Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Generatie van ventriculaire-achtige HiPSC-afgeleide cardio myocyten en hoogwaardige celpreparaten voor de karakterisering van calcium behandeling

Published: January 17, 2020 doi: 10.3791/60135

Summary

Hier beschrijven en valideren we een methode voor het consequent genereren van robuuste menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardio myocytes en karakteriseren hun functie. Deze technieken kunnen helpen bij het ontwikkelen van mechanistisch inzicht in signalering trajecten, bieden een platform voor grootschalige drug screening, en betrouwbaar model cardiale ziekten.

Abstract

Menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) bieden een waardevolle menselijke bron voor het bestuderen van de basiswetenschap van calcium (CA2 +) handling en signalering trajecten evenals high-throughput drug screening en toxiciteit testen. Hierin geven we een gedetailleerde beschrijving van de methoden die worden gebruikt voor het genereren van hoogwaardig iPSC-CMs dat moleculaire en functionele kenmerken consistent kan reproduceren over verschillende cellijnen. Bovendien wordt een methode beschreven om hun functionele karakterisering te beoordelen door de evaluatie van CA2 + handling-eigenschappen. Lage zuurstof (O2) voorwaarden, lactaat selectie, en langdurige tijd in de cultuur produceren hoge zuiverheid en hoge kwaliteit ventriculaire-achtige cardio myocyten. Vergelijkbaar met geïsoleerde volwassen rat cardiomyocyten (ARCMs), 3-maand-oude iPSC-CMs vertonen hogere CA2 + amplitude, sneller tempo van CA2 + reuptake (Decay-tau), en een positieve lusitropic respons op β-adrenerge stimulatie in vergelijking met dag 30 IPSC-CMS. De strategie is technisch eenvoudig, kostenbesparend en reproduceerbaar. Het biedt een robuust platform voor het modelleren van hartziekten en voor de grootschalige geneesmiddelen screening gericht op ca2 + handling eiwitten.

Introduction

Menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (IPSC-CMs) zijn een aantrekkelijk mens-gebaseerd platform om een grote verscheidenheid aan hartziekten in vitro1,2,3,4,5,6,7,8te modelleren. Bovendien kan IPSC-CMs worden gebruikt voor de voorspelling van patiënt reacties op nieuwe of bestaande geneesmiddelen, om hit verbindingen te scherm en nieuwe gepersonaliseerde drugs te ontwikkelen9,10. Echter, ondanks aanzienlijke vooruitgang, verschillende beperkingen en uitdagingen moeten worden overwogen bij het gebruik van iPSC-CMs11. Dientengevolge, methoden om cardiale differentiatie protocollen te verbeteren, om de efficiëntie en rijping van IPSC-CMs te verbeteren en om specifieke hartspier subtypen (ventriculaire, atriale en nodal) te genereren, zijn intens bestudeerd en hebben al geleid tot talrijke cultuur strategieën om deze hindernissen te overwinnen12,13,14,15.

Niettegenstaande de robuustheid van deze protocollen, is een belangrijke zorg voor het gebruik van iPSC-CMs de reproduceerbaarheid van lange en complexe procedures om hoogwaardige cardio myocytes te verkrijgen die dezelfde prestaties en reproduceerbare resultaten kunnen garanderen. Reproduceerbaarheid is niet alleen essentieel bij het vergelijken van cellijnen met verschillende genetische achtergronden, maar ook bij het herhalen van cellulaire en moleculaire vergelijkingen van dezelfde cellijn. Celvariabiliteit, zoals well-to-well verschillen in iPSCs-dichtheid, kan cardiale differentiatie beïnvloeden, waardoor een lage opbrengst en cardiomyocyten van slechte kwaliteit worden gegenereerd. Deze cellen kunnen nog steeds worden gebruikt om experimenten uit te voeren waarvoor geen zuivere populatie CMs nodig is (bijvoorbeeld bij het uitvoeren van CA2 + tijdelijke metingen). Inderdaad, bij het uitvoeren van elektrofysiologische analyse zal het niet-CMs niet kloppen, noch spontaan noch onder elektrische stimulatie, dus het zal gemakkelijk zijn om ze uit de analyse uit te sluiten. Vanwege de slechte kwaliteit kan iPSC-CMs echter veranderde elektrofysiologische kenmerken vertonen (bijv. onregelmatige CA2 + voorbijgaande, lage CA2 + amplitude) die niet te wijten zijn aan hun genetische make-up. Daarom, vooral bij het gebruik van iPSC-CMs om cardiale ziekte te modelleren, is het belangrijk om de resultaten van een slechte kwaliteit CM met de ziekte fenotype niet te verwarren. Voorafgaand aan elektrofysiologische studies zijn zorgvuldige screening-en uitsluitings processen vereist.

Deze methode omvat geoptimaliseerde protocollen voor het genereren van hoge zuiverheid en hoge kwaliteit cardiomyocyten en om hun functie te beoordelen door het uitvoeren van CA2 + voorbijgaande metingen met behulp van een calcium en contractiliteit acquisitie en analysesysteem. Deze techniek is een eenvoudige, maar krachtige manier om onderscheid te maken tussen hoge efficiëntie en lage efficiëntie iPSC-CM-preparaten en een fysiologisch relevante karakterisering van humaan iPSC-CMs te bieden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experimenten met volwassen rat cardiomyocyten in deze studie werden uitgevoerd met goedgekeurde institutionele dierenverzorging en gebruiks Comité (IACUC) protocollen van de Icahn school of Medicine op de berg Sinaï. De volwassen rat cardiomyocyten werden geïsoleerd van Sprague Dawley rat Hearts door de Langendorff-gebaseerde methode zoals eerder beschreven16.

