Summary
כאן אנו מתארים ולאמת שיטה כדי ליצור בעקביות באופן עקבי הנגרמת האנושי המושרה תא גזע מושרה ולאפיין את תפקידם. טכניקות אלה עשויות לסייע בפיתוח תובנה מכניסטית למסלולי איתות, לספק פלטפורמה לסינון תרופות בקנה מידה גדול ומחלות לב באופן אמין.
Abstract
תאי גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הקרדיוציטים (iPSC-CMs) לספק מקור אנושי יקר ללמוד את המדע הבסיסי של סידן (Ca2 +) טיפול מסלולים איתות, כמו גם הקרנות התפוקה גבוהה הקרנת תרופות רעילות. להלן, אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיות המשמשות להפקת iPSC-CMs באיכות גבוהה שיכול לשחזר בעקביות מאפיינים מולקולריים ופונקציונליים על פני קווי תאים שונים. בנוסף, מתוארת שיטה להעריך באופן אמין את האפיון הפונקציונלי שלהם באמצעות הערכה של מאפייני Ca2 + טיפול. חמצן נמוך (O2) התנאים, בחירת לקטט, וזמן ממושך בתרבות לייצר טוהר גבוהה ואיכות גבוהה, המוח כמו הקרדיוציטים. בדומה מבודד עכברוש מבוגר חולדה (ARCMs), 3-חודש-התערוכה iPSC-CMs גבוה יותר Ca2 + משרעת, שיעור מהיר יותר של ca2 + קליטה (ריקבון-טאו), ו תגובה lusitropic חיובית β-אדראררגיות גירוי לעומת יום 30 ipsc-CMs. האסטרטגיה היא טכנית פשוטה, חסכונית, והיא מתוכמת. הוא מספק פלטפורמה חזקה למודל לב מחלות ועבור הקרנת סמים בקנה מידה גדול כדי למקד Ca2 + טיפול בחלבונים.
Introduction
תא גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הגוף הנגזר (ipsc-CMs) הם פלטפורמה מבוססת אדם אטרקטיבי למודל מגוון גדול של מחלות לב מבחנה1,2,3,4,5,6,7,8. יתר על כן, ipsc-CMs יכול לשמש לחיזוי של תגובות המטופל לתרופות הרומן או הקיים, כדי למסך תרכובות פגע, ולפתח תרופות אישיות חדשה בהתאמה אישית9,10. עם זאת, למרות ההתקדמות המשמעותית, יש לשקול מספר מגבלות ואתגרים בעת שימוש ב-iPSC-CMs11. כתוצאה מכך, שיטות לשיפור פרוטוקולי בידול הלב, כדי לשפר את היעילות ipsc-CMs והתבגרות, וכלה לייצר מיני קרדיולוגית מסוימים (חדרית, פרפור, ו nodal) כבר למדו והובילו לאסטרטגיות רבות בתרבות כדי להתגבר על מכשולים אלה12,13,14,15.
על אף החוסן של פרוטוקולים אלה, הדאגה העיקרית לשימוש iPSC-CMs היא מהווה את האפשרות של הליכים ארוכים ומורכבים כדי להשיג קרדיוומיציטים באיכות גבוהה שיכול להבטיח ביצועים זהה ותוצאות לאורך זמן. הנוזפות היא קריטית לא רק בעת השוואת קווי התא עם רקעים גנטיים שונים, אלא גם כאשר חוזר השוואות סלולר ומולקולרי של אותו קו התא. שינויים בתאים, כגון הבדלים היטב בצפיפות iPSCs, עשויים להשפיע על בידול הלב, הפקת תשואה נמוכה ומנוציטים באיכות ירודה. תאים אלה עדיין יכול לשמש כדי לבצע ניסויים שאינם דורשים אוכלוסייה טהורה של CMs (למשל, בעת ביצוע Ca2 + ארעי מדידות). ואכן, בעת ביצוע ניתוח אלקטרולוגי, אי-CMs לא יכה, לא באופן ספונטני ולא מתחת לגירוי חשמלי, כך יהיה קל להוציא אותם מהניתוח. עם זאת, בגלל האיכות הירודה, iPSC-CMs יכול להראות מאפיינים אלקטרופיסיולוגיים שונה (למשל, Ca לא סדיר2 + ארעי, נמוך ca2 + משרעת) אשר אינם בשל האיפור הגנטי שלהם. לכן, במיוחד כאשר באמצעות iPSC-CMs למודל לב מחלות, חשוב לא לבלבל את התוצאות מ-CM באיכות נמוכה עם פנוטיפים למחלה. תהליכי הקרנה והדרה מזהירים נדרשים לפני שממשיכים ללמוד אלקטרופיסיולוגיים.
שיטה זו כוללת פרוטוקולים ממוטבים להפקת שימוש בטוהר גבוה ובאיכות גבוהה ולהערכת תפקידם על-ידי ביצוע מדידות של Ca2 + ארעי באמצעות מערכת הפקת סידן וניתוח. טכניקה זו היא פשוטה, אך רבת עוצמה, דרך להבדיל בין יעילות גבוהה לבין יעילות נמוכה ההכנות iPSC-CM ולספק אפיון מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי של iPSC-CMs אנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים בעזרת קרדיוקרדיציטים מבוגרים במחקר זה נערכו עם מאושר טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש (IACUC) פרוטוקולים של בית הספר Icahn לרפואה בהר סיני. הקרדיוציטים הבוגרים היו מבודדים מהלבבות העכברים של ספראג באמצעות השיטה המבוססת על לאנגדורף כמתואר בעבר16.
1. הכנת מדיה
- הכינו מדיית היפאנט.
- משקל התוספת ואת המדיום הבסיס לטמפרטורת החדר (RT). ודא שהתוספת הופפה לחלוטין. מערבבים 400 ml של המדיום בסיס 100 mL של תוספת ומסנן באמצעות 0.22 יקרומטר מונחה ואקום מסנן. אחסן ב-4 ° c ו-RT לפני השימוש.
