Summary
Aqui descrevemos e validamos um método para gerar consistentemente cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos robustos e caracterizar sua função. Essas técnicas podem ajudar no desenvolvimento de insights mecanicistas sobre as vias de sinalização, fornecer uma plataforma para o rastreamento de medicamentos em larga escala e doenças cardíacas de modelo confiável.
Abstract
Cardiomiócitos pluripotentes induzidos por células-tronco induzidas pelo homem (iPSC-CMs) fornecem umavaliosa fonte humana para estudar a ciência básica das vias de manuseio e sinalização de células-tronco de alta taxa de consumo, bem como rastreamento de drogas de alta taxa de rendimento e ensaios de toxicidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada das metodologias usadas para gerar iPSC-CMs de alta qualidade que podem reproduzir consistentemente características moleculares e funcionais em diferentes linhas celulares. Além disso, um método é descrito para avaliar de forma confiável sua caracterização funcional através da avaliação das propriedades de manuseio Ca2+. As condições de baixo oxigênio (O2),a seleção de lactato e o tempo prolongado na cultura produzem cardiomiócitos ventriculares de alta pureza e alta qualidade. Semelhante aos cardiomiócitos de ratos adultos isolados (ARCMs), os iPSC-CMs de 3 meses de idade apresentam maior amplitude Ca2+, taxa mais rápida de recaptação Ca2+ (decay-tau) e uma resposta lusitropical positiva à estimulação β-adrenergizic em comparação com o dia 30 iPSC-CMs. A estratégia é tecnicamente simples, rentável e reproduzível. Ele fornece uma plataforma robusta para modelar a doença cardíaca e para o rastreamento de drogas em grande escala para atingir proteínas de manuseio Ca2+.
Introduction
Cardiomiócitos pluripotentes induzidos pelo homem (iPSC-CMs) são uma atraente plataforma de base humana para modelar uma grande variedade de doenças cardíacas in vitro1,2,3,5,5,6,7. Além disso, o iPSC-CMs pode ser usado para a previsão de respostas do paciente a medicamentos novos ou existentes, para rastrear compostos de acerto e desenvolver novos medicamentos personalizados9,10. No entanto, apesar dos progressos significativos, várias limitações e desafios precisam ser considerados ao usar o iPSC-CMs11. Consequentemente, métodos para melhorar os protocolos de diferenciação cardíaca, para melhorar a eficiência e maturação do iPSC-CMs e gerar subtipos específicos de cardiomiócitos (ventricular, atrial e nodal) têm sido intensamente estudados e já levaram a inúmeras estratégias culturais para superar esses obstáculos12,13,14,15.
Não obstante a robustez desses protocolos, uma grande preocupação com o uso de iPSC-CMs é a reprodutibilidade de procedimentos longos e complexos para obter cardiomiócitos de alta qualidade que possam garantir o mesmo desempenho e resultados reprodutíveis. A reprodutibilidade é crítica não só quando se compara as linhas celulares com diferentes origens genéticas, mas também ao repetir comparações celulares e moleculares da mesma linha celular. A variabilidade celular, como diferenças bem-a-bem na densidade de iPSCs, pode afetar a diferenciação cardíaca, gerando um baixo rendimento e cardiomiócitos de baixa qualidade. Essas células ainda podem ser usadas para realizar experimentos que não exigem uma população pura de CMs (por exemplo, ao realizar medições transitórias Ca2+). De fato, ao realizar análise eletrofisiológica, os não-CMs não baterão, nem espontaneamente nem estimulação elétrica, por isso será fácil excluí-los da análise. No entanto, devido à má qualidade, os iPSC-CMs podem apresentar características eletrofisiológicas alteradas (por exemplo, modificatórias de Ca2+ transitórias, baixa amplitude Ca2+) que não são devidoà sua composição genética. Portanto, especialmente ao usar iPSC-CMs para modelar doença cardíaca, é importante não confundir os resultados de um CM de má qualidade com o fenótipo da doença. Processos cuidadosos de triagem e exclusão são necessários antes de prosseguir em estudos eletrofisiológicos.
Este método inclui protocolos otimizados para gerar cardiomiócitos de alta pureza e alta qualidade e avaliar sua função realizando medições transitórias Ca2+ usando um sistema de aquisição e análise de cálcio e contraciação. Esta técnica é uma maneira simples, mas poderosa, de distinguir entre preparações de alta eficiência e baixa eficiência do iPSC-CM e fornecer uma caracterização mais fisiologicamente relevante de iPSC-CMs humanos.
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Protocol
Os experimentos com cardiomiócitos de ratos adultos neste estudo foram realizados com protocolos aprovados do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Icahn School of Medicine no Monte Sinai. Os cardiomiócitos de rato adultos foram isolados dos corações de rato DeSprague Dawley pelo método baseado em Langendorff, como descrito anteriormente16.
1. Preparação da Mídia
- Prepare a mídia hiPSC.
- Equilibre o suplemento e a temperatura média-sala basal (RT). Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 400 mL do meio basal e 100 mL do suplemento e filtre usando um filtro a vácuo de 0,22 μm. Guarde a 4 °C e equilibre-se com a RT antes de usar.
- Prepare RPMI + B27.
- Equilibre o suplemento B27 e o meio basal (RPMI 1640) a RT. Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 490 mL do meio basal e 10 mL do suplemento 50x e filtro usando um filtro a vácuo de 0,22 μm. Guarde a 4 °C e equilibre-se com a RT antes de usar.
- Prepare insulina RPMI + B27 (-)
- Equilibre o suplemento de insulina B27 (-) e o meio basal (RPMI 1640) a RT. Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 490 mL do meio basal e 10 mL do suplemento 50x e filtro usando um filtro a vácuo de 0,22 μm. Guarde a 4 °C e equilibre-se com a RT antes de usar.
- Prepare mídia de seleção (RPMI (-) glicose + B27 + lactato).
- Equilibre o suplemento B27 e o meio basal (RPMI 1640 (-) glicose) para RT. Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 490 mL do meio basal e 10 mL do suplemento de 50x, adicione 4 mM lactato de sódio constituído em água estéril e filtre usando um filtro a vácuo de 0,22 μm. Guarde a 4 °C e equilibre-se com a RT antes de usar.
- Prepare rpmi 20.
- Equilibre o meio basal (RPMI 1640) a RT. Misture o soro bovino fetal (FBS) (concentração final de 20%) e RPMI. Filtre usando um filtro e loja a vácuo de 0,22 μm a 4°C. Equilibre a RT antes de usar.
- Prepare a mídia de passaging adicionando o inibidor de proteína kinase (2 μM) associado à rho.
- Prepare a mídia D0 adicionando inibidor GSK-3, CHIR 99021 a RPMI + B27 (-) mídia de insulina (final de 10 μM).
- Prepare a mídia D3 e D4 misturando mídia de insulina RPMI + B27 (-) com IWR-1 (5 μM final).
NOTA: D1 e D5 mídia é constituída de RPMI + B27 (-) insulina. A mídia D7 é constituída pela RPMI + B27. - Prepare o buffer de bloqueio (2% de albumina de soro bovina [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 em soro soro amortecida com fosfato [PBS]): Em um tubo cônico de 50 mL, adicione 1 g de BSA, 1 mL da FBS, 49 mL da PBS e 250 μL da NP-40. Misture até dissolver totalmente.
2. Preparação de células-tronco embrionárias humanas (hESC) placas revestidas matrix qualificadas e coverslips
NOTA: Executar todas as etapas uma capa de cultura de tecido esterilizado.
- Descongelar hESC-qualificado solução de estoque matriz durante a noite no gelo em 4 °C. Consulte a folha de especificação do produto para determinar os volumes apropriados de alíquota, pois isso pode variar dependendo do estoque. Guarde esses alíquos a -20 °C em tubos de microcentrírífuga de 1,5 mL.
- A fim de usar a matriz para placas de revestimento ou cobres de vidro, primeiro descongele um alibamento da matriz hESC qualificado a 4 °C por 30 min.
- Aliquot 24 mL do meio eagle modificado (DMEM) de Dulbecco frio): mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F:12) em um tubo cônico de 50 mL.
- Misture a mídia fria DMEM/F:12 com uma pipeta de vidro de 2 mL para resfriar a superfície da pipeta.
- Usando a mesma pipeta, pegue aproximadamente 500-700 μL de DMEM/F:12 frio e misture com o alibquot de matriz hESC qualificado dentro do próprio tubo de microcentrírífuga.
- Uma vez devidamente misturado, transfira a solução para o tubo cônico de 50 mL contendo o Frio DMEM/F:12 e misture novamente.
- Para uma placa padrão de 6 poços, adicione 1 mL desta mistura para cada poço. Certifique-se de que o poço está totalmente coberto. Deixe as placas em RT debaixo da capa da cultura do tecido por pelo menos 30 min. Se desejar, guarde a 4 °C imediatamente após o revestimento por até 1 semana e equilibre-se para RT por 30 minutos antes do uso.
- Para usar as placas, aspirar a matriz e substituir por meios apropriados. Use imediatamente.
- Guarde os lábios de vidro em um ambiente estéril (por exemplo, dentro de um capuz de cultura de tecido estéril).
- Antes do revestimento, limpe cada coverslip individual com 70% de etanol. Uma vez que o coverslip está seco, coloque-o dentro de um poço de um prato estéril 6 bem.
- Tome 250-300 μL da solução de matriz hESC qualificado e cuidadosamente dispensá-lo diretamente para o centro do coverslip de vidro. Deixe os coverslips em RT debaixo da capa da cultura do tecido por pelo menos 30 min antes do uso.
3. Preparação de pequenas moléculas
NOTA: Reconstituir todas as pequenas moléculas e moduladores Wnt em DMSO, salvo indicação em contrário.
- Prepare 10 mM alíquotas de 25 μL cada um de IWR-1 e CHIR 99021 e armazenar a -20 °C.
- Reconstitua 10 mM aliquots de 50 μL cada um de Thiazovivin (inibidor de ROCHA) e armazenar a -20 °C.
4. Manutenção e Passaging de iPSCs
NOTA: Executar todos os seguintes passos um capuz de cultura de tecido estéril.
- Mantenha os iPSCs em placas de poço padrão 6 e realize todas as etapas condições estéreis. Mantenha as células com 2 mL de mídia hiPSC por poço. Mude a mídia a cada dois dias. Mantenha as células a 37 °C, 6% O2,5% CO2. Passar as células quando elas estiverem entre 70 e 80% de confluentes.
- Equilibre PBS sem Ca2+ e Mg2+ para RT.
- Para iniciar o processo de passaging, adicione 1 mL de PBS sem Ca2 + e Mg2 + para o poço que precisa ser passado. Incubate em RT para 7-10 min. Verifique as células debaixo do microscópio para garantir que o tratamento PBS não resultou em dissociação completa do monocamada.
- Remover PBS e substituir por 1 mL de mídia de passagem. Use um levantador de células para raspar suavemente e levantar as células da superfície do poço.
- Mecanicamente dissociar as células usando uma pipeta de vidro estéril 2 mL. Repita até que as células estejam bem dissociadas uniformemente em pequenas colônias quando observadas um microscópio.
- Uma vez que as células tenham sido suficientemente dissociadas, adicione 5 mL de meios de passagem para dividir as células 1:6. Ajuste a quantidade de meios de passagem a ser adicionados para corresponder à relação de divisão preferida.
- Aspirar a matriz hESC qualificado da placa revestida de matriz hESC qualificado e substituir por 1 mL de mídia de passagem por poço. Adicione 1 mL de células dissociadas por poço.
5. Diferenciação cardiomiócito
- Use linhas hiPSC bem estabelecidas (mais de 20 passagens) e exije uma morfologia homogênea antes de iniciar a diferenciação cardíaca.
- Certifique-se de que os iPSCs sejam cerca de 70 a 80% de confluentes.
- Lave as células 1x em PBS sem Ca2 + e Mg2 +.
- Adicione 2 mL de mídia D0 (passo 1,7) por poço e transfira as células de volta para a incubadora.
- Após 24 h, substituir por 3 mL de mídia D1 por poço para 48 h.
- No dia 3, substituir a mídia com 2 mL de mídia D3 por poço. Repita com a mídia D4 no dia 4.
- No dia 5, substituir a mídia com 3 mL de mídia D5 por poço.
- No dia 7, substituir a mídia com 3 mL de mídia D7 por poço e transferir para uma incubadora com 37 °C, 5% CO2, e concentração o2 normal. Substitua a mídia D7 (RPMI + B27) a cada 2 dias.
6. Procedimento de seleção e dissociação do iPSC-CM
- Dez dias antes de realizar as medições transitórias Ca2+ ou qualquer análise funcional, substitua a mídia RPMI + B27 por 3 mL de mídia de seleção por poço por 48 h.
- Substitua a mídia por 3 mL de mídia de seleção por mais 48 h.
- Substitua a mídia por 2 mL de mídia RPMI + B27 por poço por 24 h.
- Casaco padrão 6 placas de poço, conforme descrito na seção 2.
- Adicione 1 mL de trippsina estéreis de 0,25% com EDTA a cada poço. Incubar a placa a 37 °C por 5 min.
- Usando uma pipeta de 1.000 μL, dissociar mecanicamente as células para que as células individuais possam ser vistas quando observadas um microscópio.
- Transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mL e adicione 2 mL de mídia RPMI 20 por poço. Centrífuga por 5 min a 800 x g.
- Assaa o supernatant e resuspende as células na mídia RPMI + B27. Aspirar a matriz hESC qualificado das placas e substituir por 1 mL de mídia RPMI + B27.
- Usando uma ponta de pipeta de 1.000 mL, dissociar mecanicamente a pelota celular até que a solução pareça homogênea.
- Transfira cerca de 500.000 células para cada poço. Transferência para incubadora por 24 h.
- Substitua a mídia por 3 mL de mídia de seleção por poço por 48 h.
- Substitua a mídia por 3 mL de RPMI + B27 por poço. Mantenha as células na mídia D7 (RPMI + B2 mudando a mídia a cada 2 dias até que esteja pronta para análise funcional.
7. Preparação de iPSC-CMs para citometria flow
- Uma vez que as células são da idade desejada e foram submetidos a seleção metabólica (seção 6), lave as células com PBS sem Ca2 + e Mg2 +.
- Adicione 1 mL por poço de trippsina 0,25% e incubar por 5-7 min em 37 °C.
- Pipete a mistura 5-10x com uma ponta P1000 para singularizar as células, e transferir para um tubo de 15 mL contendo 2 mL de RPMI 20.
- Gire as células a 600 x g por 5 min.
- Adicione 100 μL de solução de fixação (4% PFA) à pelota celular. Adicione a solução dropwise com vórtice contínuo, suave e, em seguida, definir no gelo por 15 min.
- Adicione 1,5 mL de PBS. Recolher as células por centrífuga e aspirar o supernatant.
- Para cada experimento, inclua um controle não manchado por fixação/condição de permeabilização.
- Resuspenda as células em 500 μL de solução de bloqueio (2% FBS/2% BSA em PBS com 0,1% NP-40) por 30 min na RT.
- Sem remover a solução de bloqueio, adicione o anticorpo primário MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) e incubar 45 min na RT.
- Lave com tampão de bloqueio. Coletar células por centrífuga e solução aspirada.
- Adicione o anticorpo secundário Alexa Fluor 555/488 (1:750) diluído no buffer de bloqueio por 45 min no RT ou durante a noite em 4 °C.
- Adicione 1,5 mL de PBS. Coletar células por centrífuga e solução aspirada.
- Resuspenda as células em 250-300 μL da PBS. Use uma pipeta P1000 para desagregar as células.
- Prepare tubos de fundo redondocom uma tampa de filtro de célula de malha de nylon de 35 μm. Pré-molhe o filtro celular com 50 μL de PBS e colocou o tubo no gelo.
- Transfira a solução com as células desagregadas para os tubos de fundo redondo com as tampas de filtro celular. Permita que a solução celular escorra naturalmente ou toque no fundo do tubo contra uma superfície plana, conforme necessário, para garantir a drenagem completa e coleta das células no tubo. Certifique-se de definir o tubo de volta no gelo o mais rapidamente possível.
- Lave o filtro celular com 250 μL de PBS para recuperar quaisquer células residuais.
- Mantenha os tubos no gelo e cubra com papel alumínio até a análise de citometria de fluxo.
8. Cardiomiócitos de revestimento em coverslips de vidro
NOTA: Executar todas as etapas em um ambiente estéril.
- Prepare os lábios de vidro, conforme descrito nos passos 2.10 e 2.11.
- Uma vez que os iPSC-CMs foram selecionados e são da idade desejada, siga os passos 6,5-6,7 para dissociar os iPSC-CMs.
- Ascutu o supernatant e resuspende as pilhas em uma quantidade suficiente de meios RPMI 20 para ter aproximadamente 300.000 pilhas por 250 μL.
- Usando uma pipeta de vidro de 2 mL, dissociar mecanicamente a pelota da pilha até que a solução pareça homogênea.
- Aspirar a matriz hESC qualificado s os coverslips.
- Usando uma pipeta 1000 μL, misture e puxe 250 μL da solução do tubo cônico de 15 mL.
- Dispense lentamente os 250 μL da solução para os lábios de vidro, tendo cuidado extra para apenas adicionar à área onde o revestimento de matriz qualificado ao hESC está presente.
- Transfira cuidadosamente para a incubadora e deixe durante a noite, tomando cuidado para não agitar ou espalhar as células nos lábios. Na manhã seguinte, adicione suavemente 2 mL de D7 (RPMI + B27) mídia para cada bem com o coverslip. Mude a mídia depois das 24 h e a cada 2 dias depois disso.
9. Células fixações
- Certifique-se de que uma quantidade adequada de PBS com Ca2 + e Mg2 + é equilibrada para 4 °C.
- Prepare uma solução de paraformaldeído de 4% (PFA) diluída em PBS com Ca2+ e Mg2+ e equilibre-se a 4 °C.
- Uma vez que o iPSC-CMs são de idade adequada, foram submetidos a seleção metabólica (seção 6), e foram banhados em coverslips (seção 8), lave as células 3x com 1 mL de PBS frio com Ca2 + e Mg2 + por poço.
- Adicione 1 mL de FPA frio de 4% e deixe as células em RT debaixo do capô por 15 min.
- Lave as células com PBS frio para remover o excesso de PFA.
- Adicione 2 mL de PBS com Ca2 + e Mg2 + e armazenar a 4 °C.
10. Manchas de imunofluorescência
- Retire pbs das células fixas e adicionar 1 mL de bloqueio buffer. Incubar por 1 h em RT.
- Retire o buffer de bloqueio e adicione o anticorpo primário (5 mg/mL) diluído no buffer de bloqueio. Incubar durante a noite em 4 °C.
- Lave 3x em PBS com Ca2 + e Mg2 + para 5 min cada.
- Adicione o anticorpo secundário diluído no bloqueio do buffer 1:1,000.
- Cubra a placa com papel alumínio para protegê-lo da luz e incubar por 45 min em RT. Mantenha a folha de alumínio para as seguintes etapas.
- Lave 3x em PBS com Ca2 + e Mg2 +, 5 min cada.
- Adicione uma quantidade suficiente de solução de trabalho DAPI para cobrir completamente as células e incubar em RT por 10 min.
- Lave a amostra completamente com PBS com Ca2 + e Mg2 + para remover o excesso de DAPI.
- Pegue novos slides de vidro e adicione uma gota de montagem de mídia no meio. Use o conta-gotas para espalhar uniformemente os meios de montagem. Coloque os lábios com as células de bruços sobre os slides.
NOTA: As células podem ser armazenadas por 30 dias se protegidas da luz.
11. Avaliação dos Transientes Intracelulares Ca2+
- Uma vez que os iPSC-CMs têm pelo menos 3 meses de idade, foram submetidos a seleção metabólica (seção 6), e foram banhados em coverslips, tratá-los com 2 μL de Fura-2, AM (concentração final: 1 μM) e incubado em 37 °C para 10 min.
NOTA: Fura-2 é sensível à luz. Realize todos os procedimentos de carregamento e experimentos no escuro. - Prepare o sistema de aquisição e análise de cálcio e contratividade.
- Alimentar o sistema garantindo que a lâmpada de arco seja iniciada(Figura 1B).
- Coloque a câmara no sistema e conecte os tubos da bomba à enseada e saídas apropriadas e ao fio elétrico do estimulador à câmara, como mostrado na Figura 1C.
- Encha o tubo de perfusão que atravessa o aquecedor inline fluido com a solução do Tyrode preaquecido de 37 °C.
- Ajuste a câmera e emoldurar as dimensões da abertura para minimizar a área de fundo.
- Monte um coverslip de vidro com iPSC-CMs na câmara e prender.
- Adicione 500 μL da solução do Tirode diretamente em cima do deslizamento de vidro preso suavemente e comece a perfundir a câmara (1,5 mL/min) com a solução do Tirode.
- Pace iPSC-CMs com estimulação de campo de 1 Hz usando o estimulador elétrico (10 V, 4 ms).
- Incubar iPSC-CMs na câmara com estimulação de pelo menos 3-5 min para as células lavarem o corante Fura-2 e se adaptarem ao meio ambiente e lavarem o corante fluorescente.
- Ajuste a janela de visualização para a área superior esquerda do deslizamento de vidro.
- Comece a gravar.
- Depois de coletar um fluxo consistente de 5 a 10 picos, clique em Pausa para parar temporariamente de gravar.
- Garantindo que nem o foco nem as dimensões da janela de visualização sejam alterados, mova o palco do microscópio para a área adjacente, movendo-se em direção ao extremo oposto e retome a gravação.
- Repita os passos 11,9 e 11,10 para digitalizar todo o coverslip, inicialmente se movendo para a esquerda, em seguida, para baixo de uma forma zig-zag para cobrir toda a área coverslip. Isso consiste em 80 a 100 medições por coverslip.
NOTA: Restringir o tempo total de medição para 10 min como fatores secundários causar uma diminuição no Ca2 + transitória. - Uma vez que os transientes Ca+ são adquiridos, analisar os dados com a fluorescência traça software de análise de acordo com as instruções do fabricante.
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Representative Results
O protocolo descrito na Figura 1A gerou cardiomiócitos altamente puros que adquirem um fenótipo ventricular/adulto com o tempo na cultura. Conforme avaliado pela coloração de imunofluorescência para a cadeia de luz reguladora de miosina atrial e ventricular 2 isoformes (MLC2A e MLC2V, respectivamente), a maioria das células geradas por este protocolo foi MLC2A-positivo no dia 30 após a indução de diferenciação cardíaca, enquanto MLC2V foi expressa em quantidades muito mais baixas ao mesmo tempo (Figura 2Atop , painels). Como o tempo na cultura aumentou (dia 60 e 90), um interruptor completo de isoformes MLC2 (MLC2A para MLC2V) foi observado (Figura 2A, painéis inferiores). A fim de quantificar as células MLC2A e MLC2V-positivas, a análise de citometria de fluxo foi realizada. De acordo com os resultados da imunofluorescência, os dados de citometria de fluxo demonstraram estágio inicial (dia 30) iPSC-CMs expressando principalmente MLC2A (29,8% MLC2A + vs. 1,9% MLC2V +) (ver Figura 2B, painel esquerdo), em comparação com o estágio tardio (dia 90) iPSC-CMs, que expressou principalmente MLC2V (41,3% MLC2V + vs. 16,7% MLC2A +) (ver Figura 2B, painel direito). Como o padrão de expressão de MLC2A e MLC2V é conhecido por ser uma marca registrada da diferenciação cardíaca e maturação, esses resultados sugerem que o tempo prolongado de cultura aumenta a maturação dos iPSC-CMs e que a maioria das células parece estar comprometida com o fenótipo ventricular. Em seguida, avaliamos a dependência de tempo da maturação de manuseio Ca2+. O transitório Ca2+ foi medido em iPSC-CMs nos três horários de diferenciação (dia 30, 60 e 90), e comparado aos cardiomiócitos de ratos adultos isolados (ARCMs). A amplitude Ca2+ foi significativamente aumentada nos iPSC-CMs no dia 90 e foi semelhante aos ARCMs(Figura 3A,B). A taxa de recaptação Ca2+ (decay-tau) no dia 90 foi significativamente mais rápida em comparação com o dia 30 iPSC-CMs, e mais próxima dos ARCMs(Figura 3C). O efeito da estimulação β-adrenergic em transientes de Ca2+ foi avaliado mais tratando as pilhas com os 10 nM do isoproterenol (ISO) para 10 min em 37 °C. Conforme observado nos ARCMs, o ISO aumentou significativamente o Transitório Ca2+ e acelerou a taxa de recaptação ca2+ no dia 90 iPSC-CMs. Não foram observadas alterações no dia 30 iPSC-CMs(Figura 3D-F). Curiosamente, o dia 90 iPSC-CMs foram capazes de acompanhar o aumento da estimulação elétrica (de 0,5 a 3 Hz), de forma semelhante à observada em ARCMs(Figura 4B). Em conjunto, esses resultados mostram que os iPSC-CMs derivados desse método têm características semelhantes às observadas em CMs nativos, especificamente fenótipos semelhantes a ventriculares, propriedades maduras de manuseio Ca2+e respostas positivas β-adrenergic.
Contaminar as células não cardíacas pode influenciar a maturação funcional dos iPSC-CMs humanos durante a diferenciação17. A Figura 4A mostra uma comparação entre células de 3 meses obtidas a partir de diferenciações de alta eficiência (painéis superiores, Vídeo 1),expressando robustamente o marcador ventricular específico (MLC2V) e células de 3 meses obtidas a partir de diferenciações de baixa eficiência (painéis inferiores, Vídeo 2),mostrando iPSC-CMs misturados com atona muscular al-lisa (αSMA) células positivas. Curiosamente, a análise funcional demonstrou transientes alterados do Ca2+ na preparação mista de iPSC-CMs/não-CMs em comparação com os iPSC-CMs da diferenciação de alta eficiência. Em particular, as células obtidas a partir de diferenciações de baixa eficiência exibiram muito pequena amplitude ca2+ e automaticidade(Figura 4B,painel médio) em comparação com iPSC-CMs puros(Figura 4B,painel superior) e ARVCs (Figura 4B, painel inferior). Além disso, células de diferenciações de baixa eficiência apresentaram padrões arrítmicos(Figura 4C).
É importante notar que os iPSC-CMs mostrados no painel superior da Figura 4A também foram submetidos a seleção metabólica, o que é um passo importante para enriquecer ainda mais uma população de iPSC-CMs que já é derivado de uma diferenciação altamente eficiente. Esses dados indicam que protocolos de diferenciação cardíaca de alta eficiência que geram CMs de alta qualidade são necessários para recapitular com precisão um fenótipo cardíaco in vitro.
A Figura 5 mostra a variabilidade da amplitude Ca2+ em diferentes áreas do monocamada de CMs, traçada ao longo de um curso de tempo de 1.200 s. As amplitudes Ca2+ medidas no início de uma frequência de estimulação de 1 Hz (200 s) foram altamente variáveis e tornaram-se mais consistentes à medida que a estimulação continuou (200-900 s). No entanto, após um período de tempo de 900 s a amplitude Ca2 + foi consideravelmente reduzida. Esses dados indicam que, ao registrar os transientes Ca2+ em iPSC-CMs, é necessário permitir que as células se estabilizem a 37 °C estimulação constante por pelo menos 200 s. Além disso, as gravações devem ser restritas a uma janela de tempo específica (200 a 900 s) para garantir resultados reprodutíveis.
Figura 1: Esquemático geral da preparação iPCS-CMs e instrumentos transitórios Ca2+. (A)Esquemático do protocolo de diferenciação cardíaca mostrando os estágios de desenvolvimento dos iPSCs diferenciadores. Barra de escala = 50 μm. (B) O sistema de aquisição e análise de cálcio e contratividade. a) Bomba peristalitária b) Microscópio invertido c) Fonte de energia para a câmera digital d) Estimulador elétrico e) Interface do sistema de fluorescência f) Controlador de roda de filtro (C) Câmara do sistema. a)Corpo de câmara do sistema. b) Inseto fluido. c) Saída de fluidos. d)Aquecedor de soluções fluidas em linha. f)Eletrodos que ligam a câmara do sistema ao estimulador elétrico. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Comparação da expressão mlc2a e mlc2v em iPSC-CMs em diferentes dias de diferenciação. (A)A coloração de imunofluorescência de iPSC-CMs no dia 30, 60 e 90 após a indução de diferenciação para MLC2A e MLC2V. Barra de escala = 20 μm. (B) Análise de citometria de fluxo de iPSC-CMs para MLC2V e MLC2A em 1 mês e 3 meses após diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Comparação de propriedades iPSC-CMs em diferentes dias de diferenciação. (A)Representante Ca2 + traços transitórios em diferentes dias de diferenciação. (B-C) Amplitude média de Ca2+ e ca2+ decadência provocada durante a estimulação em 1 Hz. (D-F) Efeito do tratamento de isoproterenol (ISO, 10 nM) em iPSC-CMs em diferentes dias de diferenciação. Arcms indicam cardiomiócitos adultos de ratos isolados. N = 70 a 100 áreas; *p< 0,05; p < 0,001, conforme determinado pelo teste tdo aluno. Os dados são representados como Mean ± S.E.M. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Comparação entre alta eficiência e diferenciações de baixa eficiência dos iPSC-CMs. (A)Mancha de imunofluorescência de iPSC-CMs para αSMA e MLC2V. Barra de escala = 20 μm. (B) Traços representativos mostrando os transientes Ca2+ de alta eficiência (acima) e diferenciações de baixa eficiência (média), e cardiomiócitos adultos de ratos isolados (abaixo). Os miócitos foram estimulados em 0,5 Hz, 1 Hz, 1,5 Hz, 2 Hz e 3 Hz. (C)Traço representativo mostrando um padrão arrítmico de uma má diferenciação. As flechas indicam um ritmo de ponto. Arcms indica cardiomiócitos adultos de rato isolados. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Amplitude Ca2+ dependente do tempo de um único coverslip. As amplitudes de Ca2+ das áreas diferentes em um coverslip foram traçadas em uma maneira time-dependent. Períodos de tempo não recomendados para medir o transitório Ca2+ são indicados nas áreas frustradas (<200s ou >900 s). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Vídeo 1: Vídeo representativo mostrando um exemplo de uma diferenciação de alta eficiência. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Vídeo representativo mostrando um exemplo de uma diferenciação de baixa eficiência. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 3: Vídeo representativo mostrando um exemplo de uma distribuição homogênea monocamada de iPSC-CMs em um coverslip de vidro. Este vídeo mostra a densidade celular recomendada para ser usada para análise funcional. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 4: Vídeo representativo mostrando um exemplo de células de uma diferenciação de baixa eficiência banhada em um coverslip de vidro. As células do vídeo foram obtidas a partir de uma diferenciação de baixa eficiência. Células de tais diferenciações geralmente não são distribuídas homogeneamente em todo o deslizamento de capa e é difícil encontrar consistentemente células batendo. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Passos críticos para o uso de iPSC-CMs humanos como modelos experimentais são: 1) gerando cardiomiócitos de alta qualidade (CMs) que podem garantir o desempenho consistente e resultados reprodutíveis; 2) permitir que as células amadureçam na cultura por pelo menos 90 dias para avaliar adequadamente seu fenótipo; 3) realização de estudos eletrofisiológicos, por exemplo, medidas transitórias de cálcio (Ca2+),para fornecer uma caracterização funcional fisiologicamente relevante de iPSC-CMs humanos. Desenvolvemos um método de diferenciação baseado em monocamadas que produz iPSC-CMs ventriculares de alta qualidade. Nosso método depende de vários fatores cruciais e é uma variante dos protocolos existentes14,18. Ao contrário de outros protocolos, este usa condições baixas do oxigênio (5% O2)para a manutenção dos iPSCs assim como durante a primeira semana de sua diferenciação em CMs. Baixos níveis de oxigênio imitam a condição ambiental durante o desenvolvimento embrionário e fetal do coração19. Condições hipóxicos também têm sido mostrados para aumentar a proliferação iPSCs e sua diferenciação subseqüente para CMs20. Densidade de semeada e passaging iPSCs adequada também são fatores críticos para uma diferenciação cardíaca bem sucedida. A eficiência de diferenciação elevada é observada quando os iPSCs confluentes de 70 a 80% são dissociados em agregados de pequenas células usando uma solução livre de enzimas e sem sementes a uma proporção dividida de 1:6. A diferenciação cardíaca pode ser iniciada quando as células atingem uma confluência de 70 a 80%, esperada cerca de 4 dias após a separação. Chir99021 (10 μM) tratamento no início da diferenciação irá causar morte celular significativa. No entanto, a proliferação celular é observada quando chir99021 é removido da cultura no dia seguinte. Um equilíbrio correto entre morte celular e proliferação é essencial para preservar uma cultura monocamada ao longo da diferenciação, que é outro fator importante para uma diferenciação bem-sucedida. Se a densidade do iPSC for muito baixa ou muito alta, a diferenciação subsequente será uma diferenciação cardíaca de baixa eficiência (Figura 4A, Vídeo 2). A Figura 4A mostra um exemplo de uma diferenciação de baixa eficiência, onde os cardiomiócitos derivados de um doador saudável são misturados com outros tipos de células, como células positivas α-lisas da actina muscular. É importante ressaltar que os transientes Ca2+ registrados a partir de tais preparações apresentaram características alteradas, como baixa amplitude Ca2+ e padrões arrítmicos, que poderiam ser facilmente mal interpretados como variação biológica. Uma diferenciação bem-sucedida e de alta eficiência da mesma linha celular, em vez disso, gerou uma população pura de cardiomiócitos ventriculares (Figura 4A, Vídeo 1),juntamente com transientesca+ regulares (Figura 4B,painel superior). Assim, a qualidade da diferenciação desempenha um papel importante na magnitude geral, forma, regularidade e frequência de um transitório Ca2+.
Outro aspecto importante de uma diferenciação bem-sucedida e eficiente é a obtenção de uma população enriquecida de cardiomiócitos. Enquanto células-tronco indiferenciadas e outros tipos de células derivadas do iPSC usam glicose como fonte de energia, os CMs podem usar lactato de forma eficiente para atp e glutamato produção21. Assim, a fim de obter uma população ainda mais pura de CMs, as células são cultivadas em lactato-suplementos e glicose esgotados meio de cultura. Cultivar iPSC-CMs nesta mídia de seleção por um longo tempo, no entanto, pode levar a comprometimento funcional. Portanto, para purificar os iPSC-CMs e ainda preservar sua função, a seleção metabólica é realizada apenas por 10 dias, dos dias 80 a 90 desde a indução de diferenciação. Após este período, os meios de seleção são substituídos, e as células são mantidas na mídia RPMI/B27. Embora o protocolo de seleção possa ser implementado muito mais cedo22 (por exemplo, por volta do dia 15), é aconselhável esperar até o dia 80, pois isso pode evitar que iPSCs residuais ou outros tipos de células proliferem no momento em que as células estão prontas para estudos funcionais (dia 90). É vital, portanto, que, para uma diferenciação cardíaca bem-sucedida, eficiente e robusta, todos os fatores acima mencionados sejam levados em consideração.
Além da robustez e eficiência dos protocolos de diferenciação cardíaca, maturação e especificação do tipo celular (por exemplo, tipos de células atrial e ventricular) também representam um grande desafio para o uso de iPSC-CMs para modelar doença cardíaca. Ao longo dos últimos anos, muitas estratégias promissoras de maturação têm sido relatadas, incluindo estimulação elétrica, alongamento mecânico e rigidez de substrato23. No entanto, a cultura in vitro prolongada do iPSC-CMs continua a ser uma abordagem simples e prática para gerar cardiomiócitos adultos24,25.
Consistente com outros relatórios publicados12, iPSC-CMs gerados por este protocolo de diferenciação in vitro mostram expressão robusta de MLC2V específico do ventrículo e níveis muito mais baixos de MLC2A no dia 90 (Figura 2A,B). Enquanto os CMs fetais contêm isoformas MLC2A e MLC2V, os CMs ventriculares adultos contêm apenas MLC2V. Essa mudança na prevalência de isoforme do MLC ocorre durante a fase neonatal26.
Cardiomiócitos gerados através deste protocolo expressam marcador específico ventricular, como o MLC2V, que aumenta progressivamente em abundância à medida que as células são mantidas na cultura por mais tempo(Figura 2A,B). Isso indica que uma cultura in vitro prolongada melhora a maturação de CMs que parecem estar comprometidos com o fenótipo ventricular.
O tempo na cultura também afeta muito ca2+ manipulação maturação24,25. Relatórios anteriores descreveram que, após 20 dias de indução de diferenciação, não houve grandes mudanças nos transientes calc Ca2+, à medida que as células cresciam25. No entanto, os cardiomiócitos gerados a partir do protocolo detalhado aqui mostram mudanças progressivas na amplitude Ca2+ e ca2+ decadência nos três pontos de tempo avaliados (30, 60 e 90 dias após a indução de diferenciação cardíaca) (Figura 3A-C). Curiosamente, esses dados mostram que os parâmetros transitórios Ca2+, como a amplitude Ca2+ e a decadência Ca2+, medidos no dia 90 iPSC-CMs foram semelhantes aos medidos em cardiomiócitos adultos de ratos isolados (ARCMs). Além disso, os 90 dias de idade iPSC-CMs também foram capazes de acompanhar várias estimulaçãos elétricas que variam de 0,5 Hz a 3 Hz de forma consistente, semelhante aos ARCMs (Figura 4B). Em trabalhos futuros, seria interessante ver como um tempo ainda maior na cultura afeta as características funcionais desses iPSC-CMs em comparação com os ARCMs.
Além disso, uma vez que a sinalização do receptor β-adrenergic mostra um padrão maluzizado distinto dependente do tempo após a indução cardíaca27,o efeito do isoproterenol no ca2+ transiente em iPSC-CMs gerados através deste protocolo foi testado. A estimulação com isoproterenol levou a uma resposta lusitropical positiva no dia 90 iPSC-CMs, semelhante ao que é observado em ARCMs(Figura 3D-F).
As avaliações funcionais dos iPSC-CMs realizadas neste estudo têm algumas diferenças e limitações em comparação com os CMs adultos isolados. Os CMs adultos têm sarcomeres bem desenvolvidos e bem organizados. Isso permite medições de contratividade por meio da detecção do movimento sarcomere. Como nenhum dos protocolos atuais gera iPSC-CMs totalmente amadurecidos, as medições de contratilidade por meio da detecção de sarcomere não são viáveis. Embora seja possível detectar o movimento das bordas celulares quando a célula se contrai, é significativamente mais desafiador rastrear esses movimentos de forma precisa em iPSC-CMs. A partir de agora, os avanços tecnológicos são necessários para permitir avaliações precisas da contrailidade nessas células. Por outro lado, é possível medir os transientes Ca2+ dos iPSC-CMs usando um indicador Ca2+ como fura-2. Ao contrário dos CMs adultos, no entanto, os iPSC-CMs estão agrupados e não têm uma fronteira bem definida. Portanto, os transientes Ca+ registrados geralmente não representam uma única célula, mas sim um grupo de células em uma área específica. Embora seja possível ajustar o tamanho da área, gravar transientes Ca2+ de uma única célula é incrivelmente desafiador. É fundamental que, quando os CMs são banhados nos lábios, a densidade é tal que eles atinjam uma distribuição homogênea de monocamadas(Vídeo 3),que permite encontrar consistentemente áreas com células. Se as células não forem distribuídas como uma monocamada no coverslip(Vídeo 4),haverá áreas sem células, e se o coverslip for rastreado especificamente para áreas com células batendo para realizar as medições, isso pode levar a um "viés de seleção". Em vez de selecionar uma área específica de células batendo, recomenda-se coletar dados de várias áreas em todo o deslizamento de cobertura, o que só é possível quando as células são distribuídas como uma monocamada homogênea. Medições de 100 áreas tão diferentes, que levam cerca de 10 min, são suficientes para fornecer propriedades funcionais confiáveis das células. Por fim, como mostra a Figura 5,os iPSC-CMs precisam de tempo para se ajustar às condições de medição. Para medições confiáveis, recomenda-se que as células sejam estabilizadas nas condições de medição por pelo menos 3 min.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 e AHA 18TPA34170460 (C.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
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