Summary
여기서 우리는 견고한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 일관되게 생성하고 그 기능을 특성화하는 방법을 설명하고 검증한다. 이러한 기술은 신호 경로에 대한 기계적 통찰력을 개발하고, 대규모 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공하고, 심장 질환을 안정적으로 모델링하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)는칼슘(Ca2+)취급 및 신호 전달 경로뿐만 아니라 고처리량 약물 스크리닝 및 독성 분석의 기초 과학을 연구하기 위한 귀중한 인간 소스를 제공합니다. 본 명세서에서, 우리는 상이한 세포주 전반에 걸쳐 분자 및 기능적 특성을 일관되게 재현할 수 있는 고품질 iPSC-CM을 생성하는 데 사용되는 방법론에 대한 상세한 설명을 제공한다. 또한Ca2+ 처리 특성의 평가를 통해 기능적 특성화를 안정적으로 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 낮은 산소(O2)조건, 젖산 선택, 그리고 배양에서 장기간 시간은 고순도 및 고품질 심실 과 같은 심근 세포를 생성합니다. 고립 된 성인 쥐 심근 세포 (ARCMs)와 유사하게, 3 개월 된 iPSC-CMS는 더 높은 Ca2 + 진폭, Ca2 + 재섭취 (부패 - 타우)의 빠른 속도 및 30 iPSC-CS에 비해 β-아드레날린 자극에 대한 긍정적 인 감수성 반응을 나타낸다. 이 전략은 기술적으로 간단하고 비용 효율적이며 재현 가능합니다. 이 제품은 심장 질환을 모델링하고 Ca2+ 취급 단백질을 대상으로 하는 대규모 약물 스크리닝을 위한 견고한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)는 시험관내1, 2,3,4,5,6,7, 8에서다양한 심장 질환을 모델링하는 매력적인 인간 기반 플랫폼이다. 더욱이, iPSC-CM은 신규 또는 기존 약물에 대한 환자 반응의 예측, 히트 화합물을 스크리브하고, 새로운 맞춤형 약물을 개발하는 데 사용될 수있다 9,10. 그러나 상당한 진전이 있음에도 불구하고 iPSC-CM11을사용할 때 몇 가지 제한 사항과 과제를 고려해야 합니다. 따라서, 심장 분화 프로토콜을 개선하고, iPSC-CM의 효율및 성숙을 향상시키고, 특정 심근세포 아류형(심실, 심방 및 결절)을 생성하는 방법은 이미 이러한 장애물을 극복하기 위한 수많은 배양 전략으로 이어졌으며12,13,14,15.
이러한 프로토콜의 견고성에도 불구하고 iPSC-CM의 사용에 대한 주요 관심사는 동일한 성능과 재현 가능한 결과를 보장할 수 있는 고품질 심근세포를 얻기 위한 길고 복잡한 절차의 재현성입니다. 재현성은 세포주를 다른 유전적 배경과 비교할 때뿐만 아니라 동일한 세포주의 세포주 및 분자 비교를 반복할 때도 중요합니다. iPSCs 밀도의 잘-투-웰 차이와 같은 세포 가변성은 심장 분화에 영향을 미칩니까, 낮은 수율 및 가난한 품질의 심근세포를 생성할 수 있습니다. 이러한 셀은 여전히 CM의 순수한 모집단을 필요로 하지 않는 실험을 수행하는 데 사용될 수 있습니다(예:Ca2+ 과도 측정을 수행할 때). 실제로, 전기 생리학적 분석을 수행할 때, 비MC는 자발적으로나 전기 자극하에서도 이길 수 없으므로 분석에서 제외하기가 쉽습니다. 그러나, 가난한 품질 때문에, iPSC-CM은 그들의 유전 메이크업 때문이 아닌 변경된 전기 생리학적 특성(예를 들면, 불규칙한Ca2+ 과도, 낮은Ca2+ 진폭)을 보여줄 수 있습니다. 따라서 특히 iPSC-CM을 사용하여 심장 질환을 모델링할 때, 품질이 떨어지는 CM의 결과를 질병 표현형과 혼동하지 않는 것이 중요합니다. 전기 생리학 연구를 진행하기 전에 신중한 스크리닝 및 배제 과정이 필요합니다.
이 방법은 고순도 및 고품질 심근 세포생성및 칼슘 및 수축성 획득 및 분석 시스템을 사용하여Ca2+ 과도 측정을 수행하여 그 기능을 평가하기 위해 최적화된 프로토콜을 포함합니다. 이 기술은 간단하면서도 강력한 방법으로 고효율과 저효율 iPSC-CM 제제를 구별하고 인간 iPSC-CM의 생리학적 특성을 보다 생리적으로 관련시화합니다.
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Protocol
이 연구에서 성인 쥐 심근세포를 이용한 실험은 시나이 산의 아이칸 의과 대학의 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜로 진행되었습니다. 성인 쥐 심근세포는 앞서설명한 바와같이 랑엔도르프 계 법에 의해 스프라그 다울리 쥐 하트로부터 분리되었다.
1. 미디어 준비
- hiPSC 미디어를 준비합니다.
- 보충제와 기저 매질을 실온(RT)으로 평형화합니다. 보충 완전히 해동 되어 있는지 확인. 0.22 μm 진공 구동 필터를 사용하여 기저 배지의 400 mL및 100 mL의 보충제 및 필터를 혼합합니다. 사용하기 전에 4 °C에서 보관하고 RT에 평형화하십시오.
- RPMI + B27을 준비합니다.