- הכן RPMI + B27.
- השפה הB27 ואת תוסף הבסיס (RPMI 1640) ל-RT. ודא שהתוספת הופפה לחלוטין. מערבבים 490 ml של המדיום הבזליים 10 מ ל של תוספת 50x ומסנן באמצעות 0.22 יקרומטר ואקום מונחה מסנן. אחסן ב-4 ° c ו-RT לפני השימוש.
- הכינו RPMI + B27 (-) אינסולין.
- השפה הB27 (-) תוספת אינסולין והמדיום הבסיס (RPMI 1640) ל-RT. ודא שהתוספת הופפה לחלוטין. מערבבים 490 ml של המדיום הבזליים 10 מ ל של תוספת 50x ומסנן באמצעות 0.22 יקרומטר ואקום מונחה מסנן. אחסן ב-4 ° c ו-RT לפני השימוש.
- הכנת מדיית בחירה (RPMI (-) גלוקוז + B27 + לקטט).
- השפה B27 תוסף ואת המדיום הבסיס (RPMI 1640 (-) גלוקוז) כדי RT. ודא שהתוספת הופפה לחלוטין. מערבבים 490 mL של המדיום הבזליים 10 מ ל של תוספת 50x, להוסיף 4 מ"מ נתרן לקטט היוו מים סטרילי, ומסנן באמצעות מסנן מונחה ואקום 0.22 יקרומטר. אחסן ב-4 ° c ו-RT לפני השימוש.
- . הכן RPMI 20
- המדיום מדיום בסיס (RPMI 1640) כדי RT. לערבב סרום העוברי (FBS) (20% ריכוז סופי) ו-RPMI. סנן באמצעות מסנן מונחה ואקום 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c. לפני שימוש בשפה מעורפלת.
- הכן מדיה על ידי הוספת Rho משויך, מתפתל-סליל המכילים חלבון קינאז (ROCK) מעכב (2 הריכוז הסופי μM) כדי מדיה היפנוsc.
- להכין D0 מדיה על ידי הוספת GSK-3 מעכב, CHIR 99021 כדי RPMI + B27 (-) אינסולין מדיה (10 μM הסופי).
- להכין D3 ו-D4 מדיה על ידי ערבוב RPMI + B27 (-) אינסולין מדיה עם IWR-1 (5 μM הסופי).
הערה: D1 ו-D5 מדיה היוו RPMI + B27 (-) אינסולין. D7 מדיה היא היווה של RPMI + B27. - הכנת מאגר חסימת (2% בסרום של שור), 2% FBS, 0.05% NP-40 במלח פוספט באגירה [PBS]): בצינור שפופרת משנת 50 המאה mL, מוסיפים 1 גרם של BSA, 1 מ ל של FBS, 49 mL של PBS, ו-250 μL של NP-40. מערבבים עד התפרקה לחלוטין.
2. הכנת תא גזע מתחלקים האדם (hESC)-מטריצות מצופה מטריקס צלחות כיסוי
הערה: בצע את כל השלבים תחת מכסה התרבות רקמה מחוטאת.
- הפשרת מניות hESC מוסמך פתרון בלילה על הקרח ב 4 ° c. עיין בגיליון מפרט המוצר כדי לקבוע אמצעי אחסון מתאימים מכיוון שפעולה זו עשויה להשתנות בהתאם למניה. לאחסן אלה מובחנות ב-20 ° צ' בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
- כדי להשתמש במטריקס לציפוי לוחות או כיסויים לזכוכית, הפשרת תחילה מטריצה מוסמכת של hESC ב -4 ° c עבור 30 דקות.
- מחלק 24 מ"ל של בינונית משתנה הנשר של דולבקה (DMEM): תערובת מזינים F-12 (DMEM/F: 12) מדיה לתוך צינורית חרוט 50 mL.
- ערבבו את הג/F: 12 מדיה עם פיפטה זכוכית 2 מ ל על מנת לצנן את המשטח של הפיפטה.
- באמצעות אותו הצינור, לקחת בערך 500-700 ליטר μL של הגברת הקרה/F: 12 ולערבב עם מטריצה hESC מוסמך בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה עצמה.
- פעם אחת מעורבב כראוי, להעביר את הפתרון לצינורית חרוט 50 mL המכילה את ההצטננות/F הקרה: 12 ו לערבב שוב.
- לצלחת מתקן 6 היטב, להוסיף 1 mL של תערובת זו לכל טוב. ודא כי הבאר מכוסה כולו. השאירו את הצלחות ב-RT מתחת למכסה התרבות של הרקמה לפחות 30 דקות. אם תרצה, לאחסן ב 4 ° c מיד לאחר הציפוי עד 1 שבוע ו equi, עד RT עבור 30 דקות לפני השימוש.
- על מנת להשתמש בלוחות, מאחד את המטריצה ומחליף אותם באמצעי התקשורת המתאימים. . השתמש באופן מיידי
- אחסן את שמיכות הזכוכית בסביבה סטרילית (למשל, בתוך מכסה של תרבות רקמה סטרילית).
- לפני ציפוי, לנגב כל שמיכות יחיד עם 70% אתנול. ברגע שהוא יבש, מניחים אותו בתוך הבאר של צלחת 6 היטב סטרילי.
- קח 250 ליטר μL של פתרון מטריצה hESC-מוסמך ובזהירות לוותר אותו ישירות על מרכז שמיכות זכוכית. השאר את הכיסויים ב-RT מתחת למכסה המנוע של הרקמה לפחות 30 דקות לפני השימוש.
3. הכנת מולקולות קטנות
הערה: מרכיבים מחדש את כל המולקולות הקטנות ו-Wnt מאפטורים ב DMSO אלא אם נכתב אחרת.
- הכינו 10 מ"מ מילימטר של 25 μL כל אחד IWR-1 ו-CHIR 99021 ולאחסן ב-20 ° c.