1. voorbereiding van de media

  1. Bereid hiPSC media voor.
    1. Het supplement en het basale medium op kamertemperatuur (RT). Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 400 mL van het basale medium en 100 mL van het supplement en filter met behulp van een vacuümgestuurde filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C en voor gebruik op RT.
  2. Bereid RPMI + B27.
    1. Evenwichts het B27 supplement en het basale medium (RPMI 1640) naar RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 490 mL Basaal medium en 10 mL van het 50x-supplement en filter met een vacuümgestuurde filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C en voor gebruik op RT.
  3. Bereid RPMI + B27 (-) insuline.
    1. Evenwicht tussen het B27 (-) insuline supplement en het basale medium (RPMI 1640) naar RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 490 mL Basaal medium en 10 mL van het 50x-supplement en filter met een vacuümgestuurde filter van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C en voor gebruik op RT.
  4. Maak selectie media (RPMI (-) glucose + B27 + lactaat).
    1. Evenwichts het B27 supplement en het basale medium (RPMI 1640 (-) glucose) naar RT. Zorg ervoor dat het supplement volledig is ontdooid. Meng 490 mL Basaal medium en 10 mL van het 50x supplement, Voeg 4 mM natrium lactaat in steriel water toe en filtreer met behulp van een 0,22 μm vacuümgestuurde filter. Bewaren bij 4 °C en voor gebruik op RT.
  5. Bereid RPMI 20.
    1. Het basale medium (RPMI 1640) naar RT. Meng foetaal runderserum (FBS) (20% eindconcentratie) en RPMI. Filter met een vacuüm filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C. Voor gebruik op RT.
  6. Bereid de doorgang van de media door het toevoegen van Rho-geassocieerde, spiraalvormige spoel met proteïne kinase (GESTEENTE) remmer (2 μM eindconcentratie) aan hiPSC media.
  7. Maak D0 media klaar door GSK-3-remmer toe te voegen, CHIR 99021 naar RPMI + B27 (-) insuline media (10 μM Final).
  8. Bereid de D3-en D4-media voor door RPMI + B27 (-) insuline dragers te mengen met IWR-1 (5 μM Final).
    Opmerking: D1-en D5-media zijn samengesteld uit RPMI + B27 (-) insuline. D7 media is samengesteld uit RPMI + B27.
  9. Bereid blokkerende buffer (2% boviene serumalbumine [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]): Voeg in een conische buis van 50 mL 1 g BSA, 1 mL FBS, 49 mL PBS en 250 μL NP-40 toe. Meng tot volledig opgelost.

2. bereiding van menselijke embryonale stamcel (hESC)-gekwalificeerde matrix gecoate platen en Dekstroken

Opmerking: Voer alle stappen uit onder een gesteriliseerde weefsel cultuurkap.

  1. Ontdooien hESC-gekwalificeerde matrix stockoplossing 's nachts op ijs bij 4 °C. Raadpleeg het productspecificatie blad om de juiste volumes te bepalen, aangezien dit afhankelijk van de voorraad kan variëren. Bewaar deze aliquots bij-20 °C in 1,5 mL micro centrifugebuizen.
  2. Om de matrix voor coating platen of glazen dekstroken te gebruiken, ontdooit u gedurende 30 minuten eerst een aliquot van de met hESC gekwalificeerde matrix bij 4 °C.
  3. Aliquot 24 mL van koude Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium (DMEM): nutriënten mengsel F-12 (DMEM/F: 12) media in een conische buis van 50 mL.
  4. Meng de Cold DMEM/F: 12 media met een glazen pipet van 2 mL om het oppervlak van de pipet af te koelen.
  5. Gebruik dezelfde Pipet, neem ongeveer 500 − 700 μL koude DMEM/F: 12 en meng met de hESC-gekwalificeerde matrix aliquot binnen de microcentrifuge buis zelf.
  6. Eenmaal goed gemengd, breng de oplossing over naar de 50 mL conische buis met de koude DMEM/F: 12 en meng opnieuw.
  7. Voeg voor een standaard 6-goed plaat 1 mL van dit mengsel toe aan elk goed. Zorg ervoor dat de put volledig gedekt is. Laat de platen ten minste 30 minuten onder de weefselkweek kap staan. Indien gewenst, bewaren bij 4 °C onmiddellijk na het beplating gedurende maximaal 1 week en op RT gedurende 30 minuten voorafgaand aan gebruik.
  8. Om de platen te gebruiken, aspireren de matrix en vervangen door de juiste media. Onmiddellijk gebruiken.
  9. Bewaar de glazen dekstroken in een steriele omgeving (bijv. in een steriele weefselkweek).
  10. Veeg vóór de coating elke afzonderlijke afdek mantel af met 70% ethanol. Als de afdekplaat droog is, plaats deze dan in een goed van een steriele 6-put.
  11. Neem 250 − 300 μL van de hESC-gekwalificeerde matrix oplossing en doseer deze voorzichtig rechtstreeks op het midden van de glazen afdekplaat. Laat gedurende minstens 30 minuten voor gebruik de dekstroken bij RT onder de weefselkweek kap staan.

3. bereiding van kleine moleculen

Opmerking: Reconstitueer alle kleine moleculen en WNT-modulatoren in DMSO tenzij anders vermeld.

  1. Bereid 10 mM aliquots van 25 μL elk van IWR-1 en CHIR 99021 en bewaar bij-20 °C.
  2. Reconstitueer 10 mM aliquots van 50 μL elk van Thiazovivin (ROTSREMMER) en bewaar bij-20 °C.

4. onderhoud en passage van iPSCs

Opmerking: Voer alle volgende stappen uit onder een steriele weefselkweek.

  1. Onderhoud de iPSCs in standaard 6 well Plates en voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden. Handhaaf de cellen met 2 mL hiPSC media per put. Verander de media om de andere dag. Houd de cellen bij 37 °C, 6% O2,5% co2. Doorgang van de cellen tussen 70 − 80% Confluent.
  2. PBS zonder CA2 + en mg2 + tot RT.
  3. Om het afdraaien proces te starten, voeg 1 ml PBS zonder CA2 + en mg2 + toe aan de put die moet worden gepasteerd. Incuberen bij RT gedurende 7 − 10 min. Controleer de cellen onder de Microscoop om ervoor te zorgen dat de PBS-behandeling niet tot volledige dissociatie van de monolaag heeft geleid.
  4. Verwijder PBS en vervang deze door 1 mL doorgangen. Gebruik een mobiele lifter om voorzichtig te schrasen en til de cellen van het oppervlak van de put.
  5. Laat de cellen mechanisch ontkoppelen met een steriele glazen pipet van 2 mL. Herhaal dit totdat de cellen goed zijn gedissocieerd in kleine kolonies wanneer ze onder een microscoop worden waargenomen.
  6. Zodra de cellen voldoende zijn losgekoppeld, voeg 5 ml van de afdraaien media om de cellen te splitsen 1:6. Pas de hoeveelheid door te voegen media aan die moet worden toegevoegd aan de gewenste gesplitste verhouding.
  7. Aspirate de hesc-gekwalificeerde matrix van de hesc-gekwalificeerde matrix-gecoate plaat en vervang met 1 ml van de afdraaien media per put. Voeg per put 1 ml gezien cellen toe.

5. cardiomyocyte differentiatie

  1. Gebruik hiPSC-lijnen die goed zijn opgebouwd (meer dan 20 passages) en vertonen een homogene morfologie voordat u begint met cardiale differentiatie.
  2. Zorg ervoor dat de iPSCs ongeveer 70 − 80% Confluent zijn.
  3. Was de cellen 1x in PBS zonder CA2 + en mg2 +.
  4. Voeg 2 mL D0 media (stap 1,7) per put toe en breng de cellen terug naar de incubator.
  5. Na 24 uur vervangen door 3 mL D1 media per put voor 48 h.
  6. Op dag 3 vervangt u de media door 2 mL D3 media per well. Herhaal met D4-media op dag 4.
  7. Op dag 5 vervangt u de media door 3 mL D5-media per put.
  8. Op dag 7 vervangt u de media door 3 mL D7 media per put en gaat u over naar een incubator met 37 °C, 5% CO2en een normale O2 -concentratie. Vervang de D7 (RPMI + B27) media elke 2 dagen.

6. selectie procedure en dissociatie van iPSC-CM

  1. Tien dagen voor het uitvoeren van de CA2 + Transient metingen of een functionele analyse, vervang de rpmi + B27 media met 3 ml selectie medium per well voor 48 h.
  2. Vervang de media door 3 mL selectie media voor nog eens 48 h.
  3. Vervang de media door 2 mL RPMI + B27 media per well voor 24 uur.
  4. Coat standaard 6 goed platen zoals beschreven in rubriek 2.
  5. Voeg aan elk goed 1 mL steriele 0,25% trypsine toe met EDTA. Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  6. Gebruik een pipet van 1.000 μL om de cellen mechanisch te ontkoppelen, zodat enkelvoudige cellen kunnen worden gezien wanneer ze onder een microscoop worden waargenomen.
  7. Breng de cellen over in een steriele 15 mL conische buis en voeg per put 2 mL RPMI 20 media toe. Centrifugeer 5 min bij 800 x g.
  8. Aspireren de supernatant en respenderen de cellen in RPMI + B27 media. Aspirate de door hESC gekwalificeerde matrix van de platen en vervang met 1 mL RPMI + B27 media.
  9. Gebruik een pipetpunt van 1.000 mL om de celpellet mechanisch te ontkoppelen totdat de oplossing homogeen is.
  10. Breng ongeveer 500.000 cellen over naar elk goed. Transfer naar incubator voor 24 uur.
  11. Vervang de media met 3 mL selectie medium per put voor 48 h.
  12. Vervang de media door 3 mL RPMI + B27 per well. Houd cellen in D7 media (RPMI + B2 veranderende media om de 2 dagen totdat ze klaar zijn voor de functionaalanalyse.

7. voorbereiding van iPSC-CMs voor Flowcytometrie

  1. Zodra de cellen van de gewenste leeftijd zijn en metabole selectie hebben ondergaan (rubriek 6), was de cellen met PBS zonder CA2 + en mg2 +.
  2. Voeg 1 mL per put van trypsine 0,25% toe en inincuberen gedurende 5 − 7 minuten bij 37 °C.
  3. Pipetteer het mengsel 5 − 10x met een P1000 tip om de cellen te singulariseren en breng over in een buis van 15 mL met 2 mL RPMI 20.
  4. Draai de cellen op 600 x g gedurende 5 minuten.
  5. Voeg 100 μL fixatie oplossing (4% PFA) toe aan de celpellet. Voeg de oplossing druppelsgewijs toe met continue, zachte grondig en stel vervolgens 15 minuten op ijs.
  6. Voeg 1,5 mL PBS toe. Verzamel de cellen door centrifugeren en aspireren het supernatant.
  7. Neem voor elk experiment één Onbevlekte controle per fixatie/permeabilization aandoening op.
  8. Respendeer cellen in 500 μL blokkerende oplossing (2% FBS/2% BSA in PBS met 0,1% NP-40) gedurende 30 minuten bij RT.
  9. Voeg, zonder de blokkerende oplossing te verwijderen, het primaire antilichaam MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) toe en inincuberen 45 min bij RT.
  10. Wassen met blokkerende buffer. Cellen verzamelen door centrifugeren en aspiraat-oplossing.
  11. Voeg secundair antilichaam Alexa Fluor 555/488 (1:750) verdund in de blokkerende buffer voor 45 min bij RT of 's nachts bij 4 °C.
  12. Voeg 1,5 mL PBS toe. Cellen verzamelen door centrifugeren en aspiraat-oplossing.
  13. Respendeer cellen in 250 − 300 μL PBS. Gebruik een P1000 pipet om de cellen te scheiden.
  14. Bereid ronde bodem buizen met een 35 μm nylon mesh Cell zeef dop. Pre-Bevochtig de celzeef met 50 μL PBS en zet de buis op ijs.
  15. Breng de oplossing met de uitgesplitste cellen over naar de ronde bodem buizen met de celstrainer doppen. Laat de celoplossing natuurlijk afvoeren of tik op de bodem van de buis tegen een vlak oppervlak, indien nodig, om volledige drainage en verzameling van de cellen in de buis te garanderen. Zorg ervoor dat je de tube zo snel mogelijk weer op ijs zet.
  16. Spoel de celzeef af met 250 μL PBS om eventuele rest cellen te herstellen.
  17. Onderhoud de buizen op ijs en bedek met aluminiumfolie tot flow cytometrie analyse.

8. plating cardiomyocytes op glazen Dekglakjes

Opmerking: Voer alle stappen uit in een steriele omgeving.

  1. Maak de glazen dekstroken zoals beschreven in de stappen 2,10 en 2,11.
  2. Zodra het iPSC-CMs is geselecteerd en van de gewenste leeftijd is, volgt u stap 6.5 − 6.7 om het iPSC-CMs te ontkoppelen.
  3. Zuig de supernatant op en hervat de cellen in een voldoende hoeveelheid RPMI 20-media om ongeveer 300.000 cellen per 250 μL te hebben.
  4. Gebruik een glazen pipet van 2 mL om de celpellet mechanisch te ontkoppelen totdat de oplossing homogeen lijkt.
  5. Aspirate de hESC-gekwalificeerde matrix uit de dekstroken.
  6. Meng en trek 250 μL van de oplossing uit de conische buis van 15 mL met behulp van een pipet van 1000 μL.
  7. Breng de 250 μL van de oplossing langzaam op de glazen Dekbladen aan, waarbij u extra voorzichtig moet zijn om alleen toe te voegen aan het gebied waar de hESC-gekwalificeerde matrix coating aanwezig is.
  8. Breng voorzichtig naar de incubator en laat 's nachts, zorg dat u de cellen op de dekstroken niet schudt of verspreidt. De volgende ochtend, voeg voorzichtig 2 mL D7 (RPMI + B27) media toe aan elk goed met de coverslip. Verander de media na 24 uur en elke 2 dagen daarna.

9. cellen repareren

  1. Zorg ervoor dat een adequate hoeveelheid PBS met CA2 + en mg2 + wordt geëscaleerd tot 4 °c.
  2. Bereid een 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing, verdund in PBS met CA2 + en mg2 + en evenwichtig tot 4 °c.
  3. Zodra de iPSC-CMs van geschikte leeftijd zijn, hebben metabole selectie ondergaan (sectie 6), en zijn verguld op dekstroken (sectie 8), was de cellen 3x met 1 mL koude PBS met CA2 + en mg2 + per put.
  4. Voeg 1 mL koude 4% PFA toe en laat de cellen gedurende 15 minuten bij RT onder de motorkap staan.
  5. Was de cellen met koude PBS om overtollige PFA te verwijderen.
  6. Voeg 2 mL PBS toe met CA2 + en mg2 + en bewaar bij 4 °c.

10. immunofluorescentie kleuring

  1. Verwijder PBS uit de vaste cellen en voeg 1 mL blokkerende buffer toe. Incuberen gedurende 1 uur bij RT.
  2. Verwijder de blokkerende buffer en voeg het primaire antilichaam (5 mg/mL) verdund in de blokkerende buffer toe. Inincuberen op 4 °C.
  3. Was 3x in PBS met CA2 + en mg2 + gedurende 5 minuten per stuk.
  4. Secundair antilichaam toevoegen verdund in blokkerende buffer 1:1000.
  5. Bedek de plaat met aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht en inincuberen voor 45 min bij RT. Houd de aluminiumfolie voor de volgende stappen.
  6. Was 3x in PBS met CA2 + en mg2 +, 5 min elk.
  7. Voeg een voldoende hoeveelheid DAPI-werkoplossing toe om de cellen volledig te bedekken en gedurende 10 minuten bij RT te incuberen.
  8. Was het monster grondig met PBS met CA2 + en mg2 + om overtollige DAPI te verwijderen.
  9. Neem nieuwe glaasjes en voeg in het midden een druppel bevestigings media toe. Gebruik de druppelaar om de bevestigings media gelijkmatig te verdelen. Zet de afdekplaatjes met de cellen naar beneden op de dia's.
    Opmerking: cellen kunnen gedurende 30 dagen worden opgeslagen als ze beschermd zijn tegen licht.