- B27 보충 및 기초 매체를 평형 (RPMI 1640) RT. 보충 완전히 해동 되어 있는지 확인. 0.22 μm 진공 구동 필터를 사용하여 기저 배지의 490 mL과 50x 보충제의 10 mL를 혼합하고 필터를 혼합합니다. 사용하기 전에 4 °C에서 보관하고 RT에 평형화하십시오.
- RPMI + B27 (-) 인슐린을 준비하십시오.
- B27 (-) 인슐린 보충 및 기저 매체 (RPMI 1640) RT. 보충 완전히 해동 되어 있는지 확인. 0.22 μm 진공 구동 필터를 사용하여 기저 배지의 490 mL과 50x 보충제의 10 mL를 혼합하고 필터를 혼합합니다. 사용하기 전에 4 °C에서 보관하고 RT에 평형화하십시오.
- 선택 매체 (RPMI (-) 포도당 + B27 + 젖산염)을 준비합니다.
- B27 보충 및 기저 매체를 평형 (RPMI 1640 (-) 포도 당) RT. 보충 완전히 해동 되어 있는지 확인. 기저 배지 490 mL과 50x 보충제의 10 mL을 혼합하고 멸균수로 구성된 4 mMM 젖산 나트륨을 추가하고 0.22 μm 진공 구동 필터를 사용하여 필터를 추가합니다. 사용하기 전에 4 °C에서 보관하고 RT에 평형화하십시오.
- RPMI 20을 준비합니다.
- 기저 배지(RPMI 1640)를 RT. 혼합 태아 소 혈청(FBS) (최종 농도 20%) 및 RPMI를 평형화한다. 0.22 μm 진공 구동 필터를 사용하여 필터를 사용하여 4 °C에 보관하십시오. 사용하기 전에 RT에 평형화하십시오.
- hiPSC 매체에 단백질 키나아제(ROCK) 억제제(2 μM 최종 농도)를 함유하는 로-관련 코일 코일을 첨가하여 패싱 매질을 준비한다.
- GSK-3 억제제, CHIR 99021을 RPMI+ B27(-) 인슐린 매체(10 μM 최종)에 첨가하여 D0 용지를 준비한다.
- RPMI + B27 (-) 인슐린 매체를 IWR-1 (5 μM 최종)과 혼합하여 D3 및 D4 매체를 준비한다.
참고: D1 및 D5 매체는 RPMI+ B27(-) 인슐린으로 구성된다. D7 매체는 RPMI + B27로 구성된다. - 차단 버퍼 (2% 소 혈청 알부민 [BSA], 2% FBS, 인산염 완충 식염수 [PBS]에서 0.05% NP-40을 준비하십시오: 50 mL 원추형 튜브에 BSA 1 g, FBS 1 mL, PBS 49 mL, NP-40 의 250 μL을 추가합니다. 완전히 녹을 때까지 섞으세요.
2. 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 자격 매트릭스 코팅 플레이트 및 커버슬립의 준비
참고: 멸균 된 조직 배양 후드 에서 모든 단계를 수행하십시오.
- 4 °C에서 얼음에 하룻밤 hESC 자격을 갖춘 매트릭스 스톡 솔루션을 해동. 재고에 따라 다를 수 있으므로 적절한 aliquot 볼륨을 확인하려면 제품 사양 시트를 참조하십시오. 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 -20 °C에서 이러한 알리쿼트에 저장합니다.
- 코팅 플레이트 또는 유리 커버립에 매트릭스를 사용하기 위해, 먼저 30 분 동안 4 °C에서 hESC 정규화 매트릭스의 aliquot를 해동.
- Aliquot 24 차가운 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) : 영양 혼합물 F-12 (DMEM / F : 12) 배지를 50 mL 원추형 튜브에 넣습니다.
- 차가운 DMEM/F:12 용지를 2mL 유리 파이펫과 혼합하여 파이펫 표면을 식힙니다.
- 동일한 파이펫을 사용하여 약 500-700 μL의 콜드 DMEM/F:12를 차지하며 미세원심지 튜브 자체 내에서 hESC 인증 매트릭스 aliquot와 혼합합니다.
- 제대로 혼합되면, 차가운 DMEM / F : 12를 포함하는 50mL 원추형 튜브에 용액을 전송하고 다시 혼합.
- 표준 6 웰 플레이트의 경우, 각 우물에 이 혼합물의 1 mL을 추가하십시오. 우물이 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 적어도 30 분 동안 조직 배양 후드 아래에 RT에 접시를 둡니다. 원하는 경우, 도금 직후 4°C에서 최대 1주간 보관하고 사용 하기 전에 30분 동안 RT에 평형화하십시오.
- 플레이트를 사용하려면 매트릭스를 흡인하고 적절한 매체로 교체하십시오. 즉시 사용하십시오.
- 유리 커버슬립을 멸균 환경(예: 멸균 조직 배양 후드 내부)에 보관합니다.
- 코팅하기 전에 70% 에탄올로 각 커버슬립을 닦으소. 커버슬립이 마르면 멸균 된 6 웰 플레이트의 우물 안에 놓습니다.
- hESC 인증 매트릭스 용액의 250-300 μL을 가지고 조심스럽게 유리 커버 슬립의 중앙에 직접 분배하십시오. 사용 전에 적어도 30 분 동안 조직 배양 후드 아래에 RT에 덮개 입술을 둡니다.
3. 소분자의 준비
참고: 달리 명시되지 않는 한 DMSO의 모든 소분자 및 Wnt 변조기를 재구성합니다.
- IWR-1 및 CHIR 99021 각각 25 μL의 10 mM aliquots를 준비하고 -20 °C에서 보관하십시오.
- 티아조비빈(ROCK 억제제)의 각각 50 μL의 10 mM aliquots를 재구성하고 -20°C에서 저장한다.
