism som är kompatibel med prekliniska sjukdomsmodeller.
Här, vi tillhandahåller vårt protokoll för kvantifiering av dygns variationer i autofagi Flux i mus levern, som har fungerat som grund för arbete i vårt laboratorium3,9. Vår metod klassificeras som en “omsättning assay”10, en metod som används av många grupper för att mäta proteolytisk aktivitet (eller Flux). I denna metod ges proteashämmare som är specifika för lysosomer eller proteasomer till möss och därefter erhålls vävnadsprov efter ett fast tidsintervall. Parallellt med detta erhålls vävnadsprover från möss som utsätts för simulerade injektioner. Vävnadsproverna är homogeniserade och sedan biokemiskt separerade för att få lysosome-berikade och cytoplasmiska fraktioner. Dessa fraktioner analyseras sedan parallellt via Western blotting med antikroppar som är specifika för makroautofagi markörer (LC3b och P62) eller proteasomen substrat (poly-ubiquitinated protein). Med tiden, djur injiceras med proteashämmare ackumulera proteiner som normalt skulle ha återvunnits. Som ett resultat av detta kan omsättningen härledas genom en jämförelse av förekomsten av markör proteiner i de behandlade proverna från proteashämmare till de simulerade proverna. Genom att upprepa denna metod vid fasta tidsintervall över dagen är det möjligt att rekonstruera cirkadiska variationer i proteolys (figur 1a).
Vårt protokoll beskriver ett tekniskt enkelt sätt att mäta biologiska rytmer i protein omsättningen hos möss som använder allmänt tillgänglig molekylärbiologisk utrustning. På grund av tidsseriens experiment och antalet biologiska prover är det viktigt att vara konsekvent i hela experimentet när det gäller hur möss injiceras, tidpunkten för vävnads förvärvet och den biokemiska bearbetningen av Prover. I stegen för injektion, eutanasi och cervikal dislokation kan det krävas operatörs övning innan ett…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av RO1HL135846 och ett Children ‘ s Development Institute Grant (PD-II-2016-529).
4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
Image Studio | LICOR | N/A | |
Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |