Summary
Qui descriviamo e convalidiamo un metodo per generare costantemente robusti cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo e caratterizzano la loro funzione. Queste tecniche possono aiutare a sviluppare informazioni meccanicistiche sui percorsi di segnalazione, fornire una piattaforma per lo screening farmacologico su larga scala e modellare in modo affidabile le malattie cardiache.
Abstract
I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs) forniscono una preziosa fonte umana per studiare la scienza di base delle vie di manipolazione e segnalazione del calcio (Ca2),nonché i saggi di screening e tossicità per i farmaci ad alto rendimento. Qui, forniamo una descrizione dettagliata delle metodologie utilizzate per generare iPSC-CMs di alta qualità in grado di riprodurre costantemente caratteristiche molecolari e funzionali attraverso diverse linee cellulari. Inoltre, viene descritto un metodo per valutare in modo affidabile la loro caratterizzazione funzionale attraverso la valutazione delle proprietà di gestione di Ca2. Condizioni di ossigeno basso (O2),selezione del lattato e tempo prolungato in coltura producono cardiomiociti ventricolari ad alta purezza e di alta qualità. Simile ai cardiomiociti di ratti adulti isolati (ARCM), gli iPSC-CM di 3 mesi presentano un'ampiezza Ca2 o superiore, un tasso più veloce di riupposizione di Ca2 o (decay-tau) e una risposta lusitropica positiva alla stimolazione zorrenergica rispetto ai 30 iPSC-CMs del giorno 30. La strategia è tecnicamente semplice, conveniente e riproducibile. Fornisce una solida piattaforma per modellare le malattie cardiache e per lo screening farmacologico su larga scala per colpire le proteine che maneggiano Ca2.
Introduction
I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CMs) sono un'attraente piattaforma a base umana per modellare una grande varietà di malattie cardiache in vitro1,2,3,4,5,6,7,8. Inoltre, iPSC-CMs può essere utilizzato per la previsione di risposte dei pazienti a farmaci nuovi o esistenti, per lo screening composti colpiti, e sviluppare nuovi farmaci personalizzati9,10. Tuttavia, nonostante i progressi significativi, è necessario considerare diverse limitazioni e sfide quando si utilizzai iPSC-CMs11. Di conseguenza, i metodi per migliorare i protocolli di differenziazione cardiaca, per migliorare l'efficienza e la maturazione iPSC-CMs, e per generare sottotipi di cardiomiocito specifici (ventricolare, atriale e nodale) sono stati intensamente studiati e già portati a numerose strategie culturali per superare questi ostacoli12,13,14,15.
Nonostante la robustezza di questi protocolli, una delle principali preoccupazioni per l'uso di iPSC-CMs è la riproducibilità di procedure lunghe e complesse per ottenere cardiomiociti di alta qualità in grado di garantire le stesse prestazioni e risultati riproducibili. La riproducibilità è fondamentale non solo quando si confrontano linee cellulari con diversi background genetici, ma anche quando si ripetono confronti cellulari e molecolari della stessa linea cellulare. La variabilità cellulare, come le differenze ben per pozzo nella densità degli iPSC, può influenzare la differenziazione cardiaca, generando una bassa resa e cardiomiociti di scarsa qualità. Queste cellule potrebbero ancora essere utilizzate per eseguire esperimenti che non richiedono una popolazione pura di CMs (ad esempio, quando si eseguono misurazioni transitorie di Ca2o). Infatti, quando si esegue l'analisi elettrofisiologica, le non-CMs non batteranno, né spontaneamente né sotto stimolazione elettrica, quindi sarà facile escluderli dall'analisi. Tuttavia, a causa della scarsa qualità, gli iPSC-CM possono mostrare caratteristiche elettrofisiologiche alterate (ad esempio, irregolare Ca2 o transitorio, bassa ampiezza Ca2) che non sono dovute alla loro composizione genetica. Pertanto, soprattutto quando si utilizza iPSC-CMs per modellare la malattia cardiaca, è importante non confondere i risultati di un CM di scarsa qualità con il fenotipo della malattia. Prima di procedere a studi elettrofisiologici sono necessari processi di screening ed esclusione.
Questo metodo include protocolli ottimizzati per generare cardiomiociti ad alta purezza e di alta qualità e per valutare la loro funzione eseguendo misurazioni transitorie di Ca2 o utilizzando un sistema di acquisizione e analisi del calcio e della contrattilità. Questa tecnica è un modo semplice, ma potente, per distinguere tra prodotti iPSC-CM ad alta efficienza e preparati iPSC-CM a bassa efficienza e fornire una caratterizzazione più fisiologicamente rilevante degli iPSC-CMs umani.
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Protocol
Gli esperimenti che utilizzano cardiomiociti per ratti adulti in questo studio sono stati condotti con protocolli Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) approvati della Icahn School of Medicine sul Monte Sinai. I cardiomiociti di ratto adulti sono stati isolati dai cuori di ratto Sprague Dawley con il metodo basato su Langendorff come descritto in precedenza16.
1. Preparazione dei mezzi di comunicazione
- Preparare i supporti hiPSC.
- Elittore il supplemento e il mezzo basale a temperatura ambiente (RT). Assicurarsi che il supplemento si sia scongelato completamente. Mescolare 400 mL del mezzo basale e 100 mL del supplemento e filtrare utilizzando un filtro a vuoto da 0,22 m. Conservare a 4 gradi centigradi ed eseguire l'acquisiglia in BASE alla RT prima dell'uso.
- Preparare RPMI - B27.