4. iPSCs의 유지 보수 및 통과
참고: 멸균 조직 배양 후드 아래에서 다음 단계를 모두 수행합니다.
- 표준 6 웰 플레이트에서 iPSC를 유지하고 멸균 조건하에서 모든 단계를 수행하십시오. 잘 당 hiPSC 매체의 2 mL로 세포를 유지합니다. 격일로 미디어를 변경합니다. 세포를 37 °C, 6 % O2,5 % CO2에서유지하십시오. 그들은 사이 있을 때 세포를 통과 70-80% confluent.
- CA 없이 PBS를 평형2+ 및 Mg2+ RT에.
- 통과 프로세스를 시작하려면 통과해야 하는 웰에 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 PBS 1mL를 추가합니다. 7-10 분 동안 RT에서 배양. PBS 처리가 단층의 완전한 해리귀가 발생하지 않았는지 확인하기 위하여 현미경 의 밑에 세포를 검사하십시오.
- PBS를 제거하고 1mL의 패시징 용지로 교체합니다. 셀 리프터를 사용하여 웰 표면에서 세포를 부드럽게 긁어 내고 들어 올립니다.
- 멸균 2 mL 유리 파이펫을 사용하여 세포를 기계적으로 해리시다. 현미경으로 관찰될 때 세포가 작은 콜로니로 고르게 해리될 때까지 반복합니다.
- 세포가 충분히 해리되면 5 mL의 패서딩 미디어를 추가하여 셀을 1:6으로 분할합니다. 기본 분할 비율에 맞게 추가할 패시징 미디어의 양을 조정합니다.
- hESC 정규화 매트릭스 코팅 플레이트에서 hESC 정규화 매트릭스를 흡인하고 웰당 1 mL의 패싱 매체로 교체합니다. 잘 당 해리 세포의 1 mL를 추가합니다.
5. 심근 세포 분화
- 잘 확립된 hiPSC 라인(20개 이상의 구절)을 사용하고 심장 분화를 시작하기 전에 균일한 형태를 나타낸다.
- iPSC가 약 70-80% 동률인지 확인합니다.
- Ca2+ 및 Mg2+없이 PBS에서 세포를 1x 세척하십시오.
- 웰당 2 mL의 D0 매질(단계 1.7)을 추가하고 세포를 인큐베이터로 다시 옮니다.
- 24 시간 후, 48 시간 동안 웰 당 3 mL의 D1 미디어로 교체하십시오.
- 3일째에는 미디어를 웰당 2mL의 D3 용지로 교체합니다. 4일째에 D4 미디어를 반복합니다.
- 5일째에는 미디어를 웰당 3mL의 D5 용지로 교체합니다.
- 7일째에, 매질3 mL의 D7 용지를 웰당 3 mL로 교체하고 37°C, 5%CO2및 정상O2 농도로 인큐베이터로 옮김을 전달한다. 2일마다 D7(RPMI + B27) 미디어를 교체합니다.
6. 선택 절차 및 iPSC-CM 해리
- Ca2+ 과도 측정 또는 기능 분석을 수행하기 10일 전에 RPMI + B27 용지를 웰당 3 mL의 선택 매체로 48시간 동안 교체하십시오.
- 다른 48 시간 동안 3 mL의 선택 매체로 미디어를 교체하십시오.
- 24 시간 동안 잘 당 RPMI + B27 미디어의 2 mL로 미디어를 교체합니다.
- 단2에 기재된 바와 같이 코트 표준 6 웰 플레이트.
- 각 우물에 EDTA가 있는 멸균 0.25% 트립신 1 mL를 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 1,000 μL 파이펫을 사용하여 현미경으로 관찰할 때 단일 세포를 볼 수 있도록 세포를 기계적으로 해리시면 됩니다.
- 세포를 멸균 된 15 mL 원점 튜브로 옮기고 웰 당 RPMI 20 매질 2 mL을 추가하십시오. 800 x g에서5 분 동안 원심 분리기 .
- 상판을 흡인하고 RPMI + B27 매질에서 세포를 다시 중단한다. 플레이트에서 hESC 정규화 매트릭스를 흡인하고 RPMI + B27 용지 1 mL로 교체하십시오.
- 1,000 mL 파이펫 팁을 사용하여 용액이 균일하게 나타날 때까지 세포 펠렛을 기계적으로 해리시면 됩니다.
- 각 우물에 대략 500,000개의 세포를 전송합니다. 24 시간 동안 인큐베이터로 옮김을 옮김으로 옮김하십시오.
- 48시간 동안 웰당 3mL의 선택 용지로 미디어를 교체합니다.
- 미디어를 웰당 3mL의 RPMI + B27로 교체하십시오. D7 용지(RPMI + B2)에서 세포를 기능 분석을 위해 준비될 때까지 2일마다 매 번 미디어를 변경합니다.
7. 유세포 세포 측정을 위한 iPSC-CM의 준비
- 세포가 원하는 나이에 있고 신진 대사 선택을 겪으면 (섹션 6), Ca2 + 및 Mg2 +없이 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 트립신 1mL를 0.25% 추가하고 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다.
- P1000 팁으로 혼합물을 5-10x피펫하여 세포를 특이화하고, RPMI 20의 2 mL을 함유하는 15 mL 튜브로 이송한다.
- 600 x g에서 5 분 동안 세포를 돌이꿉다.
- 100 μL의 고정 용액 (4 % PFA)을 세포 펠릿에 추가하십시오. 연속적이고 부드러운 소용돌이로 용액을 떨어 뜨리고 15 분 동안 얼음에 놓습니다.