- מרכיבים מחדש 10 מ"מ מ50 μL כל אחד מהטיזוויבין (מעכב רוק) ומאחסן ב-20 ° c.
4. תחזוקה והפסנת iPSCs
הערה: בצע את כל השלבים הבאים תחת המכסה התרבותי של הרקמה הסטרילית.
- שמרו על iPSCs בסטנדרט 6 צלחות ובצעו את כל הצעדים בתנאים סטריליים. שמור על התאים עם 2 מ ל של מדיית היפנוסק לכל היותר. . להחליף את התקשורת כל יום לשמור על התאים ב 37 ° c, 6% O2, 5% CO2. מעבר בין התאים כאשר הם בין 70 ל-80% שוטפת.
- השפה הPBS ללא Ca2 + ו Mg2 + כדי RT.
- כדי להתחיל את תהליך ההתיישנות, להוסיף 1 מ ל של PBS ללא Ca2 + ו-Mg2 + אל הבאר שצריך להיות מיושן. מודקון ב RT עבור 7-10 דקות. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי הטיפול PBS לא הביא את הדיסוציאציה המלאה של המונאולייר.
- הסר את PBS והחלף ב-1 מ ל של מדיית הפאסאייג. השתמש מרים תא כדי לגרד בעדינות ולהרים את התאים מהמשטח של הבאר.
- מכנית הנתק את התאים באמצעות צינורות זכוכית סטרילית 2 mL. חזור על הפעולה עד שהתאים מושקלים באופן שווה למושבות קטנות כאשר הוא נצפה תחת מיקרוסקופ.
- לאחר התאים כבר הנתק מספיק, להוסיף 5 מ ל של מדיה passaging לפצל את התאים 1:6. התאם את כמות מדיית הפאסגיול שתתווסף כדי להתאים ליחס הפיצול המועדף.
- מנושף את מטריצת hESC-מוסמך מהצלחת hESC-מצופה מטריקס ולהחליף עם 1 מ ל של מדיה passaging לכל טוב. הוסף 1 mL של תאים שאינם מתאיהם בו.
5. קרדיוציט בידול
- השתמשו בקווי היפנואס שהוקמו היטב (יותר מ -20 מעברים) ומציגים מורפולוגיה אחידה לפני תחילת הבידול בהלב.
- ודא שiPSCs הם בערך 70-80% שוטף.
- שטוף את התאים 1x ב-PBS ללא Ca2 + ו-Mg2 +.
- הוסף 2 מ ל של D0 מדיה (שלב 1.7) לכל טוב ולהעביר את התאים בחזרה לחממה.
- לאחר 24 שעות, החלף עם 3 מ ל של D1 מדיה לכל טוב עבור 48 h.
- ביום 3, להחליף את המדיה עם 2 מ ל של D3 מדיה לכל טוב. חזור על הפעולה עם מדיה D4 ביום 4.
- ביום 5, החלף את המדיה עם 3 מ ל של D5 מדיה לבאר.
- ביום 7, להחליף את המדיה עם 3 מ ל של D7 מדיה לכל טוב ולהעביר לאינקובטור עם 37 ° צ', 5% CO2, ו-2 הריכוז הרגיל O. החלף את המדיה D7 (RPMI + B27) כל יומיים.
6. נוהל בחירה ו-iPSC-ס מ לדיסוציאציה
- עשרה ימים לפני ביצוע המידות של Ca2 + ארעי או ניתוח פונקציונלי כלשהו, החלף את המדיה RPMI + B27 עם 3 מ ל של מדיית בחירה לכל טוב עבור 48 h.
- החלף את המדיה עם 3 מ ל של מדיית בחירה עבור 48 שעות נוספות.
- החלף את המדיה עם 2 מ ל של RPMI + B27 מדיה לכל טוב עבור 24 שעות.
- תקן מעיל 6 טוב לוחות כמתואר בסעיף 2.
- הוסף 1 מ ל של סטרילי 0.25% טריפסין עם EDTA לכל טוב. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 5 דקות.
- באמצעות 1,000 μL הצינורות, מכנית הנתק את התאים כך תאים בודדים ניתן לראות כאשר נצפתה תחת מיקרוסקופ.
- העבר את התאים לצינור חרוטי מעוקר של 15 מ"ל והוסף 2 מ ל של RPMI 20 מדיה לבאר. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 800 x g.
- מריף את הסופר ומשהה מחדש את התאים במדיה RPMI + B27. מתיף את המטריצה המאושרת של hESC מן הצלחות ולהחליף עם 1 מ ל של RPMI + B27 מדיה.
- שימוש בטיפ 1,000 mL, הנתק מכנית את הגלולה התא עד הפתרון מופיע הומוגנית.
- העברה בערך 500,000 תאים לכל היותר. העברה לחממה עבור 24 שעות.
- החלף את המדיה עם 3 מ ל של מדיית בחירה עבור 48 h.
- החלף את המדיה עם 3 מ ל של RPMI + B27 לכל טוב. שמור על תאים ב-D7 media (RPMI + B2 החלפת מדיה כל יומיים עד שהוא מוכן לניתוח פונקציונלי.
7. הכנת iPSC-CMs לצורך זרימה הציטומה
- לאחר התאים הם בגיל הרצוי ועברו בחירה מטבולית (סעיף 6), לשטוף את התאים עם PBS ללא Ca2 + ו-Mg2 +.
- הוסיפו כ-mL ל-0.25% ומכאן ב-37 ° c למשך 5/7 דקות.
- פיפטה את התערובת 5-10x עם טיפ P1000 כדי singularize את התאים, ולהעביר לצינור 15 מ ל המכיל 2 מ ל של RPMI 20.
- לסובב את התאים ב 600 x g עבור 5 דקות.
- הוסף 100 μL של פתרון קיבעון (4% בתחתית) אל הגלולה התא. הוסף את הפתרון dropwise עם רציפה, רך ומבוקר ולאחר מכן להגדיר על קרח עבור 15 דקות.
- הוסף 1.5 מ ל של PBS. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ומכה את סופרנטאנט.
- עבור כל ניסוי, לכלול שליטה בלתי מוכתם אחד למצב קיבעון/חדירות.
- השהה תאים מחדש ב-500 μL של פתרון חסימה (2% FBS/2% BSA ב-PBS עם 0.1% NP-40) עבור 30 דקות ב-RT.
- מבלי להסיר את הפתרון חסימה, להוסיף את הנוגדן העיקרי MLC2V/MLC2A (5 מ"ג/mL), ו-דגירה 45 דקות ב RT.
- שטוף באמצעות מאגר חסימות. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והפתרון מרוב.
- הוסף נוגדן משני אלקסה Fluor 555/488 (1:750) מדולל במאגר חסימת עבור 45 דקות ב RT או לילה ב 4 ° c.
- הוסף 1.5 מ ל של PBS. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והפתרון מרוב.
- השהה תאים מחדש ב-250/300 μL של PBS. השתמש בפיפטה P1000 כדי לשלול את התאים.
- להכין צינורות התחתונה עגול עם כיפה 35 יקרומטר ניילון מסננת תא כובע. טרום להרטיב את מסננת התא עם 50 μL של PBS ולהגדיר את השפופרת על הקרח.
- העבר את הפתרון עם התאים המצטברים לצינורות התחתונים העגולים עם כמוסות המסננת של התא. אפשר לפתרון התאים לנקז באופן טבעי או להקיש בתחתית הצינורית על משטח שטוח, בהתאם לצורך, כדי להבטיח ניקוז מלא ואיסוף של תאים לתוך הצינור. ודא שאתה מחזיר את השפופרת חזרה לקרח בהקדם האפשרי.
- לשטוף את מסננת התא עם 250 μL של PBS כדי לשחזר את כל התאים שיורית.
- לשמור על הצינורות על הקרח לכסות עם רדיד אלומיניום עד הזרימה cy, try ניתוח.
8. ציפוי מחליק על כיסוי זכוכית
הערה: בצע את כל השלבים בסביבה סטרילית.
- הכן את שמיכות הזכוכית כפי שמתואר בשלבים 2.10 ו 2.11.
- לאחר iPSC-CMs נבחרו והם של הגיל הרצוי, בצע את שלבים 6.5-6.7 כדי לנתק את iPSC-CMs.
- מריף את supernatant ולהשעות מחדש את התאים בכמות מספקת של RPMI 20 מדיה יש בערך 300,000 תאים לכל 250 μL.
- באמצעות צינורות זכוכית 2 mL, מכנית הנתק את הגלולה התא עד הפתרון מופיע הומוגנית.
- . מהמטריקס המוסמך מהכיסויים
- שימוש בפיפטה 1000 μL, מערבבים ומושכים 250 μL של הפתרון מצינור השפופרת החרוט 15 מ"ל.
- לאט לוותר על 250 μL של הפתרון על שמיכות זכוכית, לוקח טיפול נוסף רק להוסיף לאזור שבו ציפוי מטריצה hESC מוסמך הוא נוכח.
- העבר בזהירות לחממה ולעזוב את הלילה, מקפיד לא ללחוץ או לפזר את התאים על הכיסויים. למחרת בבוקר, להוסיף בעדינות 2 מ ל D7 (RPMI + B27) מדיה לכל טוב עם שמיכות. שינוי המדיה לאחר 24 שעות. ושני ימים לאחר מכן
9. תיקון תאים
- ודא שסכום הולם של PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + הוא שווה ל-4 ° c.
- הכן 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון השני) פתרון מדולל ב-PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + ו-משקל 4 ° c.
- לאחר iPSC-CMs הם בגיל המתאים, עברו בחירה מטבולית (סעיף 6), והיה מצופה שמיכות (סעיף 8), לשטוף את התאים 3x עם 1 מ ל של PBS קר עם Ca2 + ו-Mg2 + לכל טוב.
- הוסף 1 מ ל של קר 4% בתחתית ולהשאיר את התאים בשעה RT מתחת למכסה המנוע עבור 15 דקות.
- לשטוף את התאים עם PBS קר כדי להסיר את העודף בלגון.
- הוסף 2 מ ל של PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + ואחסן ב 4 ° c.
10. כתמים אימונולואורוסנס
- הסר את ה-PBS מהתאים הקבועים והוסף 1 mL של מאגר חסימה. . מודטה בשביל 1 h ב-RT
- הסר מאגר חוסם והוסף את הנוגדן העיקרי (5 מ"ג/mL) מדולל במאגר חסימת. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
- שטוף 3x ב-PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + עבור 5 דקות כל אחד.
- הוסף נוגדן משני מדולל במאגר חסימת 1:1000.
- לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור ו-דגירה עבור 45 דקות ב RT. לשמור על רדיד אלומיניום עבור השלבים הבאים.
- שטוף 3x ב-PBS עם Ca2 + ו-Mg2 +, 5 דקות כל אחד.
- הוסף כמות מספקת של פתרון עבודה DAPI כדי לכסות לחלוטין את התאים ו-דגירה ב-RT עבור 10 דקות.
- לשטוף את המדגם ביסודיות עם PBS עם Ca2 + ו-Mg2 + כדי להסיר dapi עודף.
- לקחת שקופיות זכוכית חדשה ולהוסיף טיפה של מדיה להרכבה באמצע. השתמש בטפטפת כדי להפיץ באופן שווה את המדיה ההרכבה. שים את הכיסויים עם התאים. עם הפנים למטה על השקופיות
הערה: ניתן לאחסן תאים במשך 30 יום אם הם מוגנים מפני האור.
11. הערכה של Ca התאיים2 + ארעיות
- לאחר iPSC-CMs הם לפחות 3 חודשים, עברו בחירה מטבולית (סעיף 6), והיה מצופה על כיסוי, להתייחס אליהם עם 2 μL של Fura-2, AM (ריכוז סופי: 1 μM) ו-דגירה ב 37 ° c עבור 10 דקות.
הערה: Fura-2 הוא רגיש לאור. בצע את כל הליכי הטעינה והניסויים בחשכה. - הכינו את מערכת הטיפול בסידן ובניתוח.
- הפעלה של המערכת מבטיחה שנורת הקשת תופעל (איור 1B).
- הניחו את החדר על המערכת וחברו את הצינורות מהמשאבה אל השקע והשקעים המתאימים והחוט החשמלי מהגירוי אל החדר כפי שמוצג באיור 1ג.
- ממלאים את צינור ההיתוך הזורם דרך התנור הפנימי flu, עם 37 ° c הפתרון של מראש Tyrode.
- להתאים את המצלמה ואת ממדי הצמצם מסגור כדי למזער את אזור הרקע.
- שמיכות זכוכית עם iPSC-CMs לתוך החדר ולחגור.
- הוסף 500 μL של הפתרון של Tyrode ישירות על גבי שמיכות זכוכית הידק בעדינות ולהתחיל לעשות את החדר (1.5 mL/min) עם הפתרון של Tyrode.
- Pace iPSC-CMs עם גירוי שדה 1 הרץ באמצעות גירוי חשמלי (10 V, 4 אלפיות הראשונה).
- דגירה iPSC-CMs בחדר עם גירוי לפחות 3 עד 5 דקות עבור התאים כדי לשטוף את הצבע Fura-2 להסתגל לסביבה לשטוף את צבע הפלורסנט.
- כוונן את חלון הצפייה לאזור העליון השמאלי של שמיכות הזכוכית.
- . התחל בהקלטה
- לאחר איסוף זרם עקבי של 5 עד 10 פסגות, לחץ על השהה כדי להפסיק את ההקלטה באופן זמני.
- להבטיח כי לא המיקוד או הממדים של חלון הצפייה משתנים, להעביר את הבמה של המיקרוסקופ אל האזור הסמוך, נע לעבר הקצה הנגדי, ולחדש את ההקלטה.
- חזור על שלבים 11.9 ו 11.10 לסרוק על פני שמיכות, בתחילה מעבר שמאלה, ולאחר מכן כלפי מטה בצורה זיג זג כדי לכסות את כל אזור coverslip. זה מורכב מ-80 מדידות לכל שמיכות.
הערה: הגבל את זמן המדידה הכולל ל-10 דקות כגורמים משניים גורמים לירידה ב-Ca2 + ארעי. - לאחר הרכישה של Ca2 + טרנסיאנטים, יש לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח העקבות הפלואורסצנטית לפי הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר באיור 1A שנוצר הקרדיוציטים טהור אשר לרכוש שיטת למבוגרים, כמו פניטיפ עם הזמן בתרבות. כפי שמוערך על ידי immunofluorescence כתמים עבור הפרפור ואת הרירן החדרית שרשרת האור הרגולציה 2 איזופורמים (MLC2A ו MLC2V, בהתאמה), רוב התאים שנוצר על ידי פרוטוקול זה היו MLC2A-חיוביים ביום 30 לאחר אינדוקציה של בידול הלב, בעוד MLC2V היה ביטאכמויותנמוכות בהרבה באותה נקודת זמן (איור 2 ככל שהזמן בתרבות גדל (היום 60 ו 90), בורר שלם של MLC2 איזופורמים (MLC2A כדי MLC2V) נצפתה (איור 2a, תחתון לוחות). על מנת לכמת את התאים MLC2A ו-MLC2V-חיוביים, הניתוח cy try לזרום בוצע. בהתאם לתוצאות מערכת החיסונית, הזרם cy, לנסות נתונים הפגינו בשלב מוקדם (יום 30) iPSC-CMs בעיקר ביטוי MLC2A (29.8% MLC2A + vs. 1.9% MLC2V +) (ראה איור 2B, הפנל השמאלי), בהשוואה לשלב המאוחר (יום 90) ipsc-CMs, אשר מבוטא בעיקר MLC2V (41.3% MLC2V + VS. 16.7% MLC2A +) (ראה איור 2B, הלוח הימני). בגלל דפוס הביטוי של MLC2A ו MLC2V ידוע להיות סימן ההיכר של בידול לב והתבגרות, התוצאות האלה מציעות כי זמן התרבות ממושך מגביר את ההבשלה של iPSC-CMs וכי רוב התאים מופיעים להיות מחויבים פנוטיפים חדרית. לאחר מכן העריכו את התלות בזמן של Ca2 + טיפול בהבשלה. Ca2 + ארעי נמדד ipsc-CMs בשלוש פעמים בידול (יום 30, 60, ו 90), ולעומת מבודד מבודדים עכברוש החולדה (arcms). Ca2 + משרעת הוגדלה באופן משמעותי ב-ipsc-CMs ביום 90 והיה דומה arcms (איור 3A, B). שיעור Ca2 + ספיגה חוזרת (ריקבון-טאו) ביום 90 היה מהר משמעותית לעומת יום 30 ipsc-CMs, וקרוב arcms (איור 3ג). ההשפעה של גירוי β-אדראררגיות על Ca2 + טרנסיאנטים הוערך עוד יותר על ידי טיפול בתאים עם 10 ננומטר של איזופנול (ISO) עבור 10 דקות ב 37 ° c. כפי שנצפתה ב-ARCMs, ISO גדל באופן משמעותי Ca2 + ארעי והאיץ את שיעור Ca2 + ספיגה חוזרת ביום 90 ipsc-CMs. לא נצפו שינויים ביום 30 iPSC-CMs (איור 3D-F). מעניין, יום 90 iPSC-CMs הצליחו לעקוב אחר הגדלת גירוי חשמלי (מ 0.5-3 Hz), באופן דומה לזה שנצפה ARCMs (איור 4ב). יחד, התוצאות האלה מראים כי iPSC-CMs נגזר שיטה זו יש מאפיינים דומים לאלה שנראו ב-CMs מקורי, במיוחד החדרית כמו פנוטיפים, Ca בוגרת2 + טיפול מאפיינים, ו חיובי β-אדראררגיות תגובות.
מזהם תאים שאינם לב עלול להשפיע על ההבשלה התפקודית של iPSC האדם-CMs במהלך בידול17. איור 4מראה השוואה בין תאים בני 3 חודשים שהתקבלו מדיפרנציאל יעילות גבוהה (לוחות עליונים, וידאו 1), ביטוי של הסמן החדרית הספציפי (MLC2V), ושלושה חודשים-התאים הישנים המתקבלים מפני החלקה יעילות נמוכה (לוחות התחתון, וידאו 2), מראה ipsc-CMs מעורבב עם אלפא-חלקה שרירים אקטין (αSMA)-תאים חיוביים. מעניין, ניתוח פונקציונלי הפגינו שונה Ca2 + ארעיות ב-ipsc-cms מעורב/non-cms הכנה בהשוואה ipsc-cms מן הבידול יעילות גבוהה. במיוחד, התאים המתקבלים מפני יעילות נמוכה הציגוCa מאוד קטן משרעת ואוטומאלית (איור 4b, הלוח האמצעי) לעומת ipsc-CMsטהור (איור 4 ב,הפאנל העליון) ו ARVCs (איור 4b, הפאנל התחתון). בנוסף, תאים מהדיפרנציאל יעילות נמוכה הציגו דפוסי הפרעות קצב (איור 4ג).
חשוב לציין כי iPSC-CMs המוצג בלוח העליון של איור 4A עבר גם בחירה מטבולית, שהיא צעד חשוב כדי להעשיר עוד יותר אוכלוסייה של ipsc-cms כי כבר נגזר בידול יעיל מאוד. נתונים אלה מצביעים על יעילות גבוהה פרוטוקולים בידול הלב לייצר CMs באיכות גבוהה נחוצים כדי ללכוד במדויק את הפנוטיפ בתוך מבחנה.
איור 5 מראה את ההבדלים Ca2 + משרעת באזורים שונים של CMs מונאולייר, מותווים על קורס זמן של 1,200 s. ה-Ca2 + הגברה שנמדדו בתחילת תדירות גירוי של 1 הרץ (200 s) היו משתנים מאוד והפכו עקביים יותר כאשר הגירוי נמשך (200-900 s). עם זאת, לאחר תקופת זמן של 900 s Ca2 + משרעת היה מופחת במידה ניכרת. נתונים אלה מצביעים על כך, כאשר הקלטה Ca2 + ארעיות ב-Ipsc-CMs, יש צורך לתת לתאים לייצב ב 37 ° c תחת גירוי מתמיד עבור לפחות 200 s. בנוסף, יש להגביל את ההקלטות לחלון זמן ספציפי (200-900 s) כדי להבטיח תוצאות שונות.
איור 1: סכימטי הכולל של הכנה ל-iPCS-CMs ו-Ca2 + מכשירים ארעיים. (א) סכמטית של פרוטוקול בידול לב המציג את השלבים ההתפתחותיים של iPSCs. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב) הסידן ומערכת הניתוח והרכישה. a) משאבה הפוכה משאבת c ) מקורכוח עבור המצלמה הדיגיטלית d) מערכת החשמל של ממשק המערכת (c) מסנן גלגל. a) גוף חדר מערכת. ב) מפרץ נוזלים. ג) משקע נוזלים. ד) מחמם פתרונות מוטבע. f) אלקטרודות הקושרות את חדר המערכת לגירוי החשמלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השוואת MLC2A ו MLC2V ביטוי ב-iPSC-CMs בימים שונים של בידול. (א) immunofluorescence כתמים של ipsc-CMs ביום 30, 60, ו 90 לאחר הידול MLC2A ו MLC2V. סרגל קנה מידה = 20 μm. (ב) הזרימה cy, לנסות ניתוח של Ipsc-CMS עבור MLC2V ו MLC2A בחודש 1 ו 3 חודשים פוסט בידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואת מאפייני iPSC-CMs בימים שונים של בידול. (א) נציג Ca2 + עקבות זמניים בימים שונים של בידול. (B-C) ממוצע Ca2 + משרעת ו-ca2 + ריקבון מקבל במהלך גירוי ב 1 הרץ. (D-F) אפקט של אלכוהול איזוטראנרול (ISO, 10 ננומטר) טיפול ב-ipsc-CMs בימים שונים של בידול. ארק. N = 70-100 אזורים; * p < 0.05; p < 0.001, כפי שנקבע על-ידי מבחן tשל הסטודנט. נתונים מיוצגים כממוצע ± S.E.M. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואה בין יעילות גבוהה והחלקה של יעילות נמוכה של iPSC-CMs. (א) אימונוoforסנס כתמים של ipsc-CMs עבור ΑSMA ו MLC2V. סרגל קנה מידה = 20 μm. (ב) רשמים מייצגים המראים Ca2 + ארעיות מפני יעילות גבוהה (לעיל) ויעילות נמוכה (באמצע) החלקה, ומבודד החולדה למבוגרים קרדיוציטים (למטה). המיציטים היו מוסטימולציה ב-0.5 Hz, 1 Hz, 1.5 Hz, 2 Hz ו-3 Hz. (ג) מעקב הנציג מראה דפוס קצב הפרעות מתוך בידול רע. חיצים מציינים את נקודת התנועה. ארק-Ms מעיד על. בידוד קרדיוציטים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שעון Ca2 + משרעת מ שמיכות יחיד. Ca2 + הגברה מאזורים שונים בתוך שמיכות הותוו באופן תלוי-זמן. פרקי זמן לא מומלצים למדידת Ca2 + ארעי מצוינים באזורים המקווקו (< 200 או >-900 s). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: וידאו נציג המציג דוגמה של בידול יעילות גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 2: וידאו נציג המציג דוגמה של בידול יעילות נמוכה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 3: וידאו נציג המציג דוגמה של התפלגות מונאולייר הומוגנית של iPSC-CMs על שמיכות זכוכית. וידאו זה מציג את צפיפות התא המומלצת לשימוש עבור ניתוח פונקציונלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 4: וידאו נציג המציג דוגמה של תאים מפני בידול יעילות נמוכה המצופה על שמיכות זכוכית. התאים בווידאו הושגו מתוך בידול יעילות נמוכה. תאים מתוך החלקה כאלה הם בדרך כלל לא מופץ הומוגנזה על פני שמיכות, קשה למצוא בעקביות תאים להכות. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים לשימוש ב-iPSC-CMs האנושי כמודלים ניסיוניים הם: 1) היוצרים הקרדיוציטים באיכות גבוהה (CMs) שיכולים להבטיח את הביצועים העקביים ואת התוצאות הנוזניות; 2) המאפשר לתאים להבשיל בתרבות לפחות 90 ימים כדי להעריך כראוי את פנוטיפ שלהם; 3) ביצוע מחקרים אלקטרולוגיים, למשל סידן (Ca2 +) מדידות ארעי, כדי לספק אפיון פונקציונלי הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית של Ipsc-CMs אנושי. פיתחנו שיטת בידול מבוססת מונאולייר המפיקה iPSC-CMs באיכות גבוהה. השיטה שלנו מסתמכת על כמה גורמים קריטיים והוא גרסה של הפרוטוקולים הקיימים14,18. שלא כמו פרוטוקולים אחרים, זה משתמש בתנאי חמצן נמוך (5% O2) עבור תחזוקה iPSCs, כמו גם במהלך השבוע הראשון של הבידול שלהם ל-CMs. רמות נמוכות של חמצן לחקות את המצב הסביבתי במהלך התפתחות הלב העובריים והעוברי19. תנאים ארוי הוכחו גם להגדיל את התפשטות iPSCs ואת הבידול שלהם בהמשך CMs20. הצפיפות והiPSCs מתאימה גם גורמים קריטיים לבידול לב מוצלח. יעילות בידול גבוהה נצפתה כאשר 70-80% confluent iPSCs הם הנתק לתוך אגרגטים תאים קטנים באמצעות פתרון ללא אנזים, ו הנזרע ביחס מפוצל של 1:6. ניתן להתחיל בידול לב כאשר התאים מגיעים לשטף של 70-80%, צפוי כארבעה ימים לאחר הפיצול. CHIR99021 (10 μM) טיפול בתחילת הבידול יגרום למוות משמעותי בתאים. עם זאת, התפשטות התא היא נצפתה כאשר CHIR99021 מוסר מן התרבות למחרת. האיזון הנכון בין המוות לבין התפשטות התאים הוא חיוני לשימור תרבות מונאולייר לאורך הבידול, שהוא גורם חשוב נוסף לבידול מוצלח. אם צפיפות iPSC היא נמוכה מדי או גבוה מדי, הבידול הבא יהיה יעילות נמוכה בידול הלב (איור 4a, וידאו 2). איור 4מראה כזה דוגמה של בידול יעילות נמוכה, שבו הקרדיוציטים נגזר תורם בריא מעורבבים עם סוגי תאים אחרים, כגון α-השריר חלקה actin-חיובי תאים. חשוב לעשות זאת, Ca2 + ארעיות נרשמו מהכנות כאלה הראה מאפיינים שונים, כגון הנמוך Ca2 + משרעת ודפוסי הפרעות קצב, אשר יכול בקלות להתפרש כווריאציה ביולוגית. יעילות מוצלחת וגבוהה בידול מאותו קו התא, במקום זאת, נוצר אוכלוסייה טהורה של קרדיוציטים כמו לב (איור 4a, וידאו 1) יחד עם הרגילCa 2 + ארעיות (איור 4ב, הלוח העליון). לפיכך, איכות הבידול ממלאת תפקיד חשוב בגודל הכולל, בצורה, בסדירות ובתדירות של Ca2 + ארעי.
היבט חשוב נוסף של בידול מוצלח ויעיל הוא קבלת אוכלוסיה מועשרת של הקרדיוציטים. בעוד תאי גזע מובחן וסוגים אחרים של תאים iPSC-נגזר להשתמש גלוקוז כמקור אנרגיה, CMs יכול להשתמש לקטט ביעילות עבור ATP ו גלוטמט ייצור21. כך, על מנת להשיג אוכלוסייה טהורה יותר של CMs, התאים הם מתורבתים ב לקטט-שיושלם ומדיום התרבות הדלה. מערכת iPSC-CMs ב זה בחירת מדיה במשך זמן רב, עם זאת, עלול לגרום לליקוי פונקציונלי. לכן, כדי לטהר את iPSC-CMs ועדיין לשמר את תפקידם, הבחירה המטבולית מבוצעת רק 10 ימים, מימים 80 עד 90 מאז הבידול. לאחר תקופה זו, מדיית הבחירה מוחלפת והתאים נשמרים במדיה RPMI/B27. בעוד פרוטוקול הבחירה ניתן ליישם הרבה מוקדם יותר22 (למשל, בסביבות יום 15), מומלץ לחכות עד יום 80, כמו ביצוע זה יכול למנוע iPSCs שיורית או סוגים אחרים של תאים מתרבים לפי הזמן התאים מוכנים ללימודים פונקציונליים (יום 90). זה חיוני לכן, כי עבור בידול לב מוצלח, יעיל, וחזק, כל הגורמים הנ ל נלקחים בחשבון.
בנוסף החוסן והיעילות של פרוטוקולים בידול הלב, התבגרות ומפרט סוג תא (g., פרפור וסוגי תאים חדרית) גם להוות אתגר מרכזי עבור שימוש iPSC-CMs למודל למחלות לב. במהלך השנים האחרונות דווחו הרבה אסטרטגיות התבגרות מבטיחות, כולל גירוי חשמלי, למתוח מכני, ואת קשיות המצע23. עם זאת, ממושך בתרבות החוץ-גופית של ipsc-CMs ממשיכה להיות גישה פשוטה ומעשית ליצור מבוגרים כמו קרדיוציטים24,25.
בהתאם לדיווחים אחרים שפורסמו12, ipsc-CMs שנוצר על ידי זה בפרוטוקול בידול מתורבת להראות ביטוי חזק של MLC2V ספציפי לחדר ורמות נמוכות הרבה יותר של MLC2A ביום 90 (איור 2א, ב). בעוד CMs העובר מכילים הן MLC2A ו MLC2V isoforms, מבוגרים למבוגרים המוח רק מכילים MLC2V. בורר זה ב-MLC isoform שכיחות מתרחשת במהלך הבמה של הב,26.
קרדיוציטים שנוצר באמצעות פרוטוקול זה לבטא סמן ספציפי המוח, כגון MLC2V, אשר עולה בהדרגה שפע כמו התאים נשמרים בתרבות יותר (איור 2א, ב). הדבר מצביע על כך שתרבות ממושכת של מבחנה מגבירה את התבגרותו של CMs שנראה מחויב לפנוטיפים החדרית.
הזמן בתרבות גם משפיע מאוד על Ca2 + התבגרותהטיפול 24,25. הדיווחים הקודמים תיארו כי לאחר 20 ימים של בידול, לא היו שינויים משמעותיים ב-Ca החישוב2 + ארעיות כמו התאים גדלו בוגרים25. עם זאת, הקרדיוציטים שנוצר מהפרוטוקול מפורט כאן להראות שינויים מתקדמים ב-Ca2 + משרעת ו-Ca2 + ריקבון על שלוש נקודות זמן מוערך (30, 60, ו 90 ימים לאחר אינדוקציה של בידול הלב) (איור 3A-C). מעניין, נתונים אלה מראים כי Ca2 + פרמטרים ארעי, כגון ca2 + משרעת ו-ca2 + ריקבון, נמדד ביום 90 ipsc-CMs היו דומים לאלה שנמדדו בודד מבודד עכברוש למבוגרים (arcms). יתר על כן, iPSC הישן 90 ימים גם הצליחו לעקוב אחר מגירוי חשמלי שונים החל 0.5 הרץ כדי 3 הרץ בעקביות, בדומה ARCMs (איור 4ב). בעבודה בעתיד, זה יהיה מעניין לראות איך עוד זמן רב בתרבות משפיע על המאפיינים הפונקציונליים של אלה iPSC-CMs לעומת ARCMs.
בנוסף, מאז β-אדררוניק איתות קולטן מראה דפוס ברורים התלויים זמן לאחר האינדוקציה הלב27, את ההשפעה של האיזופנול על Ca2 + ארעי ב ipsc-CMs שנוצר באמצעות פרוטוקול זה נבדק. גירוי עם איזופנול הוביל לתגובת lusitropic חיובית ביום 90 iPSC-CMs, בדומה למה שנצפה ARCMs (איור 3D-F).
ההערכות תפקודית של iPSC-CMs המבוצעים במחקר זה יש כמה הבדלים ומגבלות לעומת CMs בוגרים מבודדים. ל-CMs המבוגר יש סרקומרים מפותחים היטב ומסודרים היטב. הדבר מאפשר המדידות הקונקטיליות דרך זיהוי תנועת סרקומר. מכיוון שאף אחד מהפרוטוקולים הנוכחיים אינו מייצר התבגר מלאה, ipsc-CMs כמו מבוגר, מדידות באופן שוטף דרך זיהוי סרקומר אינם ריאלי. למרות שניתן לזהות את התנועה של קצוות התא כאשר החוזים בתאים, הוא מאתגר באופן משמעותי יותר לעקוב אחר תנועות אלה באופן מדויק ב-iPSC-CMs. נכון לעכשיו, יש צורך בפיתוחים טכנולוגיים כדי לאפשר הערכות מדויקות של הוראות בתאים אלה. מצד שני, ניתן למדוד Ca2 + ארעיות של Ipsc-CMs באמצעות Ca2 + מחוון כמו fura-2. בניגוד ל-CMs למבוגרים, לעומת זאת, iPSC-CMs מקובצים ואין להם גבול מוגדר היטב. לכן, Ca המוקלט2 + ארעיות בדרך כלל אינם מייצגים תא בודד, אלא קבוצה של תאים באזור מסוים. אמנם ניתן להתאים את גודל השטח, הקלטה Ca2 + ארעיות מתא אחד הוא מאוד מאתגר. זה קריטי כי כאשר CMs מצופה על שמיכות, הצפיפות היא כך שהם להשיג התפלגות מונאולייר הומוגנית (וידאו 3), המאפשר למצוא בעקביות אזורים עם תאים. אם התאים אינם מופצים כמו דופלקס על coverslip (וידאו 4), יהיו אזורים ללא תאים, ואם את coverslip מוקרן במיוחד עבור אזורים עם תאים מכים לבצע את המידות, זה יכול להוביל "הטיית בחירה". במקום לבחור אזור מסוים של תאים מכים, מומלץ לאסוף נתונים מאזורים מרובים לאורך הכיסויים, האפשריים רק כאשר התאים מופצים כמונאולייר הומוגנית. מדידות מ 100 אזורים שונים כאלה, אשר לוקח כ 10 דקות, מספיקים כדי לספק תכונות פונקציונלי אמין של התאים. לבסוף, כפי שמוצג באיור 5, Ipsc-CMs צריך זמן כדי להתאים את תנאי המדידה. למדידות אמינות, מומלץ לייצב את התאים בתנאי המדידה לפחות 3 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המענק AHA מדען פיתוח מענק 17SDG33700093 (F.S.); פרס מKL2 של הר סיני לחקר המחקר הקליני והטרנסג KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ו AHA 18TPA34170460 (סי סי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
References
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
- Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
- Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
- Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
- Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
- Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
- Scuderi, G. J., Butcher, J.
- Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).