- Assicurarsi che il supplemento B27 e il mezzo basale (RPMI 1640) a RT. Assicurarsi che il supplemento si sia scongelato completamente. Mescolare 490 mL del mezzo basale e 10 mL del supplemento 50x e filtrare utilizzando un filtro azionato a vuoto da 0,22 m. Conservare a 4 gradi centigradi ed eseguire l'acquisiglia in BASE alla RT prima dell'uso.
- Preparare l'insulina RPMI - B27 (-).
- Assicurarsi che il supplemento di insulina B27 (-) e il mezzo basale (RPMI 1640) a RT. Assicurarsi che il supplemento si è scongelato completamente. Mescolare 490 mL del mezzo basale e 10 mL del supplemento 50x e filtrare utilizzando un filtro azionato a vuoto da 0,22 m. Conservare a 4 gradi centigradi ed eseguire l'acquisiglia in BASE alla RT prima dell'uso.
- Preparare il supporto di selezione (RPMI (-) glucosio , B27 e lattato).
- Assicurarsi che il supplemento B27 e il mezzo basale (RPMI 1640 (-) glucosio) a RT. Assicurarsi che il supplemento si è scongelato completamente. Mescolare 490 mL del mezzo basale e 10 mL del supplemento 50x, aggiungere 4 mM di lattato di sodio costituito in acqua sterile, e filtrare utilizzando un filtro a vuoto 0,22 m. Conservare a 4 gradi centigradi ed eseguire l'acquisiglia in BASE alla RT prima dell'uso.
- Preparare RPMI 20.
- Miscelare il siero bovino fetale (FBS) (20% di concentrazione finale) e RPMI. Filtrare utilizzando un filtro da 0,22 m a vuoto e conservarlo a 4 gradi centigradi. Equilibrate a RT prima dell'uso.
- Preparare il passaggio dei supporti aggiungendo l'inibitore della proteina chinasi (ROCK) associata a Rho contenente l'inibitore della proteinacità (2 M) ai supporti hiPSC.
- Preparare il supporto D0 aggiungendo l'inibitore di GSK-3, da CHIR 99021 a RPMI - B27 (-) supporti insulinici (finale 10 M).
- Preparare i supporti D3 e D4 mescolando i supporti insulinici RPMI - B27 (-) con IWR-1 (5 m finale).
NOTA: l'insulina è costituita da supporti D1 e D5. Il supporto D7 è costituito da RPMI - B27. - Preparare il buffer di blocco (2% albumin semastro bovino [BSA], 2% FBS, 0.05% NP-40 in salina con buffer fosfato [PBS]): in un tubo conico da 50 mL, aggiungere 1 g di BSA, 1 mL di FBS, 49 mL di PBS e 250 luna di NP-40. Mescolare fino a completa dissoluzione.
2. Preparazione di piastre e copriletti con cellule staminali embrionali umane (hESC) qualificate
NOTA: Eseguire tutti i passaggi sotto una cappa di coltura dei tessuti sterilizzata.
- Soluzione di stock a matrice qualificata per il scongelo durante la notte sul ghiaccio a 4 gradi centigradi. Fare riferimento alla scheda di specifica del prodotto per determinare i volumi appropriati in quanto ciò può variare a seconda dello stock. Conservare queste aliquote a -20 gradi centigradi in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml.
- Al fine di utilizzare la matrice per il rivestimento di piastre o coperture di vetro, prima scongelare una matrice di matrice aliquota qualificata hESC a 4 gradi centigradi per 30 min.
- Aliquota 24 mL del mezzo freddo di Dulbecco Eagle (DMEM): miscela nutritiva F-12 (DMEM/F:12) in un tubo conico da 50 mL.
- Mescolare il supporto freddo DMEM/F:12 con una pipetta di vetro da 2 mL per raffreddare la superficie della pipetta.
- Utilizzando la stessa pipetta, occupano circa 500-700 l di DMEM/F:12 freddo e si mescolano con la matrice a matrice a matrice a matrice adattata all'HESC all'interno del tubo di microcentrismo.
- Una volta mescolata correttamente, trasferire la soluzione al tubo conico da 50 mL contenente il freddo DMEM/F:12 e mescolare di nuovo.
- Per un piatto standard a 6 po', aggiungere 1 mL di questa miscela ad ogni pozzo. Assicurarsi che il pozzo sia interamente coperto. Lasciare le piastre a RT sotto la cappa di coltura dei tessuti per almeno 30 min. Se lo si desidera, conservare a 4 gradi centigradi subito dopo la placcatura per un massimo di 1 settimana di equilibrato e a RT per 30 minuti prima dell'uso.
- Per utilizzare le piastre, aspirare la matrice e sostituirla con supporti appropriati. Utilizzare immediatamente.
- Conservare i coperchi di vetro in un ambiente sterile (ad esempio, all'interno di una cappa di coltura di tessuto sterile).
- Prima del rivestimento, pulire ogni singola coverslip con 70% di etanolo. Una volta che il coperchio è asciutto, metterlo all'interno di un pozzo di una piastra sterile 6 bene.
- Prendere 250-300 l della soluzione a matrice qualificata hESC e dispensare con cura direttamente al centro del coperchio di vetro. Lasciare le copricopertine a RT sotto la cappa di coltura dei tessuti per almeno 30 min prima dell'uso.
3. Preparazione di piccole molecole
NOTA: Ricostituire tutte le piccole molecole e modulatori Wnt in DMSO se non diversamente specificato.
- Preparare 10 mM di 25 gradi centigradi ciascuno di IWR-1 e CHIR 99021 e conservare a -20 gradi centigradi.
- Ricostituire 10 mm di aliquote di 50 gradi centigradi ciascuno di Thiazovivin (inibitore del ROCK) e conservare a -20 gradi centigradi.
4. Manutenzione e passaggi degli iPSC
NOTA: Eseguire tutte le operazioni seguenti in una cappa di coltura di tessuto sterile.
- Mantenere gli iPSC in lastre standard 6 pozzi ed eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili. Mantenere le celle con 2 mL di supporti hiPSC per pozzo. Cambiare i media ogni due giorni. Mantenere le cellule a 37 gradi centigradi, 6% O2, 5% CO2. Passare le cellule quando sono tra 70-80% confluente.
- PBS PbS senza Ca2 e Mg2 a RT.
- Per avviare il processo di passaggio, aggiungere 1 mL di PBS senza Ca2 e Mg2 al pozzo che deve essere passaggio. Incubare a RT per 7-10 min. Controllare le cellule sotto il microscopio per assicurarsi che il trattamento PBS non abbia portato a una completa dissociazione del monostrato.
- Rimuovere PBS e sostituirlo con 1 mL di supporti passaging. Utilizzare un sollevatore di celle per raschiare delicatamente e sollevare le cellule dalla superficie del pozzo.
- Dissociare meccanicamente le cellule utilizzando una pipetta di vetro sterile da 2 mL. Ripetere fino a quando le cellule sono ben dissociate in modo uniforme in piccole colonie quando osservate al microscopio.
- Una volta che le cellule sono state sufficientemente dissociate, aggiungere 5 mL di supporti passaging per dividere le cellule 1:6. Regolare la quantità di supporti passaging da aggiungere in modo che corrisponda al rapporto di divisione preferito.
- Aspirare la matrice qualificata hESC dalla piastra rivestita a matrice hESC e sostituirla con 1 mL di supporti passaging per pozzo. Aggiungere 1 mL di cellule dissociate per pozzo.
5. Differenziazione cardiomiocita
- Utilizzare linee hiPSC che sono ben consolidate (più di 20 passaggi) ed esibiscono una morfologia omogenea prima di iniziare la differenziazione cardiaca.
- Assicurarsi che gli iPSC siano circa 70-80% confluente.
- Lavare le celle 1x in PBS senza Ca2 e Mg2.
- Aggiungere 2 mL di supporto D0 (passaggio 1,7) per pozzo e trasferire le cellule nell'incubatrice.
- Dopo 24 h, sostituire con 3 mL di supporti D1 per pozzo per 48 h.
- Il giorno 3, sostituire il supporto con 2 mL di supporti D3 per pozzo. Ripetere con i supporti D4 il giorno 4.
- Il giorno 5, sostituire il supporto con 3 mL di supporti D5 per pozzo.
- Il giorno 7, sostituire i supporti con 3 mL di supporti D7 per pozzo e trasferirli in un'incubatrice con 37 gradi centigradi, il 5% di CO2e la normale concentrazione di O2. Sostituire il supporto D7 (RPMI - B27) ogni 2 giorni.
6. Procedura di selezione e dissociazione iPSC-CM
- Dieci giorni prima di eseguire le misurazioni transitorie di Ca2 o qualsiasi analisi funzionale, sostituire il supporto RPMI - B27 con 3 mL di supporti di selezione per pozzo per 48 h.
- Sostituire il supporto con 3 mL di supporti di selezione per altri 48 h.
- Sostituire il supporto con 2 mL di RPMI - B27 supporti per pozzo per 24 h.
- Cappotto standard 6 piastre come descritto nella sezione 2.
- Aggiungere 1 mL di sterile 0.25% trypsin con EDTA ad ogni pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Utilizzando una pipetta da 1.000 luna, dissociare meccanicamente le cellule in modo che le singole cellule possano essere osservate quando osservate al microscopio.
- Trasferire le cellule su un tubo conico sterile da 15 mL e aggiungere 2 mL di RPMI 20 supporti per pozzo. Centrifuga per 5 min a 800 x g.
- Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in RPMI - B27 media. Aspirati la matrice qualificata hESC dalle piastre e sostituite con 1 mL di RPMI - supporto B27.
- Utilizzando una punta di pipetta da 1.000 mL, dissociare meccanicamente il pellet cellulare fino a quando la soluzione non appare omogenea.
- Trasferire circa 500.000 cellule ad ogni pozzo. Trasferimento in incubatrice per 24 ore.
- Sostituire il supporto con 3 mL di supporti di selezione per bene per 48 h.
- Sostituire il supporto con 3 mL di RPMI - B27 per pozzo. Mantenere le celle in supporti D7 (RPMI - B2 che cambiano i supporti ogni 2 giorni fino a quando non sono pronti per l'analisi funzionale.
7. Preparazione di iPSC-CMs per la citometria di flusso
- Una volta che le cellule sono dell'età desiderata e sono state sottoposte a selezione metabolica (sezione 6), lavare le cellule con PBS senza Ca2 e Mg2.
- Aggiungete 1 mL di prove 0,25% e incubate per 5-7 min a 37 gradi centigradi.
- Pipette la miscela 5-10x con una punta P1000 per singolarizzare le cellule, e trasferire a un tubo da 15 mL contenente 2 mL di RPMI 20.
- Girare le cellule a 600 x g per 5 min.
- Aggiungere 100 l di soluzione di fissaggio (4% PFA) al pellet cellulare. Aggiungere la soluzione goccia con vortice continuo e delicato e poi impostare sul ghiaccio per 15 min.
- Aggiungere 1,5 mL di PBS. Raccogliere le cellule con la centrifugazione e aspirare il supernatante.
- Per ogni esperimento, includere un controllo non colorato per condizione di fissazione/permeabilizzazione.
- Risospendere le celle in 500 - L di soluzione di blocco (2% FBS/2% BSA in PBS con 0.1% NP-40) per 30 min a RT.
- Senza rimuovere la soluzione di blocco, aggiungere l'anticorpo primario MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) e incubare 45 min a RT.
- Lavare con buffer di blocco. Raccogliere le cellule con la centrifugazione e la soluzione aspirato.
- Aggiungere l'anticorpo secondario Alexa Fluor 555/488(1:750) diluito nel buffer di blocco per 45 min a RT o durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere 1,5 mL di PBS. Raccogliere le cellule con la centrifugazione e la soluzione aspirato.
- Risospendere le celle in 250-300 -L di PBS. Utilizzare una pipetta P1000 per disaggregare le cellule.
- Preparare i tubi rotondi con un tappo di colino a rete di nylon da 35 m. Pre-bagnato il colino cellulare con 50 gradi L di PBS e impostare il tubo sul ghiaccio.
- Trasferire la soluzione con le cellule disaggregate ai tubi rotondi con i tappi del colino cellulare. Lasciare che la soluzione cellulare per drenare naturalmente o toccare il fondo del tubo contro una superficie piana, se necessario, per garantire il drenaggio completo e la raccolta delle cellule nel tubo. Assicurarsi di rimettere il tubo sul ghiaccio il prima possibile.
- Sciacquare il colino cellulare con 250 l di PBS per recuperare eventuali cellule residue.
- Mantenere i tubi sul ghiaccio e coprire con un foglio di alluminio fino all'analisi della citometria di flusso.
8. Placcatura Cardiomiociti su coperture di vetro
NOTA: eseguire tutti i passaggi in un ambiente sterile.
- Preparare i copricopertine in vetro come descritto nei passaggi 2.10 e 2.11.
- Una volta che gli iPSC-CMs sono stati selezionati e sono dell'età desiderata, seguire i passaggi 6,5-6,7 per dissociare gli iPSC-CMs.
- Aspirare il superatante e risospendere le cellule in una quantità sufficiente di supporti RPMI 20 per avere circa 300.000 cellule per 250 .
- Utilizzando una pipetta di vetro da 2 mL, dissociare meccanicamente il pellet cellulare fino a quando la soluzione non appare omogenea.
- Aspirare la matrice qualificata hESC dai coverlips.
- Utilizzando una pipetta da 1000 luna, mescolare e tirare 250 l della soluzione dal tubo conico da 15 mL.
- Eroga lentamente i 250 gradi della soluzione sui coperchi del vetro, facendo particolare attenzione ad aggiungere solo all'area in cui è presente il rivestimento a matrice qualificato hESC.
- Trasferire con attenzione all'incubatrice e lasciare durante la notte, avendo cura di non scuotere o diffondere le cellule sui copriletti. La mattina successiva, aggiungere delicatamente 2 mL di supporto D7 (RPMI - B27) ad ogni pozzo con la coverslip. Cambiare il supporto dopo 24 h e ogni 2 giorni dopo.
9. Fissare le cellule
- Assicurarsi che una quantità adeguata di PBS con Ca2 e Mg 2e l'equilibratità sia fissata a 4 gradi centigradi.
- Preparare una soluzione di paraformaldeide (PFA) del 4% diluita in PBS con Ca2 e Mg2 e un'equilibratura a 4 gradi centigradi.
- Una volta che gli iPSC-CMs sono di età appropriata, hanno subito una selezione metabolica (sezione 6), e sono stati placcati su appendici (sezione 8), lavare le cellule 3x con 1 mL di PBS freddo con Ca2 e Mg2 per bene.
- Aggiungere 1 mL di freddo 4% PFA e lasciare le celle a RT sotto il cofano per 15 min.
- Lavare le cellule con PBS freddo per rimuovere l'eccesso di PFA.
- Aggiungete 2 mL di PBS con Ca2 e Mg2 e conservatevi a 4 gradi centigradi.
10. Immunofluorescenza Colorazione
- Rimuovere PBS dalle celle fisse e aggiungere 1 mL di buffer di blocco. Incubare per 1 h a RT.
- Rimuovere il buffer di blocco e aggiungere l'anticorpo primario (5 mg/mL) diluito nel buffer di blocco. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare 3x in PBS con Ca2 e Mg2 per 5 min ciascuno.
- Aggiungere l'anticorpo secondario diluito nel buffer di blocco 1:1,000.
- Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare per 45 min a RT. Mantenere la lamina di alluminio per i seguenti passaggi.
- Lavare 3x in PBS con Ca2 e Mg2,5 min ciascuno.
- Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di lavoro DAPI per coprire completamente le cellule e incubare a RT per 10 min.
- Lavare accuratamente il campione con PBS con Ca2 e Mg2 per rimuovere l'eccesso daPI.
- Prendere nuovi vetrini di vetro e aggiungere una goccia di supporto di montaggio nel mezzo. Utilizzare il contagocce per distribuire uniformemente il supporto di montaggio. Mettere i copricopertine con le celle a faccia in giù sui vetrini.
NOTA: Le celle possono essere conservate per 30 giorni se protette dalla luce.
11. Valutazione dei transitori intracellulari Ca2
- Una volta che gli iPSC-CM hanno almeno 3 mesi, hanno subito una selezione metabolica (sezione 6), e sono stati placcati su cover, trattarli con 2 : L di Fura-2, AM (concentrazione finale: 1 M) e incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
NOTA: Fura-2 è sensibile alla luce. Eseguire tutte le procedure di caricamento e gli esperimenti al buio. - Preparare il sistema di acquisizione e analisi del calcio e della contrattilità.
- Alimentare il sistema assicurando che la lampada ad arco vieneavviata( Figura 1B).
- Posizionare la camera sul sistema e collegare i tubi dalla pompa all'ingresso e alle prese appropriate e il filo elettrico dallo stimolatore alla camera come mostrato nella Figura 1C.
- Riempire il tubo di perfusione che attraversa il riscaldatore in linea fluido con la soluzione di Tyrode preriscaldato a 37 gradi centigradi.
- Regolare le dimensioni della fotocamera e dell'apertura dell'inquadratura per ridurre al minimo l'area di sfondo.
- Montare un coperchio di vetro con iPSC-CMs nella camera e fissare.
- Aggiungere 500 -L della soluzione di Tyrode direttamente sopra il coperchio in vetro fissato delicatamente e iniziare a perfondere la camera (1,5 mL/min) con la soluzione di Tyrode.
- Pace iPSC-CMs con stimolazione sul campo di 1 Hz utilizzando lo stimolatore elettrico (10 V, 4 ms).
- Incubare iPSC-CMs nella camera con stimolazione per almeno 3/5 min per le cellule per lavare il coloranti Fura-2 e adattarsi all'ambiente e lavare il coloranti fluorescente.
- Regolare la finestra di visualizzazione all'area superiore sinistra della vetrina di vetro.
- Iniziare la registrazione.
- Dopo aver raccolto un flusso coerente di picchi di 5-10, fate clic su Pausa per interrompere temporaneamente la registrazione.
- Garantire che né lo stato attivo né le dimensioni della finestra di visualizzazione vengano modificati, spostare lo stage del microscopio nell'area adiacente, spostarsi verso l'estremità opposta e riprendere la registrazione.
- Ripetere i passaggi 11.9 e 11.10 per eseguire la scansione su copertina, inizialmente spostandosi a sinistra, quindi verso il basso in modo a zig-zag per coprire l'intera area coverslip. Questo consiste di 80-100 misurazioni per coverslip.
NOTA: Limitare il tempo di misurazione totale a 10 min, poiché i fattori secondari causano una diminuzione di Ca2 o transitori. - Una volta acquisiti i transitori Ca2, analizzare i dati con il software di analisi delle tracce di fluorescenza secondo le istruzioni del produttore.
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Representative Results
Il protocollo descritto nella Figura 1A ha generato cardiomiociti altamente puri che acquisiscono un fenotipo ventricolare/adulto con il tempo nella coltura. Come valutato dalla colorazione immunofluorescenza per la miosina regolatrice atriale e ventricolare catena di luce 2 isoformi (MLC2A e MLC2V, rispettivamente), la maggior parte delle cellule generate da questo protocollo sono state MLC2A-positivo al giorno 30 dopo l'induzione della differenziazione, mentre MLC2V è stato espresso in quantità molto più basse nello stesso punto (Figura2, pannelli superiori). Con l'aumentare del tempo nella coltura (giorno 60 e 90), è stato osservato un commutatore completo degli isoformi MLC2 (da MLC2A a MLC2V) (Figura 2A, pannelli inferiori). Per quantificare le cellule MLC2A e MLC2V-positive, è stata eseguita l'analisi della citometria di flusso. In conformità con i risultati dell'immunofluorescenza, i dati della citometria di flusso hanno dimostrato che i MSP 1.9% MLC2V) (vedere Figura 2B, pannello sinistro), rispetto alla fase avanzata (giorno 90) iPSC-CMs, che ha espresso per lo più MLC2V (41,3% MLC2V - vs. 16,7% MLC2A) (vedere Figura 2B, pannello destro). Poiché il modello di espressione di MLC2A e MLC2V è noto per essere un segno distintivo della differenziazione cardiaca e della maturazione, questi risultati suggeriscono che il tempo di coltura prolungato aumenta la maturazione degli iPSC-CMs e che la maggior parte delle cellule sembra essere impegnata nel fenotipo ventricolare. Abbiamo quindi valutato la dipendenza temporale della maturazione della gestione di Ca2. Iltransitorio Ca 2 è stato misurato in iPSC-CMs nei tre tempi di differenziazione (giorno 30, 60 e 90) e rispetto ai cardiomiociti di ratto adulti isolati (ARCM). L'ampiezza di Ca2 è stata notevolmente aumentata negli iPSC-CMs al giorno 90 ed era simile agli ARCM (Figura 3A,B). Il tasso di ripresa di Ca2 al giorno 90 è stato significativamente più veloce rispetto ai 30 iPSC-CMs del giorno e più vicino agli ARCM (Figura 3C). L'effetto della stimolazione zo-avversa sui transitori di Ca2 o è stato ulteriormente valutato trattando le cellule con 10 nM di isoproterenolo (ISO) per 10 min a 37 gradi centigradi. Come osservato negli ARCM, ISO ha aumentato significativamente il transitorio di Ca2 e ha accelerato il tasso di ripresa di Ca2 o nel giorno 90 iPSC-CMs. Non sono state osservate modifiche nel giorno 30 iPSC-CMs(Figura 3D-F). È interessante notare che il giorno 90 iPSC-CMs sono stati in grado di seguire l'aumento della stimolazione elettrica (da 0,5-3 Hz), in modo simile a quello osservato negli ARCM (Figura 4B). Nel loro insieme, questi risultati mostrano che gli iPSC-CMs derivati da questo metodo hanno caratteristiche simili a quelle osservate nelle CM native, in particolare nei fenotipi ventricolari, nelle proprietà di manipolazione mature di Ca2 e nelle risposte positive.
La contaminazione delle cellule non cardiache può influenzare la maturazione funzionale degli iPSC-CMs umani durante la differenziazione17. Figura 4A mostra un confronto tra celle di 3 mesi ottenute da differenziazioni ad alta efficienza (pannelli superiori, Video 1), esprimendo in modo robusto il marcatore ventricolare specifico (MLC2V) e le cellule di 3 mesi ottenute da differenziazioni a bassa efficienza (pannelli inferiori, Video 2), che mostrano iPSC-CMs mescolati con atto muscolare alfa-liscio (ZSMA) -cellule positive. È interessante notare che l'analisi funzionale ha dimostrato un'analisi modificata di Ca2 o più transitori nella preparazione mista iPSC-CMs/non-CMs rispetto agli iPSC-CMs dall'elevata differenziazione di efficienza. In particolare, le celle ottenute da differenziazioni a bassa efficienza hanno mostrato un'ampiezza e un'automaticità molto piccole(Figura 4B, pannello centrale) rispetto ai puri iPSC-CM(Figura 4B, pannello superiore) e ARVC(Figura 4B, pannello inferiore). Inoltre, le celle provenienti da differenziazioni a bassa efficienza presentavano modelli aritmici (Figura 4C).
È importante notare che gli iPSC-CMs mostrati nel pannello superiore della Figura 4A hanno anche subito una selezione metabolica, che è un passo importante per arricchire ulteriormente una popolazione di iPSC-CMs che è già derivata da una differenziazione altamente efficiente. Questi dati indicano che sono necessari protocolli di differenziazione cardiaca ad alta efficienza che generano CM di alta qualità per ricapitolare con precisione un fenotipo cardiaco in vitro.
La figura 5 mostra la variabilità dell'ampiezza di Ca2 in diverse aree del monostrato cms, tracciate in un percorso temporale di 1.200 s. Le ampiezza di Ca2 o più misurate all'inizio di una frequenza di stimolazione di 1 Hz (200 s) erano altamente variabili e divennero più coerenti con il proseguimento della stimolazione (200-900 s). Tuttavia, dopo un periodo di tempo di 900 s l'ampiezza di Ca2o è stata notevolmente ridotta. Questi dati indicano che, durante la registrazione di transitori Ca2 o superiore in iPSC-CMs, è necessario lasciare che le cellule si stabilizzino a 37 gradi centigradi in stimolazione costante per almeno 200 s. Inoltre, le registrazioni devono essere limitate a una specifica finestra temporale (200-900 s) per garantire risultati riproducibili.
Figura 1: Schema generale della preparazione iPCS-CMs e degli strumenti transitori Ca2. (A) Schematico del protocollo di differenziazione cardiaca che mostra le fasi di sviluppo della differenziazione degli iPSC. Barra della scala: 50 m. (B) Il sistema di acquisizione e analisi del calcio e della contrattilità. a) Pompa peristalitica b) Microscopio invertito c) Fonte di alimentazione per la fotocamera digitale d) Stimolatore elettrico e) Interfaccia del sistema di fluorescenza f) Controllo relera della ruota di filtro (C). a) Corpo della camera di sistema. b) Insedio fluido. c) Presa fluida. d) Riscaldatore a soluzione in linea fluido. f) Elettrodi che collegano la camera di sistema allo stimolatore elettrico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Confronto tra le espressioni MLC2A e MLC2V in iPSC-CMs in diversi giorni di differenziazione. (A) Colorazione immunofluorescenza degli iPSC-CMs al giorno 30, 60 e 90 dopo l'induzione della differenziazione per MLC2A e MLC2V. Barra della scala: 20 m. (B) Analisi della citometria di flusso delle iPSC-CMs per MLC2V e MLC2A a 1 mese e 3 mesi dopo la differenziazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto delle proprietà iPSC-CMs in diversi giorni di differenziazione. (A) Il rappresentante Ca2 o tracce transitorie in diversi giorni di differenziazione. (B-C) Media del trattamento dell'ampiezza Ca2 e deldecadimento di Ca 2o e del decadimento di Ca 2o suscitato durante la stimolazione a 1 Hz. (D-F) Effetto del trattamento isoproterenolo (ISO, 10 nM) in iPSC-CMs in diversi giorni di differenziazione. Gli ARCM indicano cardiomiociti adulti di ratto isolati. N : 70/100 aree; < 0,05; p < 0.001, come determinato dal test t-testdi Student. I dati sono rappresentati come Mean - S.E.M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto tra elevata efficienza e differenziazione a bassa efficienza degli iPSC-CMs. (A) Colorazione immunofluorescenza di iPSC-CMs per le malattie da sMA e MLC2V. Barra della scala: 20 m. (B) Tracce rappresentative che mostrano i transitori Ca2 e da differenziazioni ad alta efficienza (sopra) e a bassa efficienza (al centro) e i cardiomiociti adulti per topi isolati (sotto). I miociti sono stati stimolati a 0,5 Hz, 1 Hz, 1,5 Hz, 2 Hz, e 3 Hz. (C) Traccia rappresentativa che mostra un modello aritmico da una cattiva differenziazione. Le frecce indicano la stimolazione del punto. Gli ARCM indicano cardiomiociti adulti di ratto isolati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Ampiezza Ca2 o dipende dal tempo da una singola copertina. Le ampiezza di Ca2 o più provenienti da diverse aree in un coverslip sono state tracciate in modo dipendente dal tempo. I periodi di tempo non consigliati per misurare il transitorio Ca2 è indicato nelle aree tratteggiate (<200 s o >900 s). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Video rappresentativo che mostra un esempio di differenziazione ad alta efficienza. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Video rappresentativo che mostra un esempio di differenziazione a bassa efficienza. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 3: Video rappresentativo che mostra un esempio di distribuzione omogenea di monostrato di iPSC-CMs su una vetrina di vetro. Questo video mostra la densità di cellule consigliata da utilizzare per l'analisi funzionale. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 4: Video rappresentativo che mostra un esempio di celle da una bassa differenziazione di efficienza placcata su un coperchio di vetro. Le cellule nel video sono state ottenute da una bassa differenziazione di efficienza. Le cellule di tali differenziazioni di solito non sono distribuite omogeneamente attraverso il coperchio ed è difficile trovare costantemente le cellule che battono. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
I passaggi critici per l'utilizzo di iPSC-CMs umani come modelli sperimentali sono: 1) la generazione di cardiomiociti di alta qualità (VM) in grado di garantire prestazioni costanti e risultati riproducibili; 2) permettere alle cellule di maturare in coltura per almeno 90 giorni per valutare adeguatamente il loro fenotipo; 3) eseguire studi elettrofisiologici, ad esempio misurazioni transitorie di calcio (Ca2), per fornire una caratterizzazione funzionale fisiologicamente rilevante degli iPSC-CM umani. Abbiamo sviluppato un metodo di differenziazione basato su monostrato che produce iPSC-CMs di alta qualità. Il nostro metodo si basa su diversi fattori cruciali ed è una variante dei protocolli esistenti14,18. A differenza di altri protocolli, questo utilizza condizioni di ossigeno basso (5% O2) per la manutenzione di iPSCs e durante la prima settimana della loro differenziazione in CMs. I bassi livelli di ossigeno imitano la condizione ambientale durante lo sviluppo del cuore embrionale e fetale19. È stato inoltre dimostrato che le condizioni ipossiche aumentano la proliferazione degli iPSC e la loro successiva differenziazione con le CMs20. La densità di semine e il passaggio corretto degli iPSC sono anche fattori critici per una differenziazione cardiaca di successo. L'elevata efficienza di differenziazione si osserva quando 70-80% iPSC confluenti sono dissociati in piccoli aggregati cellulari utilizzando una soluzione priva di enzimi e seminata a un rapporto di divisione di 1:6. La differenziazione cardiaca può essere avviata quando le cellule raggiungono una confluenza del 70-80%, previste circa 4 giorni dopo la scissione. Il trattamento CHIR99021 (10 m) all'inizio della differenziazione causerà una significativa morte cellulare. Tuttavia, la proliferazione cellulare si osserva quando CHIR99021 viene rimosso dalla coltura il giorno successivo. Un corretto equilibrio tra la morte cellulare e la proliferazione è essenziale per preservare una cultura monostrato in tutta la differenziazione, che è un altro fattore importante per una differenziazione di successo. Se la densità iPSC è troppo bassa o troppo alta, la differenziazione successiva sarà una differenziazione cardiaca a bassa efficienza (Figura 4A, Video 2). La figura 4A mostra un esempio di bassa differenziazione di efficienza, in cui i cardiomiociti derivati da un donatore sano sono mescolati con altri tipi di cellule, come ad esempio le cellule muscolo-liscio actin-positivo. È importante sottolineare che i transitori di Ca2, registrati da tali preparati, hanno mostrato caratteristiche alterate, come una bassa ampiezza di Ca2 e modelli aritmici, che potrebbero essere facilmente interpretati erroneamente come variazione biologica. Una differenziazione di successo e ad alta efficienza dalla stessa linea cellulare, invece, ha generato una popolazione pura di cardiomiociti ventricolari (Figura 4A, Video 1) insieme ai transitori regolari Ca2 (Figura 4B, pannello superiore). Pertanto, la qualità della differenziazione svolge un ruolo importante nella grandezza complessiva, nella forma, nella regolarità e nella frequenza di un transitorio Ca2.
Un altro aspetto importante di una differenziazione di successo ed efficiente è l'ottenimento di una popolazione arricchita di cardiomiociti. Mentre le cellule staminali indifferenziate e altri tipi di cellule derivate da iPSC utilizzano il glucosio come fonte di energia, le Macchine virtuali possono utilizzare il lattato in modo efficiente per la produzione di ATP e glutammato21. Così, al fine di ottenere una popolazione ancora più pura di CMs, le cellule sono coltivate in lattato-supplemento e glucosio-esaurimento mezzo di coltura. Coltivare iPSC-CMs in questo supporto di selezione per lungo tempo, tuttavia, può portare a disturbi funzionali. Pertanto, per purificare iPSC-CMs e preservare ancora la loro funzione, la selezione metabolica viene eseguita solo per 10 giorni, dai giorni 80-90 dall'induzione della differenziazione. Dopo questo periodo, il supporto di selezione viene sostituito e le celle vengono mantenute nel supporto RPMI/B27. Mentre il protocollo di selezione può essere implementato molto prima22 (ad esempio, intorno al giorno 15), si consiglia di attendere fino al giorno 80, in quanto così facendo può impedire che gli iPSC residui o altri tipi di cellule proliferino dal momento in cui le cellule sono pronte per gli studi funzionali (giorno 90). È quindi fondamentale che per una differenziazione cardiaca di successo, efficiente e robusta, tutti i fattori di cui sopra siano presi in considerazione.
Oltre alla robustezza e all'efficienza dei protocolli di differenziazione cardiaca, la maturazione e la specifica del tipo di cellula (ad esempio, i tipi di cellule atriale e ventricolare) rappresentano anche una grande sfida per l'utilizzo di iPSC-CMs per modellare le malattie cardiache. Negli ultimi anni, sono state riportate molte strategie di maturazione promettenti, tra cui stimolazione elettrica, stretch meccanico e rigidità del substrato23. Tuttavia, la prolungata cultura in vitro degli iPSC-CMs continua ad essere un approccio semplice e pratico per generare cardiomiociti simili a adulti24,25.
Coerentemente con altri rapporti pubblicati12, iPSC-CMs generati da questo protocollo di differenziazione in vitro mostrano robusta espressione di MLC2V millenario specifico e livelli molto più bassi di MLC2A al giorno 90 (Figura 2A, B). Mentre le CM fetali contengono sia gli isoformi MLC2A che MLC2V, le CM ventricolari adulte contengono solo MLC2V. Questo interruttore nella prevalenza isoforme MLC si verifica durante la fase neooatatale26.
Cardiomiociti generati attraverso questo protocollo esprimere marcatore specifico ventricolare, come MLC2V, che aumenta progressivamente in abbondanza come le cellule sono mantenute incolturapiù a lungo ( Figura 2A,B). Ciò indica che una prolungata coltura in vitro migliora la maturazione delle CM che sembrano essere impegnate nel fenotipo ventricolare.
Il tempo culturale influisce anche notevolmente sulla maturazione della maturazione di 2 o più ca2, 25. Rapporti precedenti hanno descritto che dopo 20 giorni di induzione differenziazione, non ci sono stati cambiamenti importanti nei transitori calc Ca2 s man mano che le cellule sono cresciute25. Tuttavia, i cardiomiociti generati dal protocollo qui descritto mostrano cambiamenti progressivi nell'ampiezza di Ca2 e nel decadimento di Ca2 o nei tre punti temporali valutati (30, 60 e 90 giorni dopo l'induzione della differenziazione cardiaca) (Figura 3A-C). È interessante notare che questi dati mostrano che i parametri transitori di Ca2 o più, come l'ampiezza di Ca2 e il decadimento di Ca2, misurati nel giorno 90 iPSC-CMs erano simili a quelli misurati nei cardiomiociti adulti isolati di ratto (ARCM). Inoltre, gli iPSC-CM di 90 giorni sono stati anche in grado di seguire varie stimolazioni elettriche che vanno da 0,5 Hz a 3 Hz in modo coerente, simili agli ARCM (Figura 4B). Nel lavoro futuro, sarebbe interessante vedere come un tempo ancora più lungo nella coltura influenzi le caratteristiche funzionali di questi iPSC-CMs rispetto agli ARCM.
Inoltre, poiché la segnalazione del recettore z-adrenergico mostra un modello maturazionale distinto dipendente dal tempo dopo l'induzione cardiaca27, è stato testato l'effetto dell'isoproterenol su Ca2o transitorio in iPSC-CMs generato attraverso questo protocollo. La stimolazione con isoproterenol ha portato a una risposta lusitropica positiva nel giorno 90 iPSC-CMs, simile a quanto osservato negli ARCM (Figura 3D-F).
Le valutazioni funzionali degli iPSC-CM eseguite in questo studio presentano alcune differenze e limitazioni rispetto alle Malattie adulte isolate. Le CM adulte hanno sarcomeres ben sviluppati e ben organizzati. Ciò consente misurazioni di contrattilità attraverso il rilevamento del movimento sarcomero. Poiché nessuno dei protocolli attuali genera iPSC-CMs completamente maturati e simili a quelli per adulti, le misurazioni della contrattilità tramite il rilevamento dei sarcomeri non sono fattibili. Mentre è possibile rilevare il movimento dei bordi delle cellule quando la cellula si contrae, è significativamente più difficile tenere traccia di tali movimenti in modo preciso in iPSC-CMs. Al momento, sono necessari progressi tecnologici per consentire valutazioni accurate della contrattilità in queste cellule. D'altra parte, è possibile misurare i transitori Ca2 o più di iPSC-CMs utilizzando un indicatore Ca2 o come Fura-2. A differenza dei CMs adulti, tuttavia, gli iPSC-CMs sono raggruppati e non hanno un bordo ben definito. Di conseguenza, i transitori Ca2 o più registrati di solito non rappresentano una singola cella, ma piuttosto un gruppo di celle in un'area specifica. Mentre è possibile regolare le dimensioni dell'area, registrare i transitori Ca2 è incredibilmente impegnativo. È fondamentale che quando le CM sono placcate sui copricoperture, la densità è tale da ottenere una distribuzione omogenea dei motrici (Video 3), che consente di trovare costantemente aree con cellule. Se le celle non sono distribuite come un monostrato sul coverslip (Video 4), ci saranno aree senza celle, e se il coverlcio viene esaminato specificamente per le aree con celle che battono le celle per eseguire le misurazioni, questo può portare a una "distorsione di selezione". Invece di selezionare un'area specifica di celle che battono, si consiglia di raccogliere dati da più aree in tutto il coverslip, il che è possibile solo quando le cellule sono distribuite come un monostrato omogeneo. Le misurazioni da 100 aree così diverse, che richiedono circa 10 min, sono sufficienti per fornire proprietà funzionali affidabili delle cellule. Infine, come illustrato nella Figura 5,gli iPSC-CMs hanno bisogno di tempo per adattarsi alle condizioni di misurazione. Per misurazioni affidabili, si raccomanda di stabilizzare le cellule alle condizioni di misurazione per almeno 3 min.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Premio Mount Sinai KL2 Scholars per lo sviluppo della carriera di ricerca clinica e traslazionale KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 e AHA 18TPA34170460 (C.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
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