- PBS의 1.5 mL를 추가합니다. 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 상월체를 흡인합니다.
- 모든 실험에 대해 고정/투과 조건당 하나의 얼룩지지 않은 제어를 포함합니다.
- RT에서 30분 동안 차단 용액 500 μL(PBS에서 2% FBS/2% BSA, 0.1% NP-40)으로 세포를 다시 중단합니다.
- 차단 용액을 제거하지 않고 1차 항체 MLC2V/MLC2A(5 mg/mL)를 추가하고 RT에서 45분 동안 배양합니다.
- 블로킹 버퍼로 씻으시다. 원심 분리 및 흡인 용액으로 세포를 수집합니다.
- 이차 항체 알렉사 플루어 555/488(1:750)을 RT에서 45분 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 차단 완충액에 희석하였다.
- PBS의 1.5 mL를 추가합니다. 원심 분리 및 흡인 용액으로 세포를 수집합니다.
- PBS의 250-300 μL에서 세포를 다시 중단. P1000 파이펫을 사용하여 셀을 분해합니다.
- 35 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너 캡으로 둥근 바닥 튜브를 준비합니다. 50 μL의 PBS로 세포 스트레이너를 미리 적시고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 분해 된 세포로 용액을 세포 스트레이너 캡이있는 둥근 하단 튜브로 옮니다. 셀 용액이 자연스럽게 배수되도록 하거나 필요에 따라 평평한 표면에 튜브 바닥을 탭하여 튜브에 세포의 완전한 배수 및 수집을 보장하십시오. 가능한 한 빨리 튜브를 얼음 위에 다시 놓아 두십시오.
- 250 μL의 PBS로 세포 스트레이너를 헹구어 잔류 세포를 회복하십시오.
- 유세포 분석이 될 때까지 얼음 에 튜브를 유지하고 알루미늄 호일로 덮습니다.
8. 유리 커버슬립에 심근세포 도금
참고: 멸균 환경에서 모든 단계를 수행합니다.
- 단계 2.10 및 2.11에 설명된 대로 유리 커버슬립을 준비합니다.
- iPSC-CM이 선택되고 원하는 연령이 되면 6.5-6.7 단계를 수행하여 iPSC-CM을 해리합니다.
- 상판을 흡인하고 250 μL 당 약 300,000 개의 세포를 갖도록 충분한 양의 RPMI 20 미디어에서 세포를 재중단시.
- 2 mL 유리 파이펫을 사용하여 용액이 균일하게 나타날 때까지 세포 펠렛을 기계적으로 해리시면 됩니다.
- 커버슬립에서 hESC 정규화된 매트릭스를 흡기합니다.
- 1000 μL 파이펫을 사용하여 15 mL 원엽 튜브에서 용액의 250 μL을 혼합하고 당깁니다.
- 용액의 250 μL을 유리 커버슬립에 천천히 분배하고 hESC 인증 매트릭스 코팅이 존재하는 영역에만 추가하도록 세심한 주의를 기울입니다.
- 인큐베이터에 조심스럽게 옮기고 밤새 방치하고, 세포를 흔들거나 퍼뜨리지 않도록주의하십시오. 다음날 아침, 커버슬립으로 D7(RPMI + B27) 용지 2mL를 부드럽게 추가합니다. 24 시간 후 와 그 후 2 일마다 미디어를 변경합니다.
9. 세포 고정
- Ca2+ 및 Mg2+가 있는 적절한 양의 PBS가 4°C에 균형을 이루는지 확인합니다.
- CA2+ 및 Mg2+로 PBS에서 희석된 4% 파라포름데히드(PFA) 용액을 준비하고 4°C까지 평형화합니다.
- iPSC-CM이 적절한 나이에 도달하면, 신진 대사 선택 (섹션 6)을 겪고, 커버 립 (섹션 8)에 도금 된 후, Ca2 + 및 Mg2 +로 차가운 PBS 1 mL로 세포를 3 x 씻어 내십시오.
- 차가운 4% PFA 1 mL을 추가하고 15 분 동안 후드 아래에 RT에 세포를 둡니다.
- 차가운 PBS로 세포를 씻어 과잉 PFA를 제거합니다.
- Ca2+ 및 Mg2+로 2 mL의 PBS를 추가하고 4 °C에서 보관하십시오.
10. 면역형광 염색
- 고정 된 셀에서 PBS를 제거하고 차단 버퍼의 1 mL을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 차단 버퍼를 제거하고 차단 버퍼에 희석 된 기본 항체 (5 mg / mL)를 추가하십시오. 4 °C에서 밤새 배양.
- 각각 5분 동안 CA2+와 Mg2+로 PBS에서 3x를 씻으십시오.
- 블로킹 버퍼에서 희석된 이차 항체를 1:1,000추가합니다.
- 알루미늄 호일로 접시를 덮어 빛으로부터 보호하고 RT에서 45 분 동안 배양하십시오.
- CA2+ 및 Mg2+5 분 각각 PBS에서 3 x를 씻으십시오.
- 세포를 완전히 커버하고 RT에서 10 분 동안 배양하기에 충분한 양의 DAPI 작업 솔루션을 추가하십시오.
- CA2+ 및 Mg2+로 PBS로 샘플을 철저히 세척하여 과도한 DAPI를 제거합니다.
- 새 유리 슬라이드를 가지고 중간에 장착 매체를 한 방울 추가합니다. 드롭퍼를 사용하여 마운팅 미디어를 균등하게 분산시려면 셀이 슬라이드에 아래를 향하게 하여 덮개 를 놓습니다.
참고: 빛으로부터 보호되는 경우 30일 동안 셀을 보관할 수 있습니다.
11. 세포 내 Ca 의 평가2+ 과도
- iPSC-C가 생후 3개월 이상이되면, 대사 선택(섹션 6)을 거쳤고, 커버립에 도금되고, 2 μL의 Fura-2, AM(최종 농도: 1 μM)으로 치료하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
참고: Fura-2는 빛에 민감합니다. 어둠 속에서 모든 로딩 절차와 실험을 수행합니다. - 칼슘 및 수축성 획득 및 분석 시스템을 준비합니다.
- 아크 램프가 시작되도록 시스템에 전원을 공급합니다(그림1B).
- 시스템에 챔버를 놓고 도 1C에도시된 바와 같이 펌프로부터 적절한 입구 및 출구와 전선을 자극기에서 챔버로 연결한다.
- 37°C의 Tyrode 용액으로 유체 인라인 히터를 통과하는 관류 튜브를 채웁니다.
- 카메라와 조리개 치수를 조정하여 배경 영역을 최소화합니다.
- iPSC-CM이 있는 유리 커버슬립을 챔버에 장착하고 고정합니다.
- Tyrode 용액 500 μL을 체결된 유리 커버 슬립 바로 위에 넣고 Tyrode 용액으로 챔버(1.5 mL/min)를 정독하기 시작합니다.
- 전기 자극기 (10 V, 4 ms)를 사용하여 1 Hz 필드 자극을 가진 페이스 iPSC-CM.
- 세포가 Fura-2 염료를 세척하고 환경에 적응하고 형광 염료를 씻어 내기 위해 적어도 3-5 분 동안 자극을 가진 챔버에서 iPSC-CM을 인큐베이팅.
- 보기 창을 유리 커버슬립의 왼쪽 위쪽 영역으로 조정합니다.
- 녹화를 시작합니다.
- 5-10 피크의 일관된 스트림을 수집한 후 일시 중지를 클릭하여 녹화를 일시적으로 중지합니다.
- 보기 창의 초점이나 치수가 변경되지 않도록 하고 현미경의 스테이지를 인접 영역으로 이동하여 반대쪽 끝으로 이동하고 녹화를 다시 시작합니다.
- 11.9 단계와 11.10 단계를 반복하여 커버 슬립을 가로 질러 스캔한 다음 처음에는 왼쪽으로 이동한 다음 지그재그 방식으로 아래쪽으로 이동하여 전체 커버 슬립 영역을 덮습니다. 이는 커버슬립당 80-100개의 측정으로 구성됩니다.
참고: 보조 요인으로 인해 Ca2+ 과도가 감소하기 때문에 총 측정 시간을 10분으로 제한합니다. - Ca2+ 과도 전환이 획득되면 제조업체의 지침에 따라 형광 추적 분석 소프트웨어로 데이터를 분석합니다.
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Representative Results
그림1A에 기술된 프로토콜은 배양 시간적 시간으로 심실/성인과 같은 표현형을 획득하는 고도로 순수한 심근세포를 생성했다. 심방 및 심실 미오신 조절 광계 2에 대한 면역형광 염색에 의해 평가된 바와 같이 2 개의 이소폼(MLC2A 및 MLC2V) 이 프로토콜에 의해 생성된 대부분의 세포는 심장 분화 유도 후 30일째에 MLC2A 양성이었으며, MLC2V는 동일한 시점에서 훨씬 낮은 양으로 발현되었다(그림2). 배양 시간이 증가함에 따라(60일 및 90일째), MLC2 이소폼(MLC2A to MLC2V)의 완전한 전환이 관찰되었다(도2A,하단 패널). MLC2A 및 MLC2V 양성 세포를 정량화하기 위해 유세포 분석이 수행되었습니다. 면역형광 결과에 따라, 유세포분석 데이터는 MLC2A(29.8% MLC2A + 대)를 주로 발현하는 초기 단계(30일째) iPSC-CMS를 입증하였다. 1.9% MLC2V +) (그림 2B,왼쪽 패널 참조), 주로 MLC2V를 표현 한 후반 단계 (일 90) iPSC-CMS에 비해, 이는 주로 MLC2V (41.3 % MLC2V + 16.7 % MLC2A +) (그림 2B, 오른쪽 패널 참조). MLC2A와 MLC2V의 발현 패턴은 심장 분화 및 성숙의 특징으로 알려져 있기 때문에, 이러한 결과는 장기간 배양 시간이 iPSC-CM의 성숙을 증가시키고 세포의 대부분이 심실 표현형에 전념하는 것처럼 보인다는 것을 시사한다. 그런 다음 Ca2+ 처리 성숙의 시간 의존성을 평가했습니다. Ca2+ 과도는 3개의 분화 시간(일째 30, 60 및 90)에서 iPSC-CMS에서 측정되었고, 고립된 성인 쥐 심근세포(ARCMs)와 비교하였다. Ca2+ 진폭은 90일째에 iPSC-CM에서 현저하게 증가하였으며 ARCM(그림3A,B)과유사하였다. 90일째에Ca2+ 재취율(decay-tau)의 속도는 30iPSC-CM에 비해 상당히 빨랐고, ARCM에 더 가까웠다(그림3C). Ca2+ 과도에 대한 β-아드레날린 자극의 효과는 37°C에서 10분 동안 10 nM의 이소프로테레놀(ISO)으로 세포를 처리함으로써 추가로 평가되었다. ARCM에서 관찰된 바와 같이, ISO는 Ca2+ 과도를 크게 증가시키고 90iPSC-CMS의 Ca2+ 재섭취 속도를 가속화했습니다. 30일째에는 변화가 관찰되지않았다(그림 3D-F). 흥미롭게도, 90일 iPSC-CM은 ARCMs에서 관찰된 것과 유사한 방식으로 증가하는 전기 자극(0.5−3 Hz)을 따를 수있었다(도 4B). 이러한 결과를 종합하면, 이 방법에서 파생된 iPSC-CM은 네이티브 CM, 특히 심실과 같은 표현형, 성숙한 Ca2+ 취급 특성 및 양성 β-아드레날린 반응에서 본 것과 유사한 특성을 갖는다는 것을 보여줍니다.