11. beoordeling van intracellulaire CA2 + transiënten

  1. Zodra het iPSC-CMs ten minste 3 maanden oud is, een metabole selectie heeft ondergaan (rubriek 6) en zijn geplateerd op dekstroken, behandel ze dan met 2 μL Fura-2, AM (eindconcentratie: 1 μM) en inincuberen bij 37 °C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Fura-2 is lichtgevoelig. Voer alle laadprocedures en experimenten uit in het donker.
  2. Bereid het calcium-en contractiliteits overname-en analysesysteem voor.
    1. Schakel het systeem in om ervoor te zorgen dat het Arc-lampje wordt gestart (Figuur 1B).
    2. Plaats de kamer op het systeem en sluit de buizen van de pomp aan op de juiste inlaat en uitlaatopeningen en de elektrische draad van de stimulator naar de kamer, zoals afgebeeld in Figuur 1C.
    3. Vul de perfusie buis die door de fluidic inline Heater loopt met 37 °c voorverwarmde tyrode 's oplossing.
    4. Pas de camera aan en stel de diafragma afmetingen in om het achtergrond gebied te minimaliseren.
  3. Monteer een glazen dekglaasje met iPSC-CMs in de kamer en bevestig het.
  4. Voeg met de oplossing van Tyrode de kamer 500 μL van de oplossing van Tyrode direct op de bovenkant van de gesloten glazen dekglaasje toe en begin met de perfusing (1,5 mL/min).
  5. Pace iPSC-CMs met 1 Hz veld stimulatie met behulp van de elektrische stimulator (10 V, 4 MS).
  6. Incuberen iPSC-CMs in de kamer met stimulatie gedurende ten minste 3 − 5 minuten voor de cellen om de Fura-2-kleurstof te wassen en zich aan te passen aan de omgeving en de fluorescerende kleurstof uit te spoelen.
  7. Pas het kijkvenster aan het linker bovengedeelte van de glazen afdekplaat aan.
  8. Begin met opnemen.
  9. Nadat u een consistente stroom van 5 − 10 pieken hebt verzameld, klikt u op onderbreken om de opname tijdelijk te stoppen.
  10. Om ervoor te zorgen dat noch de focus noch de afmetingen van het kijkvenster worden gewijzigd, verplaatst u de fase van de Microscoop naar het aangrenzende gebied, beweegt u naar het tegenovergestelde uiteinde en hervat u de opname.
  11. Herhaal de stappen 11,9 en 11,10 om over de afdekplaat te scannen, in eerste instantie naar links te gaan, dan naar beneden in een zig-zag mode om het hele afdek oppervlak te bedekken. Dit bestaat uit 80 − 100 metingen per dekslip.
    Opmerking: Beperk de totale meet tijd tot 10 min als secundaire factoren leiden tot een afname van CA2 + Transient.
  12. Nadat de CA2 -transiënten zijn verworven, analyseert u de gegevens met de fluorescentie traces-analyse software volgens de instructies van de fabrikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol beschreven in Figuur 1a gegenereerd zeer zuivere cardiomyocyten die een ventriculaire/volwassen-achtige fenotype met tijd in de cultuur verwerven. Zoals beoordeeld door immunofluorescentie kleuring voor de Atrium-en ventriculaire myosine regulatoire lichte keten 2 isovormen (respectievelijk MLC2A en MLC2V), waren de meeste cellen die door dit protocol werden gegenereerd MLC2A-positief op dag 30 na inductie van cardiale differentiatie, terwijl MLC2V in veel lagere hoeveelheden op hetzelfde tijdstip werd uitgedrukt (Figuur 2A, toppanelen). Naarmate de tijd in de cultuur toenam (dag 60 en 90), werd een volledige schakelaar van MLC2 isovormen (MLC2A naar MLC2V) waargenomen (Figuur 2a, onderste panelen). Om te kwantificeren de MLC2A en MLC2V-positieve cellen, flow cytometrie analyse werd uitgevoerd. In overeenstemming met de immunofluorescentie resultaten, demonstreerde de flow cytometrie-gegevens vroege fase (dag 30) iPSC-CMs die voornamelijk MLC2A (29,8% MLC2A + vs. 1,9% MLC2V +) (Zie afbeelding 2B, linker paneel), in vergelijking met laat stadium (dag 90) IPSC-CMs, die meestal uitgedrukt MLC2V (41,3% MLC2V + vs. 16,7% MLC2A +) (Zie afbeelding 2B, rechter paneel). Omdat het expressie patroon van MLC2A en MLC2V bekend staat als een kenmerk van cardiale differentiatie en rijping, suggereren deze resultaten dat langdurige cultuur tijd de rijping van iPSC-CMs verhoogt en dat de meerderheid van de cellen lijkt te zijn toegewijd aan het ventriculaire fenotype. Vervolgens beoordeelden we de tijdafhankelijkheid van CA2 + handling maturatie. CA2 + voorbijgaande aard werd gemeten in IPSC-CMs op de drie differentiatie tijden (dag 30, 60 en 90), en vergeleken met geïsoleerde volwassen rat hartspier (arcms). De CA2 + amplitude werd significant verhoogd in het IPSC-CMs op dag 90 en was vergelijkbaar met de Arcms (Figuur 3A, B). Het tarief van CA2 + heropname (Decay-tau) op dag 90 was aanzienlijk sneller vergeleken met dag 30 IPSC-CMs, en dichter bij Arcms (Figuur 3C). Het effect van β-adrenerge stimulatie op ca2 + transiënten werd verder geëvalueerd door de cellen te behandelen met 10 nm isoproterenol (ISO) gedurende 10 min bij 37 °c. Zoals waargenomen in ARCMs, ISO aanzienlijk toegenomen CA2 + voorbijgaande en versnelde het tarief van CA2 + heropname in dag 90 IPSC-CMs. Er werden geen veranderingen waargenomen in dag 30 iPSC-CMs (Figuur 3D-F). Interessant is dat dag 90 iPSC-CMs in staat was om de toenemende elektrische stimulatie (van 0,5 − 3 Hz) te volgen, op een vergelijkbare manier als die waargenomen in ARCMs (Figuur 4B). Tezamen, deze resultaten tonen aan dat iPSC-CMs afgeleid van deze methode vergelijkbare kenmerken hebben als die gezien in native CMs, met name ventriculaire fenotypes, volwassen CA2 + handlingeigenschappen, en positieve β-adrenerge reacties.

Contaminerende niet-cardiale cellen kunnen de functionele rijping van humaan iPSC-CMs beïnvloeden tijdens differentiatie17. Figuur 4a toont een vergelijking tussen 3 maanden oude cellen verkregen uit hoge efficiëntie differentiaties (toppanelen, Video 1), krachtig uitdrukken van de specifieke ventriculaire marker (MLC2V), en 3 maanden oude cellen verkregen uit lage efficiëntie differentiaties (onderste panelen, video 2), tonen IPSC-CMs gemengd met alpha-glad spier actine (αsma)-positieve cellen. Interessant is dat functionele analyse heeft aangetoond veranderde CA2 + transiënten in de gemengde IPSC-CMS/non-CMS voorbereiding in vergelijking met de IPSC-CMS van de hoge efficiëntie differentiatie. In het bijzonder, de cellen verkregen uit lage efficiëntie differentiaties tentoongesteld zeer kleineca 2 + amplitude en automatisme (Figuur 4b, middelste paneel) in vergelijking met pure IPSC-CMs (Figuur 4b, bovenste paneel) en arvcs (Figuur 4b, onderste paneel). Bovendien, cellen uit lage efficiëntie differentiaties gepresenteerd aritmische patronen (Figuur 4C).

Het is belangrijk op te merken dat het iPSC-CMs in het bovenste paneel van Figuur 4A ook een metabole selectie onderging, wat een belangrijke stap is om een populatie van IPSC-CMS verder te verrijken die al is afgeleid van een zeer efficiënte differentiatie. Deze gegevens geven aan dat hoge-efficiëntie cardiale differentiatie protocollen die hoogwaardige CMs genereren nodig zijn om nauwkeurig een cardiale fenotype in vitro te recapituleren.

Afbeelding 5 toont de CA2 + amplitude variabiliteit in verschillende gebieden van de CMs monolayer, uitgezet over een tijdsverloop van 1.200 s. De CA2 + amplitudes gemeten aan het begin van een stimulatie frequentie van 1 Hz (200 s) waren zeer variabel en werden consistenter naarmate de stimulatie voortduurde (200 − 900 s). Echter, na een tijdsperiode van 900 s de CA2 + amplitude aanzienlijk verlaagd. Deze gegevens geven aan dat bij het opnemen van CA2 + transiënten in IPSC-CMs, het nodig is om de cellen te laten stabiliseren bij 37 °c onder constante stimulatie voor ten minste 200 s. Bovendien moeten opnames worden beperkt tot een specifiek tijdvenster (200 − 900 s) om te zorgen voor reproduceerbare resultaten.

Figure 1
Figuur 1: algeheel schematisch voorbereiding iPCS-CMs en CA2 + transiënte instrumenten. A) Schematische weergave van het protocol voor cardiale differentiatie met de ontwikkelingsstadia van het differentiëren van ipscs. Schaalbalk = 50 μm. B) het overname-en analysesysteem voor calcium en contractiliteit. a) peristalitische pomp b) omgekeerde Microscoop c) stroombron voor de digitale camera d) elektrische stimulator e) fluorescentie systeeminterface f) filter wiel regelaar (c) systeem kamer. a) orgaan van de systeem kamer. b) vloeistof inlaat. c) vloeistof uitlaat. d) fluidic inline oplossing kachel. f) elektroden die de systeem kamer verbinden met de elektrische stimulator. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: vergelijking van MLC2A en MLC2V expressie in iPSC-CMs op verschillende dagen van differentiatie. A) immunofluorescentie kleuring van IPSC-CMs op dag 30, 60 en 90 na differentiatie inductie voor MLC2A en MLC2V. Schaalbalk = 20 μm. (B) Flowcytometrie analyse van IPSC-CMS voor MLC2V en MLC2A na 1 maand en 3 maanden na differentiatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: vergelijking van iPSC-CMs-eigenschappen op verschillende dagen van differentiatie. A) representatieve CA2 + voorbijgaande sporen op verschillende dagen van differentiatie. (B-C) Gemiddelde CA2 + amplitude en CA2 + verval opgewekt tijdens stimulatie bij 1 Hz. (D-F) effect van isoproterenol (ISO, 10 nm) behandeling in IPSC-CMs op verschillende dagen van differentiatie. ARCMs geven geïsoleerde Rat volwassen cardiomyocyten aan. N = 70 − 100 gebieden; * p < 0,05; p < 0,001, zoals bepaald door de t-toets van de student. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: vergelijking tussen hoge efficiëntie en lage efficiëntie differentiaties van iPSC-CMs. A) immunofluorescentie kleuring van IPSC-CMs voor αsma en MLC2V. Schaalbalk = 20 μm. B) representatieve sporen met CA2 + transiënten van hoge efficiëntie (boven) en lage efficiëntie (middelste) differentiaties, en geïsoleerde Rat volwassen cardiomyocyten (hieronder). De myocyten werden gestimuleerd bij 0,5 Hz, 1 Hz, 1,5 Hz, 2 Hz en 3 Hz.C) representatief spoor waaruit een aritmisch patroon blijkt van een slechte differentiatie. Pijlen geven punt pacing aan. ARCMs geeft geïsoleerde Rat volwassen cardiomyocyten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Afbeelding 5: tijdafhankelijke CA2 + amplitude van één dekslip. CA2 + amplitudes uit verschillende gebieden in een dekslip werden getekend in een tijdafhankelijke manier. Niet-aanbevolen tijdsperioden voor het meten van CA2 + Transient worden aangegeven in de onderbroken gebieden (< 200 s of > 900 s). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Video 1
Video 1: representatieve video waarin een voorbeeld wordt gegeven van een hoge efficiëntie differentiatie. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2
Video 2: representatieve video die een voorbeeld van een laag rendement differentiatie weergeeft. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3
Video 3: representatieve video met een voorbeeld van een homogene monolaag verdeling van IPSC-CMs op een glazen coverslip. Deze video toont de aanbevolen celdichtheid die moet worden gebruikt voor de functionaalanalyse. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 4
Video 4: representatieve video die een voorbeeld toont van cellen van een laag rendement-differentiatie op een glazen dekglaasje. De cellen in de video werden verkregen uit een laag rendement differentiatie. Cellen van dergelijke differentiaties worden meestal niet homogeen verdeeld over de dekslip en het is moeilijk om consequent kloppende cellen te vinden. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritieke stappen voor het gebruik van Human IPSC-CMs als experimentele modellen zijn: 1) het genereren van hoogwaardige hartspier (CMs) die de consistente prestaties en reproduceerbare resultaten kunnen garanderen; 2) de cellen gedurende ten minste 90 dagen in cultuur te laten rijpen om hun fenotype adequaat te kunnen beoordelen; 3) het uitvoeren van elektrofysiologische studies, bijvoorbeeld calcium (CA2 +) voorbijgaande metingen, om een fysiologisch relevante functionele karakterisering van humaan IPSC-CMs te bieden. We ontwikkelden een op monolayer gebaseerde differentiatie methode die hoogwaardig ventriculair-achtig iPSC-CMs produceert. Onze methode is gebaseerd op verschillende cruciale factoren en is een variant van bestaande protocollen14,18. In tegenstelling tot andere protocollen, maakt deze gebruik van lage zuurstof condities (5% O2) voor ipscs-onderhoud en tijdens de eerste week van hun differentiatie in CMs. lage zuurstof niveaus bootsen de omgevingsconditie na bij embryonale en foetale hart ontwikkeling19. Hypoxische voorwaarden zijn ook aangetoond dat verhoging iPSCs proliferatie en hun daaropvolgende differentiatie aan CMs20. Seeding dichtheid en goede ipscs afdraaien zijn ook kritische factoren voor een succesvolle cardiale differentiatie. Een hoge differentiatie-efficiëntie wordt waargenomen wanneer 70 − 80% confluente iPSCs worden losgekoppeld van kleine celaggregaten met behulp van een enzym vrije oplossing en in een gesplitste verhouding van 1:6. Cardiale differentiatie kan worden gestart wanneer de cellen een confluentie van 70 − 80% bereiken, verwacht ongeveer 4 dagen na het splitsen. CHIR99021 (10 μM) behandeling aan het begin van de differentiatie zal leiden tot significante celdood. Echter, celproliferatie wordt waargenomen wanneer CHIR99021 wordt verwijderd uit de cultuur de volgende dag. Een juist evenwicht tussen celdood en proliferatie is essentieel voor het behoud van een monolaag-cultuur gedurende de differentiatie, wat een andere belangrijke factor is voor een succesvolle differentiatie. Als de iPSC-dichtheid te laag of te hoog is, zal de daaropvolgende differentiatie een lage efficiëntie cardiale differentiatie zijn (Figuur 4a, video 2). Figuur 4a toont een dergelijk voorbeeld van een laag rendement differentiatie, waarbij de cardiomyocyten afkomstig van een gezonde donor worden vermengd met andere celtypen, zoals α-gladde spier actin-positieve cellen. Belangrijk, CA2 + transiënten opgenomen van dergelijke preparaten toonde veranderde kenmerken, zoals lage CA2 + amplitude en aritmische patronen, die gemakkelijk kan worden geïnterpreteerd als biologische variatie. Een succesvolle en hoge efficiëntie differentiatie van dezelfde cellijn, in plaats daarvan, genereerde een zuivere populatie ventriculaire-achtige cardiomyocyten (Figuur 4a, Video 1) samen met reguliere CA2 + transiënten (Figuur 4B, bovenste paneel). De kwaliteit van de differentiatie speelt dus een belangrijke rol in de totale magnitude, vorm, regelmatigheid en frequentie van een CA2 + voorbijgaande aard.