비심장 세포를 오염시키는 것은 분화17동안 인간 iPSC-CM의 기능적 성숙에 영향을 미칠 수 있다. 그림 4A는 고효율 분화로부터 얻은 3개월 된 세포(상부 패널, 비디오 1)를비교하여, 낮은 효율 차별화로부터 얻은 특정 심실 마커(MLC2V)와 3개월 된 세포를 비교한 것을 보여 주며,알파-평활근 액틴(αSMA)과 혼합된 iPSC-CM을 나타낸다. 흥미롭게도, 기능 분석은 고효율 분화로부터의 iPSC-CMS에 비해 혼합 iPSC-CMs/비-CMS 제제에서 변경된 Ca2+ 과도를 입증했다. 특히, 저효율 분화로부터 수득된 셀은 순수 iPSC-CC(도 4B,상부 패널)와 ARVC(도4B,하단 패널)에 비해 매우 작은Ca2+ 진폭 및 자동성(도4B,중간 패널)을 나타내었다. 또한, 저효율 분화로부터의 세포는 부정맥 패턴을 제시하였다(도4C).
그림 4A의 상단 패널에 표시된 iPSC-CM도 대사 선택을 거쳤으며, 이는 이미 고효율 분화에서 파생된 iPSC-CM의 인구를 더욱 풍부하게 하는 중요한 단계입니다. 이러한 데이터는 고품질 의 CM을 생성하는 고효율 심장 분화 프로토콜이 시험관 내에서 심장 표현형을 정확하게 재현하는 데 필요하다는 것을 나타낸다.
그림 5는 1,200s의 시간 과정에 걸쳐 플롯된 CS 단층의 여러 영역에 걸쳐Ca2+ 진폭 가변성을 보여줍니다. 1 Hz(200초)의 자극 주파수의 시작 부분에서 측정된Ca2+ 진폭은 매우 가변적이며 자극이 계속됨에 따라 더욱 일관되게 되었다(200-900s). 그러나, 900s의 기간 이후에 Ca2+ 진폭은 상당히 감소되었다. 이러한 데이터는 iPSC-CM에서 Ca2+ 과도 전류를 기록할 때 세포가 적어도 200s에 대한 일정한 자극하에 37 °C에서 안정화되도록 해야 함을 나타내며, 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 기록을 특정 시간 창(200-900s)으로 제한해야 합니다.
그림 1: iPCS-CM 준비 및 Ca2+ 과도 계측기의 전반적인 회로도. (A)iPSCs의 발달 단계를 나타내는 심장 분화 프로토콜의 회로도. 배율 막대 = 50 μm. (B)칼슘 및 수축성 획득 및 분석 시스템. a)역경 펌프 b)역현미경 c)디지털 카메라 용 전원 d)전기 자극기 e)형광 시스템 인터페이스 f)필터 휠 컨트롤러(C)시스템 챔버. a)시스템 챔버 본체. b)유체 입구. c)유체 출구. d)유체 인라인 용액 히터. f)시스템 챔버를 전기 자극기와 연결하는 전극. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 다른 분화 일에서 iPSC-CM에서MLC2A 및 MLC2V 발현의 비교. (a)MLC2A 및 MLC2V에 대한 분화 유도 후 30일, 60일 및 90일째에 iPSC-CM의 면역형광 염색. 배율 막대 = 20 μm. (B)MLC2V 및 MLC2A에 대한 iPSC-CM의 유동 세포 분석 분석은 1개월 및 3개월 후 분화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 차별화의 다른 날에 iPSC-CMs 속성의 비교. (A)대표 Ca2+ 분화의 다른 일에 일시적인 추적. (B-C) 평균Ca2+ 진폭 및Ca2+ 감쇠는 1 Hz에서 자극 중에 유도된다.(D-F)이소프로테레놀의 효과 (ISO, 10 nM) 분화의 다른 날에 iPSC-CMS에서 치료. ARCM은 분리된 쥐 성인 심근세포를 나타낸다. N = 70-100 영역; * p < 0.05; p < 0.001, 학생의 t-test에 의해 결정. 데이터는 평균 ± S.E.M.로 표시됩니다.
그림 4: iPSC-CM의 고효율 및 낮은 효율 차별화 간의 비교. (A)αSMA 및 MLC2V를 위한 iPSC-CM의 면역형광 염색. 배율 막대 = 20 μm. (B)고효율(위) 및 저효율(중간) 분화에서Ca2+ 과도를 나타내는 대표적인 트레이스, 및 분리된 쥐 성인 심근세포(아래). 근세포는 0.5 Hz, 1 Hz, 1.5 Hz, 2 Hz, 및3 Hz에서 자극되었다. 화살표는 점 간격을 나타냅니다. ARCMs는 분리된 쥐 성인 심근세포를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 단일 커버슬립에서 시간 종속 Ca2+ 진폭. 커버슬립의 여러 영역에서의Ca2+ 진폭은 시간에 따라 플롯되었습니다. Ca2+ 과도를 측정하는 권장되지 않은 기간은 파선 영역(<200 s 또는 >900s)에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 고효율 차별화의 예를 보여주는 대표적인 비디오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 낮은 효율 차별화의 예를 보여주는 대표적인 비디오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3: 유리 커버 슬립상에 iPSC-CM의 균일한 단층 분포의 예를 보여주는 대표적인 비디오. 이 비디오에서는 기능 분석에 사용할 권장 셀 밀도를 보여 주어집니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 4: 유리 커버슬립 상에 도금된 저효율 분화로부터 세포의 예를 보여주는 대표적인 비디오. 비디오 내의 세포는 낮은 효율 분화로부터 수득되었다. 이러한 분화로부터의 세포는 일반적으로 커버슬립을 통해 균일하게 분포되지 않으며 일관되게 구타 세포를 찾기가 어렵습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 iPSC-C를 실험 모델로 사용하기 위한 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 일관된 성능과 재현 가능한 결과를 보장할 수 있는 고품질 심근세포(CM)를 생성합니다. 2) 세포가 적어도 90 일 동안 배양에서 성숙하여 표현형을 적절하게 평가할 수 있도록 하는 단계; 3) 전기 생리학 연구를 수행, 예를 들어 칼슘(Ca2+) 과도 측정, 인간의 iPSC-CM의 생리학적 으로 관련된 기능적 특성을 제공하기 위해. 우리는 고품질의 심실 과 같은 iPSC-CS를 생성하는 단층 기반 의 분화 방법을 개발했습니다. 우리의 방법은 몇 가지 중요한 요인에 의존하고 기존 프로토콜14,18의변형이다 . 다른 프로토콜과 는 달리, 이것은 iPSCs 유지보수뿐만 아니라 MS로의 분화의 첫 주 동안 낮은 산소 조건 (5%O2)을사용합니다. 저산소 조건은 또한 iPSCs 증식 및 그 후속 분화를 CMs20에증가시키는 것을 보여주었습니다. 파종 밀도와 적절한 iPSCs 패싱은 성공적인 심장 분화를 위한 중요한 요소이기도 합니다. 70-80% 동급 iPSCs가 효소가 없는 용액을 사용하여 작은 세포 응집체로 해리되고 1:6의 분할 비율로 시드될 때 높은 분화 효율이 관찰됩니다. 심장 분화는 세포가 70-80 %의 합류에 도달 할 때 시작할 수 있습니다, 분할 후 약 4 일 예상. 차별화의 시작 부분에서 CHIR99021 (10 μM) 치료는 상당한 세포 사멸을 일으킬 것이다. 그러나, CHIR99021이 배양으로부터 다음날 제거될 때 세포 증식이 관찰된다. 세포 사멸과 증식 사이의 올바른 균형은 분화 전반에 걸쳐 단층 배양을 보존하는 데 필수적이며, 이는 성공적인 분화를 위한 또 다른 중요한 요소입니다. iPSC 밀도가 너무 낮거나 너무 높으면, 후속 분화는 저효율 심장 분화될것이다(도 4A, 비디오 2). 도 4A는 건강한 공여자로부터 유래된 심근세포가 α-평활근 액틴 양성 세포와 같은 다른 세포 유형과 혼합되는 저효율 분화의 예를 나타낸다. 중요한 것은, 이러한 제제로부터 기록된 Ca2+ 과도는 생물학적 변이로 쉽게 해석될 수 있는 낮은Ca2+ 진폭 및 부정맥 패턴과 같은 변경된 특성을 보였다. 동일한 세포주로부터의 성공적이고 고효율 분화는, 대신에, 일반Ca2+ 과도와 함께 심실유사 심근세포(도4A, 비디오 1)의순수한 집단을 생성하였다(도4B,상부 패널). 따라서, 분화의 품질은Ca2+ 과도의 전체적인 크기, 모양, 규칙성 및 주파수에서 중요한 역할을 한다.
성공적이고 효율적인 분화의 또 다른 중요한 측면은 심근 세포의 풍부한 인구를 얻는 것입니다. 미분화 줄기 세포 및 기타 iPSC 유래 세포 유형이 포도당을 에너지원으로 사용하는 반면, CM은 ATP 및 글루타메이트 생산21에젖산을 효율적으로 사용할 수 있습니다. 따라서, CD의 더 순수한 집단을 얻기 위하여, 세포는 젖산 보충 및 포도당 고갈된 배양 배지에서 배양된다. 그러나 이러한 선택 매체에서 iPSC-CM을 장시간 배양하면 기능적 장애가 발생할 수 있습니다. 따라서 iPSC-CT를 정화하고 여전히 기능을 보존하기 위해 대사 선택은 분화 유도 이후 80-90 일에서 10 일 동안만 수행됩니다. 이 기간 이후에 선택 매체가 교체되고, 세포는 RPMI/B27 매체에서 유지된다. 선택 프로토콜은 훨씬 일찍22(예를 들어, 15일 경)까지 구현될 수 있지만, 80일째까지 기다리는 것이 바람직하며, 이렇게 하면 세포가 기능적 연구를 위한 준비가 될 때까지 잔류 iPSCs 또는 다른 세포 유형이 증식하는 것을 방지할 수 있습니다(90일째). 따라서 성공적이고 효율적이며 강력한 심장 분화를 위해 위에서 언급 한 모든 요소를 고려하는 것이 중요합니다.
심장 분화 프로토콜의 견고성과 효율성 외에도 성숙 및 세포 유형 사양(예: 심방 및 심실 세포 유형)은 심장 질환을 모델링하기 위해 iPSC-CM을 사용하는 데 큰 어려움을 초래합니다. 지난 몇 년 동안, 많은 유망한 성숙 전략이 보고되었습니다, 전기 자극을 포함, 기계적 스트레칭, 및 기판 강성23. 그러나, iPSC-CM의 체외 내 장기간 배양은 성인과 같은 심근세포24,25를생성하는 간단하고 실용적인 접근법으로 계속된다.
다른 출판 된 보고서 와 일치12,iPSC-CM이 시험관 내 분화 프로토콜에 의해 생성 된 심실 특이적 MLC2V의 강력한 발현을 보여주고 90 일째에 MLC2A의 훨씬 낮은 수준(도 2A,B). 태아 CM은 MLC2A와 MLC2V 이소폼을 모두 포함하지만, 성인 심실 CM에는 MLC2V만 함유되어 있습니다. MLC 등소형 보급에 있는 이 스위치는 신생아 단계26도중 생깁니다.
이 프로토콜을 통해 생성된 심근세포는 MLC2V와 같은 심실 특이적 마커를 표현하며, 이는 세포가 배양에 더 오래 유지됨에 따라 점진적으로 풍부하게 증가한다(도2A,B). 이것은 시험관 내 문화가 장기간 심실 표현형에 투입되는 것처럼 보이는 MS의 성숙을 강화한다는 것을 나타냅니다.
문화에서의 시간은 또한 크게 Ca2+ 처리 성숙24,25에영향을 미칩니다. 이전 보고는 분화 유도의 20 일 후에, 세포가 더 오래된25로증가함에 따라 석회화 Ca2+ 과도에 있는 중요한 변경이 없었다는 것을 기술했습니다. 그러나, 여기에 상세히 기술된 프로토콜로부터 생성된 심근세포는 평가된 3개의 시점(30, 60, 및 90일 심장 분화 유도 후)에 걸쳐Ca2+ 진폭 및Ca2+의 점진적 변화를 보여준다(도3A-C). 흥미롭게도, 이러한 데이터는Ca2+ 진폭 및 Ca2+ 붕괴와 같은 일시적인 파라미터가 90일 동안 측정된 것으로 나타났습니다. 더욱이, 90일 된 iPSC-C는 ARCM과 유사하게 0.5Hz에서 3Hz까지 다양한 전기 자극을 일관되게 따를 수있었다(그림 4B). 향후 작업에서는 문화에서 더 긴 시간이 ARCM과 비교하여 이러한 iPSC-CM의 기능적 특성에 어떤 영향을 미치는지 보는 것이 흥미로울 것입니다.
부가적으로, β-아드레날린 수용체 신호는 심장유도(27)후에 뚜렷한 시간 의존성 형화 패턴을 나타내기 때문에, 이 프로토콜을 통해 생성된 iPSC-CM에서Ca2+ 과도에 대한 이소프로테레놀의 효과를 시험했다. 이소프로테레놀을 통한 자극은 ARCMs에서 관찰되는 것과 유사한 90iPSC-CM일째에 양성 루시트로픽 반응을 이끌어냈다(그림 3D-F).
본 연구에서 수행된 iPSC-CM의 기능적 평가는 고립된 성인 CM과 비교하여 몇 가지 차이점과 한계를 가지고 있다. 성인 C는 잘 발달하고 잘 배열 된 sarcomeres있습니다. 이를 통해 sarcomere 움직임의 검출을 통해 수축성 측정이 가능합니다. 현재 프로토콜 중 어느 것도 완전히 성숙한 성인과 같은 iPSC-C를 생성하지 않기 때문에 sarcomere 검출을 통한 수축성 측정은 불가능합니다. 세포가 수축할 때 셀 가장자리의 움직임을 검출하는 것이 가능하지만 iPSC-CM에서 이러한 움직임을 정밀하게 추적하는 것은 훨씬 더 어렵습니다. 현재로서는, 기술 발전은 이 세포에 있는 수축성의 정확한 평가를 허용하기 위하여 필요합니다. 다른 한편으로는, Fura-2와 같은 Ca2+ 표시기를 사용하여 iPSC-CM의 Ca2+ 과도를 측정할 수 있습니다. 그러나 성인 CD와 달리 iPSC-CM은 클러스터되어 있으며 잘 정의된 테두리가 없습니다. 따라서 기록된Ca2+ 과도 는 일반적으로 단일 셀이 아니라 특정 영역에 있는 셀 그룹을 나타냅니다. 영역 크기를 조정할 수 있지만 단일 셀에서 Ca2+ 과도 를 기록하는 것은 매우 어렵습니다. MC가 커버립에 도금될 때 밀도는 균질한 단층분포(비디오 3)를달성하도록 하여 세포가 있는 영역을 일관되게 찾을 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 세포가 커버슬립(비디오4)에단층으로 분포되지 않으면 세포가 없는 영역이 존재하며, 커버슬립이 측정을 수행하기 위해 박동세포가 있는 영역에 대해 특별히 스크리핑되면 "선택 편향"으로 이어질 수 있습니다. 구타 세포의 특정 영역을 선택하는 대신, 세포가 균일 한 단층으로 배포 될 때만 가능한 커버 슬립을 통해 여러 영역에서 데이터를 수집하는 것이 좋습니다. 약 10분이 소요되는 100개의 다른 영역에서의 측정은 세포의 신뢰할 수 있는 기능적 특성을 제공하기에 충분합니다. 마지막으로, 그림 5에나타난 바와 같이 iPSC-CM은 측정 조건에 적응하는 데 시간이 필요합니다. 신뢰할 수 있는 측정을 위해, 적어도 3 분 동안 측정 조건에서 세포를 안정화하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 AHA 과학자 개발 보조금 17SDG33700093 (F.S.)에 의해 지원되었다; 마운트 시나이 KL2 임상 및 중개 연구 경력 개발 KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 및 AHA 18TPA34170460 (C.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
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