Een ander belangrijk aspect van een succesvolle en efficiënte differentiatie is het verkrijgen van een verrijkte populatie cardiomyocyten. Hoewel niet-gedifferentieerde stamcellen en andere door iPSC afgeleide celtypen glucose als een energiebron gebruiken, kan CMs lactaat efficiënt gebruiken voor ATP en glutamaat productie21. Dus, om een nog zuiverder populatie van CMs te verkrijgen, worden de cellen gekweekt in lactaat-aangevuld en glucose-uitgeputte kweekmedium. Het kweken van iPSC-CMs in deze media selecteren voor een lange tijd, echter, kan leiden tot functionele bijzondere waardevermindering. Daarom, om iPSC-CMs te zuiveren en nog steeds hun functie te behouden, wordt metabole selectie alleen uitgevoerd voor 10-dagen, vanaf dagen 80 − 90 sinds differentiatie inductie. Na deze periode wordt het selectie medium vervangen en worden de cellen bijgehouden in RPMI/B27 media. Hoewel het selectie protocol veel eerder kan worden geïmplementeerd22 (bijvoorbeeld rond dag 15), is het raadzaam om te wachten tot dag 80, omdat dit kan voorkomen dat resterende ipscs of andere celtypen van prolifererende tegen de tijd dat de cellen klaar zijn voor functionele studies (dag 90). Het is daarom van vitaal belang dat voor een succesvolle, efficiënte en robuuste cardiale differentiatie alle bovengenoemde factoren in aanmerking worden genomen.

Naast de robuustheid en efficiëntie van cardiale differentiatie protocollen vormen rijping en celtype specificatie (bijv. atriale en ventriculaire celtypen) ook een grote uitdaging voor het gebruik van iPSC-CMs om cardiale ziekte te modelleren. In de afgelopen jaren zijn er veel veelbelovende rijpings strategieën gerapporteerd, waaronder elektrische stimulatie, mechanisch rek en stijfheid van het substraat23. Echter, langdurige in vitro cultuur van IPSC-CMs blijft een eenvoudige en praktische benadering voor het genereren van volwassen-achtige cardiomyocyten24,25.

In overeenstemming met andere gepubliceerde rapporten12, IPSC-CMs gegenereerd door dit in vitro differentiatie protocol tonen robuuste expressie van ventrikel-specifieke MLC2V en veel lagere niveaus van MLC2A op dag 90 (Figuur 2A, B). Hoewel foetale CMS zowel MLC2A als MLC2V isoforms bevat, bevat het ventriculaire CMs van volwassenen alleen MLC2V. Deze schakelaar in MLC isovorm prevalentie treedt op tijdens de neonatale fase26.

Cardiomyocyten gegenereerd door middel van deze protocol Express ventriculaire specifieke marker, zoals MLC2V, die geleidelijk toeneemt in overvloed naarmate de cellen langer in cultuur worden gehouden (Figuur 2A, B). Dit geeft aan dat een langdurige in vitro cultuur de rijping van CMs verbetert die lijkt te zijn toegewijd aan het ventriculaire fenotype.

Tijd in cultuur heeft ook grote invloed op ca2 + handling maturatie24,25. Eerdere rapporten beschreven dat na 20 dagen van de differentiatie inductie, er waren geen grote veranderingen in de calc CA2 + transiënten als de cellen groeide ouder25. Echter, de hartspier gegenereerd uit het protocol hier gedetailleerd tonen progressieve veranderingen in CA2 + amplitude en CA2 + verval over de drie tijdpunten geëvalueerd (30, 60, en 90 dagen na inductie van cardiale differentiatie) (Figuur 3A-C). Belangwekkend, deze gegevens tonen aan dat CA2 + voorbijgaande parameters, zoals CA2 + amplitude en CA2 + verval, gemeten in dag 90 IPSC-CMs waren vergelijkbaar met die gemeten in geïsoleerde Rat volwassen cardiomyocyten (arcms). Bovendien waren de 90 Days Old iPSC-CMs ook in staat om verschillende elektrische stimulaties te volgen variërend van 0,5 Hz tot 3 Hz consistent, vergelijkbaar met ARCMs (Figuur 4B). In het toekomstige werk zou het interessant zijn om te zien hoe een nog langere tijd in cultuur de functionele kenmerken van deze iPSC-CMs beïnvloedt in vergelijking met ARCMs.

Bovendien, aangezien β-adrenergic receptor signalering toont een duidelijke tijdafhankelijke maturatie patroon na cardiale inductie27, het effect van isoproterenol op ca2 + Transient in IPSC-CMs gegenereerd door middel van dit protocol werd getest. Stimulatie met isoproterenol leidde tot een positieve lusitropic-respons in dag 90 iPSC-CMs, vergelijkbaar met wat in ARCMs wordt waargenomen (Figuur 3D-F).

De functionele evaluaties van iPSC-CMs uitgevoerd in deze studie hebben enkele verschillen en beperkingen in vergelijking met geïsoleerde Adult CMs. Het volwassen CMs heeft goed ontwikkelde en goed gearrangeerde sarcomeres. Dit zorgt voor contractiliteit metingen door detectie van sarcomere beweging. Omdat geen van de huidige protocollen volledig gerijpt, Adult-like IPSC-CMs, contractiliteit metingen via sarcomere detectie zijn niet haalbaar. Hoewel het mogelijk is om de beweging van de celranden te detecteren wanneer de cel contracten, is het aanzienlijk uitdagender om die bewegingen op een precieze manier in iPSC-CMs te volgen. Vanaf nu zijn technologische ontwikkelingen nodig om nauwkeurige evaluaties van contractiliteit in deze cellen mogelijk te maken. Aan de andere kant is het mogelijk om ca2 + transiënten van IPSC-CMs te meten met behulp van een CA2 + -indicator zoals Fura-2. In tegenstelling tot volwassen CMs, zijn iPSC-CMs echter geclusterd en hebben ze geen goed gedefinieerde rand. Daarom vertegenwoordigen de opgenomen CA2 + -transiënten meestal niet één cel, maar eerder een groep cellen in een specifiek gebied. Hoewel het mogelijk is om de grootte van het gebied aan te passen, is het opnemen van CA2 + transiënten van een enkele cel ongelooflijk uitdagend. Het is van cruciaal belang dat wanneer CMs op de dekstroken wordt geplateerd, de dichtheid zodanig is dat ze een homogene monolaag verdeling bereiken (Video 3), wat het mogelijk maakt om gebieden met cellen consistent te vinden. Als de cellen niet worden gedistribueerd als een monolaag op de dekslip (video 4), zullen er gebieden zonder cellen zijn, en als de dekslip specifiek wordt gescreend op gebieden met kloppende cellen om de metingen uit te voeren, kan dit leiden tot een "selectie bias". In plaats van het selecteren van een specifiek gebied van het verslaan van cellen, is het raadzaam om gegevens te verzamelen uit meerdere gebieden in de coverslip, dat is alleen mogelijk wanneer de cellen worden gedistribueerd als een homogene monolayer. Metingen van 100 dergelijke verschillende gebieden, die ongeveer 10 minuten duren, zijn voldoende om betrouwbare functionele eigenschappen van de cellen te bieden. Tot slot, zoals weergegeven in Figuur 5, heeft IPSC-CMs tijd nodig om aan te passen aan de meet condities. Voor betrouwbare metingen wordt aanbevolen de cellen gedurende ten minste 3 minuten te stabiliseren aan de meetomstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gesteund door AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2-geleerden Award voor klinische en translationele Research loopbaanontwikkeling KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 en AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal Sigma Aldrich A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse Invitrogen A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit Invitrogen A21428
B27 Supplement Gibco 17504-044
B27(-) insulin Supplement Gibco A18956-01
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DAPI nuclear stain ThermoFisher D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes Gibco 11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook Celltreat 229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well Corning 353046
Fluidic inline heater Live Cell Instrument IL-H-10
Fura-2, AM Invitrogen F1221
hESC-qualified matrix Corning 354277 Matrigel Matrix
hPSC media Gibco A33493-01 StemFlex Basal Medium
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody Synaptic Systems 311011
Myocyte calcium and contractility system Ionoptix ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) Proteintech 10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane ThermoFisher 124-0045
PBS with Calcium and Magnesium Corning 21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium Corning 21-031-CV
Premium Glass Cover Slips Lab Scientific 7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) Gibco 11879-020
RPMI medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022
StemFlex Supplement Gibco A33492-01
Thiazovivin Tocris 3845
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher 25200056
Tyrode's solution Boston Bioproducts BSS-355w Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Tags

Geneeskunde probleem 155 geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (IPSC-CMs) ipscs calcium Transient calcium handling cardiale ziekte Modeling hartspier rijping
Generatie van ventriculaire-achtige HiPSC-afgeleide cardio myocyten en hoogwaardige celpreparaten voor de karakterisering van calcium behandeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oh, J. G., Dave, J., Kho, C.,More

Oh, J. G., Dave, J., Kho, C., Stillitano, F. Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization. J. Vis. Exp. (155), e60135, doi:10.3791/60135 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter